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MARCAJE E HIBRIDACIÓN DE MICROARRAYS de expresión
1. MARCAJE INDIRECTO de cDNA
PRIMER DÍA
Síntesis de cDNA a partir de RNA total (dos muestras en paralelo)
Síntesis de cDNA. Trabajar con guantes y material autoclavado 40’ con el
programa de RNA.
IMPORTANTE tener en cuenta que se llevarán al menos dos muestras en
paralelo (correspondientes a las dos poblaciones de RNA que se quieren
comparar). Una se marcará con Cy3 (Verde) y otra con Cy5 (Rojo).
1.
Partir de 20 μg RNA TOTAL de la mayor calidad posible ([ ] ≥1,2 μg/μL).
2.
Ajustar a un volumen total de 16,5 μL con H2O.
3.
Añadir 1 μL de Anchored Oligo (dT)20.
4.
Incubar a 70 ºC / 5 min en el termociclador previamente atemperado e
inmediatamente a hielo (>1 min).
5.
Centrifugar brevemente para llevar al fondo del tubo, y poner en hielo.
6.
Añadir (sobre hielo) 12,5 μL de una mezcla que contenga por reacción:
Componentes
5x tampón 1ª hebra
(descong a RT)*
0,1 M DTT
(descong a RT)*
Mix dNTP + aadUTP (x15)
Ribonuclease
inhibitor (10 U/μL)
SS III RT (200
U/μL)
TOTAL

Vol 1rx
1 cristal
2 cristal
3 cristal
4 cristal
5 cristal
6 cristal
6,0 μL
12,6 μL
25,2 μL
37,8 μL
50,4 μL
63 μL
75,6 μL
1,5 μL
3,15 μL
6,30 μL
9,45 μL
12,6 μL
15,75 μL
18,9 μL
2,0 μL
4,2 μL
8,4 μL
12,6 μL
16,8 μL
21 μL
25,2 μL
1,0 μL
2,1 μL
4,2 μL
6,3 μL
8,4 μL
10,5 μL
12,6 μL
2,0 μL
4,2 μL
8,4 μL
12,6 μL
16,8 μL
21 μL
25,2 μL
12,5 μL
Con la SuperScript III RT viene también el 5x tampón de 1ª hebra y el DTT
7.
Agitar, dar un pulso e incubar a 50 ºC / O/N en horno de hibridación. (Vf =
30 μL).
1
SEGUNDO DÍA
Sacar las columnas MinElute de la nevera
Preparación de soluciones: (muy importante concentraciones y pHs)
- NaOH 1M: 0,4 g en 10 mL
- HCl 1M : 1 mL HCl conc. + 11,08 mL H20
Síntesis de AA-cDNA (continuación)
Purificación de AA-cDNA
8.
Inactivar por calor a 70 ºC / 10 min en el termociclador previamente
atemperado. Centrifugar brevemente.
9.
Para hidrolizar el RNA añadir:
10 μL NaOH 1 M
10 μL EDTA 0,5 M pH 8,0
10.
Mezclar suavemente e incubar a 70 ºC / 15 min en el termociclador
previamente atemperado. Centrifugar brevemente.
11.
Añadir 10 μL de HCl 1 M para neutralizar el pH (Vfinal = 60 μL).
Purificación del AA-cDNA
Para eliminar los AA-dUTP no incorporados y los dNTPs libres (utilizamos el kit
MinElute PCR Purification de Qiagen. IMPORTANTE: Usar Phosphate Wash y
Phosphate Elution preparados por nosotros y no los reactivos del kit).
1.
Mezclar la reacción de cDNA con 300 μL (5V) de tampón PB y transferir a
la columna (OJO, las columnas se guardan a 4ºC, pero se han de usar a
Tª ambiente).
2.
Centrifugar 1 min @ 13.000 rpm. Vaciar el tubo de recogida.
3.
Añadir 730 μL de Phosphate Wash y centrifugar 1 min @ 13.000 rpm.
Vaciar el tubo de recogida.
4.
Repetir el paso anterior, con otros 730 μL de Phosphate Wash
5.
IMPORTANTE: Repetir centrifugación para eliminar restos de Phosphate
Wash.
6.
Transferir la columna a microtubo de 1,5 ml y eluir con 30 μL de
Phosphate Elution (preparado por nosotros) sobre la membrana.
7.
Incubar 2 min, centrifugar 1 min RT @ 13000 rpm para eluir DNA.
8.
Repetir el paso de elución con otros 30 μl y 40 μL de Phosphate Elution.
(Al final recuperar con la pipeta la gota que queda pegada a la pared de la
columna y ponerla otra vez sobre la membrana, darle otro spin de 30”).
9.
Comprobar eficiencia de la síntesis en el NanoDrop (Programa Nucleic
Acids, ssDNA constant 37). Se obtienen de 1 a 3 g de cDNA.
2
10.
Concentrar los 100 μL en Speed-Vac hasta secar.
11.
Guardar a -20 ºC hasta su uso al día siguiente.
TERCER DÍA
Preparación de soluciones:
Na2C03 1M pH=9: 2,65 g en 15 mL H20 y ajustar a pH 9 con HCl conc.
Enrasar a 25 mL.
NaOAc 100mM pH 5,2, a partir del stock NaOAc 3M pH 5,2 (dilución 1/30).
Acoplamiento de los fluoróforos al AA-cDNA
Sacar las columnas MinElute de la nevera
Purificación de los Cys-cDNA
Prehibridación e Hibridación
Acoplamiento de los fluoróforos al AA-cDNA
MUY IMPORTANTE: desde el momento que se empieza a trabajar con los
fluoróforos, se tendrá especial cuidado en preservarlos de la luz directa.
Cy3 (verde) (Tapón naranja, rojo al resuspender)
Cy5 (rojo) (Tapón violeta, azul al resuspender)
1.
Resuspender el AA-cDNA en 7,5 l de Na2C03 0,13 M y añadir una
alícuota de Cys (2,5 l). El Na2C03 0,13M se prepara a partir del stock 1M
pH 9. El Vfinal de la reacción serán 10 ul; el volumen de la reaccion
puede ser otro, lo que sí es importante es que la concentración final del
Na2C03 sea 0,1 M. Se ha de marcar al menos 1g de cDNA, aunque
mejor si tenemos 1,5-3 g.
2.
Incubar 1h 30min – 2h en oscuridad a Tª ambiente (25 ºC). Agitar de vez
en cuando.
Purificación de Cy’s-cDNA
Utilizar ahora los reactivos del KIT.
1.
Añadir 35 μL de NaOAc 100 mM pH 5,2 a las reacciones de marcaje para
neutralizar. Mezclar.
2.
Añadir 250 μL de tampón PB. Mezclar bien.
3.
Transferir a columna. Centrifugar 1min @ 13000 rpm. Vaciar el tubo de
recogida.
4.
Lavar la columna 3 veces con 700, 400 y 300 ul de tampón PE.
Centrifugar 1min @ 13000 rpm y descartar tampón.
5.
IMPORTANTE: Repetir centrifugación para eliminar restos de PE.
3
6.
Transferir columna a microtubo de 1,5 ml. Eluir con 30 μL de tampón EB
diluido 1/5.
7.
Incubar 2 min, centrifugar 1min RT @ 13000 rpm para eluir DNA.
8.
Repetir el paso de elución con otros 30 μL y 40 μL de tampón EB dil 1/5.
9.
Incubar 2 min, centrifugar 1min RT @ 13000 rpm para eluir DNA. (Al final
recuperar con la pipeta la gota que queda pegada a la pared de la
columna y ponerla otra vez sobre la membrana, darle otro spin de 1 min)
10.
Comprobar eficiencia y calidad del marcaje en NanoDrop (Programa
Microarrays, ssDNA constant 37). Se pueden obtener de 100 a 400
pmoles. Calcular el valor FOI.
11.
Mezclar en un tubo un número igual de picomoles de la muestra marcada
con Cy3 y de la marcada con Cy5. Yo utilizo como mínimo 100 pmoles de
cada muestra para los microarrays de levadura de 6k.
12.
Secar en speed-vac hasta dejar aproximadamente 5 μL, máx 8,4 l. Las
muestras se pueden guardar varias semanas a -20ºC protegidas de la luz
o bien proseguir con la hibridación.
2. HIBRIDACIÓN de MICROARRAYS
IMPORTANTE:

Evitar el contacto con el polvo (superficies y guantes sin polvo).

Intentar trabajar en penumbra y recubrir con papel de aluminio los
contenedores donde se encuentran las muestras marcadas.

Preparar soluciones en el momento de usarlas, utilizando 20x SSC y 10%
SDS comerciales filtrados (SIGMA, INVITROGEN…).

Si la hibridación es no homóloga, la proporción de formamida en la solución
de hibridación ha ser menor, en cuyo caso habría que concentrar menos la
muestra marcada, o completar con agua hasta el volumen de 60 μL.
Solución de Prehibridación (50 mL por cada cristal a hibridar):
Añadir primero
41,5 mL H2O
3x SSC
7,5 mL 20x SSC
0,1% SDS
0,5 mL 10% SDS
0,1 mg/mL BSA
0,5 mL 10 mg/mL BSA
4
Solución de Hibridación
Después de valorar el marcaje, mezclar el mismo número de picomoles de las dos
muestras a comparar marcadas con Cy3 y Cy5, y secar en concentrador (speed-vac)
hasta dejar un volumen máximo de 8,4 μL.
Para un chip de 60x24mm, preparar 60 μL (Cy3 + Cy5):
2.1.
Concentración Final:
60 μL
Concentración en stock
cDNA-Cys (tras speedvac)
8,4 μL
50% Formamida
30 μL
Formamida
5x SSC
15 μL
20x SSC
0,1% SDS
0,6 μL
10% SDS
0,1 mg/mL DNA salmón
6 μL
1 mg/mL DNA salmón
Agua
c.s.p.
Prehibridación
IMPORTANTE no dejar que el cristal se seque entre los lavados. Preparar
todas las soluciones en los sucesivos contenedores antes de empezar. Trabajar cerca
de la centrífuga para secar lo más rápidamente posible.
1.
Calentar la Solución de Prehibridación en baño a 42 ºC en tubo cónico
50 mL. Usar un tubo para cada cristal.
2.
Introducir el microarray en la Solución de Prehibridación. Incubar a 42 ºC
durante 60 min. Preparar en este intervalo las SONDAS.
PREPARACIÓN DE LAS SONDAS
a) Ajustar el volumen de agua según la cantidad de muestra obtenida en
el speed-vac y mezclar con el volumen de solución de hibridación
para tener los pmoles totales en 60 μL de volumen final. En cualquier
caso, hay que utilizar la misma cantidad de marca de las dos
muestras.
b) Incubar las sondas a 95 ºC / 2 min en el termociclador previamente
atemperado.
c) Dejar a RT al menos 5 minutos y centrifugar para llevar al fondo del
tubo.
3.
Transferir el microarray a contenedor portaobjetos con H2O milliQ y lavar
durante 1’ a temperatura ambiente. Repetir este lavado con agua milliQ.
5
4.
Hacer un lavado de 20” en isopropanol e inmediatamente secar el cristal
centrifugando en tubo cónico de 50 mL, a 1.300 rpm / 10 min @ RT.
2.2.
Hibridación (EN OSCURIDAD)
1.
Añadir 40 µL H2O milliQ en las dos cavidades de la cámara de hibridación
(mantiene la humedad dentro de la misma). En la cámara doble ponemos
10 µL agua en las cuatro esquinas y en tres puntos del canal central.
2.
Poner la sonda sobre el cubre formando una línea central, volver boca
abajo el cubre con cuidado y colocar sobre el microarray. También se
puede añadir la muestra en una línea central sobre el microarray
procurando no tocar la superficie con la punta de la pipeta (esta es la
mejor opción). Si usamos cubres biselados, la muestra se carga por
capilaridad, despues de colocar el cubre sobre el cristal.
3.
Alinear bien la tapa de la cámara antes de cerrarla bien con los tornillos.
4.
Incubar en oscuridad 16-20h (O/N) a 42ºC en un baño de agua.
6
CUARTO DÍA
2.3.
Lavados
IMPORTANTE no dejar que el cristal se seque entre los lavados, preparar
todas las soluciones en los contenedores antes de empezar, y trabajar cerca de la
centrífuga. La solución de lavado 1 se utiliza a la temperatura a la que se ha hibridado
(42ºC); si es posible incubar el contenedor a la misma temperatura. (Yo caliento la
solución 1 a 50 ºC y al añadirla a la cubeta se enfría, controlo ahí la Tª y lavo el chip
cuando está a aprox 42ºC). Calcular unos 300 mL de solución para cada lavado.
1.
Sumergir el cristal en Sol. 1 (2X SSC - 0,1% SDS) a 42 ºC hasta soltar el
cubre.
2.
Pasar a otro contenedor con Sol. 1 (2X SSC - 0,1 % SDS) a 42 ºC / 5 min.
3.
Sol. 2 (0,1X SSC - 0,1 % SDS) a 25 ºC / 10 min (para chips de expresión
normalmente repito este lavado).
4.
Sol. 3 (0,1X SSC), a 25 ºC / 1 min. Repetir 6 veces.
5.
Enjuagarlo con Sol. 4 (0,01X SSC), un instante (~ 5 seg).
6.
Secar inmediatamente centrifugando dentro de un tubo cónico de 50 mL,
a 1.300 rpm / 10 min @ RT.
7.
Guardar el microarray en el Corning 25 Slide Box (en su defecto en tubo
cónico) (protegiéndolo de la luz hasta que esté listo para escanear).
2.4.
Escaneado. Enchufar el escáner 15’ antes de usarlo para que se equilibren los
láseres. Abrir el programa GenePix con el escáner enchufado y vacío, ya que
hace un calibrado previo, sin chip. Yo abro GenePix en el momento que pongo
los chips a secar en la centrífuga.
7
LECTURA MEDIANTE ESPECTROMETRÍA
A) CUANTIFICACIÓN DE cDNA
Determinación con Nanodrop. Programa Nucleic Acids, Sample Type ssDNA (constant
33), o bien en Other poner como factor de conversión 37, ya que es lo que indican
algunos protocolos, para el cDNA. El rendimiento es variable, entre 1000 y 3000 ng
totales (tener en cuenta que el eluido está en 100 ul). Para seguir con el marcaje
conviene partir de al menos 1500 ng de cDNA.
B) CUANTIFICACIÓN DE cDNA-Cys
Determinación con Nanodrop. Programa Microarrays, Sample Type Other, Constant 37,
y nos dará la concentración de cDNA y nos medirá los picomoles de Cy3 y Cy5.
Calcular la frecuencia de incorporación (FOI):
Nucleótidos incorporados (pmoles) para Cy3®= A550 x Vol (μL) / 0,15
Nucleótidos incorporados (pmoles) para Cy5®= A650 x Vol (μL) / 0,25
FOI = [Nucleotidos incorporados x 324,5] / [A260 x 37 x Vol (μL)]
8
REACTIVOS

Aminoallyl-dUTP AA-dUTP (5-[3-Aminoallyl]-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate)
[2,5 umoles, 50 ul, 50 mM] (Fermentas, Ref. #R1101).

100 mM dNTP Set [4 x 25 μmol] (Invitrogen, Ref. 10297-018)

Anchored Oligo (dT)20 Primer [50 μg≡2,5 μg/μL] (Invitrogen, Ref. 12577-011)

SuperscriptTM III Reverse Transcriptase (200 u/μL) (Invitrogen, 10.000 u, Ref.
18080-044)

Ribonuclease Inhibitor Cloned [1.000 u] (Invitrogen, Ref. 15518-012)

Cy3 mono-Reactive Dye (Amersham, Ref. PA23001)

Cy5 mono-Reactive Dye (Amersham, Ref. PA25001)

MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. 28006, 250 reacciones; o Cat.
28004, 50 reacciones).

10% SDS Solution (100mL, 0,2 m filtered) (SIGMA, Ref. L4522)

SSC buffer 20x concentrate (1L, 0,2 m filtered) (SIGMA, Ref. S6639-1L)
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y TAMPONES

10 mL Tampón Fosfato potásico 1 M pH 8,5 (stock para preparar los
tampones Phosphate Wash y Phosphate Elution)
1M K2HPO4 (ref. 60; PM = 228,23 g/mol) (25,10 g + 110 mL agua): 9,5 mL
1M KH2PO4 (ref. 39; PM = 136,09 g/mol) (2,72 g + 20 mL agua): 0,5 mL
Autoclavar

100 mL Tampón Phosphate Wash (5 mM KPO4, pH 8,5; 80% EtOH) en botella
estéril:

1 M KPO4 pH 8.5
0,5 mL
Agua milliQ
19,5 mL
EtOH absoluto
80 mL
10 mL tampón Phosphate Elution (4 mM KPO4, pH 8,5) en botella estéril:
1 M KPO4 pH 8,5
40 µL
Agua milliQ
10 mL
9

Fluoróforos Cy3® y Cy5®
IMPORTANTE: Cy3® y Cy5® son ésteres hidrolizables en solución acuosa;
se deben preservar de la humedad puesto que su hidrólisis disminuiría
considerablemente la eficiencia del marcaje. Además se fotoblanquean y
por ello también se deben preservar al máximo de la exposición a la luz
(procurar trabajar en oscuridad). El envase contiene 5 viales de cada
fluoróforo (Amersham Ref. PA23001 y PA25001) que se guardan a 4º C.
Resuspender cada uno de los fluoróforos en 45 μL de DMSO, distribuir en
alícuotas de 2,7 μL, guardar a 4 ºC en oscuridad en contenedor con
silicagel.

Mezcla de marcaje (x15) con un ratio 2:1 de AA-dUTP:dTTP
Vfinal
80 μL
Stock
Conc. Final
dATP
6 μL
100 mM
7,5 mM
dCTP
6 μL
100 mM
7,5 mM
dGTP
6 μL
100 mM
7,5 mM
dTTP
2 μL
100 mM
2,5 mM
AA-dUTP
8 μL
50 mM
5,0 mM
H2O
52 μL
De esta mezcla hacer alícuotas de 4,5 μL y guardar a -20 ºC. (Se usan 4,2
μL por cristal, daría para 16 chips).
Preparar en el momento:

NaOH 1M (0,4g/ 10 mL) (Ref. 54, PM = 40 g/mol) (yo no lo preparo en el
momento, pero la renuevo periódicamente)

HCl 1M (1 mL 12,09 N +11,08 mL H2O) (yo no lo preparo em el momento)

Diluir el EB (Tampón MiniElute Qiagen) (10 mM Tris-HCl) 5 veces.
100 μL EB + 400 μL de agua milliQ

Tampón Carbonato Sódico 1 M pH 9.
Disolver 5,3 g de Na2CO3 en 40 mL de agua milliQ y ajustar el pH a 9,0 con
HCl. Llevar a un volumen de 50 mL con agua milliQ. (Yo lo guardo en
alícuotas congelado).

Preparar NaOAc 100 mM pH 5,2 a partir del stock NaOAc 3 M (dilución 1:30).
10
SOLUCIONES PARA EL LAVADO DE LOS CRISTALES
Calcular unos 300 mL de solución para cada lavado.
Sol. 1. 2X SSC – 0,1% SDS (600 mL, atemperado a 42 ºC)
530 mL agua milliQ
60 mL 20X SSC
6 mL 10% SDS
Sol. 2. 0,1X SSC – 0,1% SDS (600 mL)
295,2 mL agua milliQ (590,4 ml)
1,5 mL 20X SSC (3 ml)
3 mL 10% SDS (6 ml)
Sol. 3. 0,1X SSC (2 x 900 mL)
895,5 mL agua milliQ
4,5 mL 20X SSC
Sol. 4. 0,01X SSC (300 mL)
299,85 mL agua milliQ
0,15 mL 20X SSC
Los microarrays de RNA suelen salir más sucios que los de DNA genómico, por eso
hacemos dos lavados con la Solución 2.
11
Valoración del RNA previa al marcaje (Servicio Chips SCSIE, aprox 25 € / 12 muestras)
(OPCIONAL)
ExperionTM RNA StdSens Analisis Kit
Specification
Kit
Total RNA
mRNA
Number of wells
12
Sample volume
1 μl
Total run time
~30 min
Quantitative range
25–500 ng/μl
25–250 ng/μl
Qualitative range
5–500 ng/μl
25–250 ng/μl
Maximum sample buffer strength
TE
TE
El aparato valora la concentración de RNA y además la relación entre el RNA 28S/18S. La
teoría dice que esta relación ha de ser como mínimo de 1,8, si un RNA está en buen estado, o
casi intacto. Pepe (del Servicio de Chips del SCSIE de la UV) dice que muestras con valores de
1,4-1,5 se pueden intentar marcar, aunque ellos normalmente obtienen ratios entre 1,6 y 1,95
más o menos.
12