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Enzimología 2010
Facultad de Ciencias
EJERCICIOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
1. Se quiere medir la actividad de la enzima malato deshidrogenasa en un extracto
bacteriano.
tiempo (s) absorbancia
oxalacetato + NADH L-malato + NAD+
Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH 7.6, oxalacetato 0.6
0
0.635
mM y NADH 0.1 mM en un volumen total de 3 mL. Se dispara la
20
0.584
reacción agregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este extracto
40
0.536
contiene 32 mg de proteína/mL. Se observa la disminución de
60
0.484
absorbancia a 340 nm debido a la desaparición de NADH (ε =
80
0.433
6.22 mM-1 cm-1).
100
0.385
a- ¿Cuál es la velocidad de reacción?
b- Calcule la actividad de la enzima por mL de extracto.
120
0.356
c- Calcule la actividad específica de la enzima.
140
0.335
160
0.324
2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera
a la sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad siguiendo la
desaparición de NADH acoplándola a la malato dehidrogenasa:
TGO
aspartato + α-cetoglutarato 
 glutamato + oxalaceto
MDH
oxalaceto  NADH  malato  NAD
En una mexcla de reacción se coloca un exceso de aspartato (100 veces el Km), 0.1 mL de
suero de un paciente, 0.3 µmoles de NADH y exceso de malato deshidrogenasa para un
volumen de 0.9 mL. La reacción se inicia agregando un exceso de α–cetoglutarato
contenido en 0.1 mL. Luego de un período de latencia, se observa un decrecimiento en la
absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de absorbancia por minuto siendo la cubeta de
reacción de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente.
3. Se quiere medir actividad β-galactosidasa en un extracto bacteriano que contiene 5 mg de
proteína por mL de extracto. Para ello, se incuban 0.25 mL de extracto en amortiguador con
3 x 10-3 M de p-nitrofenil β-galactósido en un volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos, se
toman alícuotas de 0.1 mL y se agregan a 2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide
tiempo A400
la formación de p-nitrofenol a 400 nm, siendo ε = 18300 M-1 cm-1 en NaOH
90 s 0.068
0.1 M.
180
s 0.135
a- ¿Cuál es la actividad de la enzima por mL de extracto?
270 s 0.202
b- ¿Cuál es la actividad específica del extracto?
360 s 0.270
c- ¿Qué controles deben realizarse?
4. Un extracto libre de células de Escherichia coli contiene 24 mg de proteína por mililitro.
Veinte microlitros de este extracto en un volumen estándar de incubación de 0,1 ml catalizó
la incorporación de glucosa-14C a partir de glucosa-1-fosfato-14C hacia glucógeno a una
velocidad de 1,6 nmol/min. Calcular la velocidad de la reacción en términos de:
a. µmoles min-1
b. µmoles L-1 min-1
c. µmoles min-1 mg de proteína-1
d. unidades mL-1
e. unidades mg de proteína-1
5. Un extracto crudo libre de células contenía 20 mg de proteína por mililitro. Diez microlitros
de este extracto en un volumen de reacción de 0.5 ml catalizó la formación de 30 nmoles de
producto en 1 min bajo condiciones óptimas de ensayo (pH óptimo y condiciones saturantes
de sustratos, coenzimas y activadores).
1
a. Exprese velocidad en términos de nmoles mL-1 min-1, nmoles L-1 min-1, µmoles mL-1 min-1,
M min-1.
b. ¿Cuál sería el valor de la velocidad si los mismos 10 µL de extracto fueran ensayados en
un volumen total de 1 mL?
c. ¿Cuál es la concentración de la enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en
términos de unidades mL-1)?
d. ¿Cuál es la actividad específica de la preparación?
6. Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 42 unidades/mg de proteína
y contiene 12 mg de proteína por mililitro. Calcule la velocidad inicial de la reacción obtenida
en una mezcla de reacción estándar conteniendo:
a. 20 µL del preparado enzimático.
b. 5 µL del preparado enzimático.
7. Se ha realizado la purificación de una enzima. En la tabla se presentan los datos
experimentales obtenidos. Complete la tabla.
Proteínas
Actividad enzimática
Etapa
V
(mL)
Conc.
(mg/mL)
masa
total
(mg)
Actividad
(U*/mL)
Extracto
crudo
1000
12
5
Sulfato de
amonio
30-50%
250
3
8
DEAESephadex
25
2.5
70
Gel
Filtración
30
1
50
Actividad
específ.
(U/mg)
Actividad
total
(U)
Rendimiento
(%)
Factor
de purificación
* U: unidades de actividad enzimática, μmoles de producto formado/min
a- ¿Podemos afirmar que la enzima está pura?
b- ¿En qué etapa se logra la mayor purificación?
8. Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades de una enzima. Estime la
concentración intracelular de la enzima asumiendo que un gramo de músculo fresco
contiene 0.8 mL de agua intracelular.
a. Sabiendo que el número de recambio de la enzima es de 6 x 104 min-1.
b. Sabiendo que la actividad específica de la enzima pura es de 500 unidades/mg y su
peso molecular es 120.000.
9. Quince microlitros de una preparación enzimática catalizaron la producción de 0.52
µmoles de producto en 1 min bajo condiciones óptimas de ensayo.
a. ¿Qué cantidad de producto se producirá en 1 min por 150 µl de la preparación bajo las
mismas condiciones de reacción?
b. ¿Cuánto tiempo demorarán 150 µl de la preparación para producir 0.52 µmoles de
producto bajo las mismas condiciones de ensayo?
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10. Para el siguiente esquema:
k1
k2
E + S
ES  E + P
k-1
a- Derive la ecuación de Michaelis-Menten asumiendo:
1- equilibrio rápido entre el complejo enzima-sustrato y la enzima y el sustrato
libres.
2- la hipótesis del estado estacionario para el complejo enzima-sustrato.
b- ¿Qué se asumió respecto a la velocidad, respecto a la concentración de enzima y
respecto a la concentración de sustrato?
c- ¿Cuál es el significado de los parámetros KS, KM, kcat y kcat/KM?
d- Si k1 = 1 x 107 M-1.s-1, k-1 = 1 x 102 s-1 y k2 = 3 x 102 s-1, calcular KS, KM, kcat y kcat/KM.
e- Puede ser k2 mucho mayor que k1?
11. ¿Cómo varía la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente al aumentar la
concentración de sustrato? ¿Y al aumentar la concentración de enzima?
12. Para una enzima michaeliana, ¿cuánto debe aumentar la concentración de sustrato para
que la velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? Y si la enzima presenta
cooperatividad positiva?
13. La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa con un KM de 0.13 mM.
glucosa + ATP  glucosa 6-fosfato + ADP.
a. ¿Qué fracción de Vmax se observaría cuando la concentración de glucosa corresponde al
valor fisiológico de 5 mM?
b. Cuando la glucosa se une a la enzima, ésta sufre un cambio conformacional. Recién
entonces puede unirse el ATP a la enzima. ¿Qué sentido tiene este fenómeno?
14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las afirmaciones son
verdaderas o falsas.
a) Una enzima participa en la reacción alterando la constante de equilibrio de la reacción, sin
alterar la barrera de activación (Ea).
b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por la enzima.
c) Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.
d) El número de recambio (kcat) es el número de moles de sustrato transformado por minuto
por mol de centro activo.
e) La catálisis puede ser explicada por una unión tipo llave y cerradura entre el sustrato y la
enzima.
f) La velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente es independiente de la
concentración de sustrato.
g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentración de enzima.
h) El KM equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la
máxima.
i) El KM varía con la concentración de enzima.
15. Existen diferentes formas de linealizar la ecuación de Michaelis-Menten:
1/v en función de 1/[S]
(Lineweaver-Burk)
v/[S] en función de v
(Hanes)
[S]/v en función de [S]
(Hanes-Woolf)
v en función de v/[S]
(Eadie-Hofstee)
a.- Reordenar la ecuación de Michaelis-Menten para las diferentes linealizaciones.
b- Cuál es el significado de la pendiente, la intersección con el eje de las y, y de la
intersección con el eje de las x para los diferentes gráficos?
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16. Durante daño hepático severo se libera a la
circulación una enzima E1. Luego de realizar ejercicio
fuerte, una enzima muscular E2, que cataliza la
misma reacción que E1, se libera a la circulación
sanguínea. E1 y E2 se pueden diferenciar fácilmente
pues los valores de KM son diferentes (KM para E2 es
2 x 10-5 M). El análisis sanguíneo de un paciente
muestra los resultados que se muestran en la tabla.
¿Podría decir si el paciente sufre de una enfermedad
hepática o simplemente ha realizado mucho ejercicio?
17. La enzima -lactamasa hidroliza la
penicilina dejándola inactiva. La cantidad de
penicilina hidrolizada en 1 minuto fue medida en
función de la concentración de penicilina, en
una solución de 10 mL de volumen final,
conteniendo 10-9 g de -lactamasa pura (29.6
kDa).
Determinar los parámetros cinéticos.
Calcular el número de recambio.
¿Cuánto tiempo dura un ciclo catalítico?
[S] (M)
5.0 x 10-5
7.0 x 10-5
1.0 x 10-4
1.5 x 10-4
2.0 x 10-4
3.0 x 10-4
6.0 x 10-4
Penicilina (M)
0.1 x 10-5
0.3 x 10-5
0.5 x 10-5
1.0 x 10-5
3.0 x 10-5
5.0 x 10-5
v (mol/mL/min)
43
57
75
100
120
150
200
Moles hidrolizados
0.11 x 10-9
0.25 x 10-9
0.34 x 10-9
0.45 x 10-9
0.58 x 10-9
0.61 x 10-9
18. La enzima fumarasa cataliza la hidratación del fumarato para dar malato. Esta reacción
tiene un ΔGº’ de –3.8 kJ/mol. Para la enzima de corazón de chancho, se han reportado
valores, para la reacción directa, de KM = 1.7 mM y VMAX = 0.25 mM-1 s-1; y, para la reacción
reversa, de KM = 3.8 mM y VMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de una bacteria,
se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX = 0.024 mM-1 s-1 para la reacción directa, y
KM = 1.2 mM y VMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reacción reversa. Comente en la plausibilidad
de estos reportes.
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