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El DNA para diagnóstico de enfermedades
( Publicado en "Energía para vivir", Bruno Günther y Enrique Morgado,
1998, Editorial Universitaria )
En los últimos años, el enorme progreso logrado en el conocimiento de la inmunología y en
las tecnologías de laboratorio para detectar y poner en evidencia reacciones entre
antígenos y anticuerpos, ha ayudado mucho en el diagnóstico de las enfermedades. Más
aún, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales, que ha permitido obtener en forma
continua anticuerpos absolutamente puros, se han reforzado estos avances. Con todo, una
nueva etapa se está iniciando, utilizando las tecnologías de Ia manipulación genética.
Nada puede identificar mejor a un microorganismo o a un virus, que el conocimiento de su
material genético. De igual modo, más adecuado es identificar al gen anómalo, que
identificar a la proteína anómala causante de una enfermedad. Esto no sólo es válido tanto
para las enfermedades infecciosas y las genéticas, sino también para eI cáncer y las
enfermedades por autoinmunidad. Es en este sentido que el secuenciamiento del DNA,
está comenzando a ser una valiosa herramienta para el diagnóstico de diversas
enfermedades.
Las dos hebras del DNA, pueden asemejarse a un cierre eclair, que puede abrirse por
medio de una reacción bioquímica o por acción de la temperatura, quedando separado en
dos hebras independientes. En esta etapa, se agrega un DNA sintético y complementario
conocido como sonda, que previamente ha sido marcado. Si existe Ia hebra
complementaria, se van a unir por hibridación, para formar de nuevo la doble hebra, pero
esta vez una de ellas va a estar marcada (figura 1).
Con este procedimiento se pueden detectar ínfimas cantidades de DNA de células o
microorganismos provenientes de una pequeña cantidad de muestra del paciente, como
saliva, células, suero, líquido cefalorraquideo y otras. Usando técnicas de microscopio de
fluorescencia, se pueden detectar hasta unos pocos virus en el interior de una célula si se
cuenta con una sonda marcada con una sublámina fluorescente. La técnica es menos
sencilla, cuando se usa una sonda radioactiva, pero aún así se pueden determinar
cantidades tan pequeñas como 10-13 gramos de ácido nucleico. Hay que considerar que
los métodos convencionales más sensibles (antígeno anticuerpo) logran determinar hasta
10-9.
El DNA en el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas
Tal vez donde más se preste esta metodología es en la identificación de microorganismos.
Con ella incluso se pueden discriminar diferentes cepas que por otros métodos no ha sido
posible identificar. Así, por ejemplo, la empresa biotecnológica Genética Integrada de USA,
ha podido identificar 350 cepas diferentes de salmonellas.
El método es también muy sensible y especifico para detectar enfermedades virales. El
Laboratorio de investigación Bethesda de USA, ya está comercializando un kit para
detectar el virus de la hepatitis B. El DNA sintético está formado por una secuencia de
3200 bases el que es complementario con el DNA del virus. En ese kit, el DNA marcado
con un radioisótopo, se pone en contacto, en un filtro, con el DNA con sus hebras
separadas provenientes de la muestra del paciente. Luego, el filtro se lava para remover el
material radioactivo no unido y se determina el DNA hibridizado, Ia presencia de
radioactividad en el filtro indica Ia presencia del virus. Este kit determina cantidades tan
pequeñas como 6 millones de virus por mililitro de sangre. Normalmente en una hepatitis,
se encuentran alrededor de 600 millones de virus par mililitro. El test no sólo permite
identificar el virus sino también la evolución de la enfermedad.
Ya se están comercializando otros kits semejantes, para detectar el virus del herpes, el
adenovirus, el citomegalovirus y el virus de la hepatitis B. Así mismo numerosos otros
procedimientos están en diferentes procesos de fabricación o de aceptación por la
Administración de Alimentos y Drogas de USA.
En otras enfermedades infecciosas difíciles de diagnosticar por los métodos
convencionales, el método del DNA hibridizado puede ser de gran utilidad. Así, por
ejemplo, la clamidia, una bacteria de transmisión sexual que causa esterilidad y muerte en
las mujeres, es difícil de diagnosticar, debido a que la bacteria crece sólo en cultivos
celulares. El método de hibridación solucionaría este problema permitiendo una rápida
identificación del microorganismo. Del mismo modo, la identificación de Ia bacteria que
produce la gonorrea es difícil, incluso con anticuerpos monoclonales, porque muta
demasiado rápidamente y es complicado detectar todas las cepas. Sería posible al
preparar una bacteria con los genes más estables de ella usando la sonda adecuada.
Recientemente ha sido aprobado para su comercialización por la Administración de
Alimentos y Drogas de USA, un nuevo kit para identificar la Legionella, una bacteria que
provoca varios tipos de neumonías, de las cuales la más conocida es la llamada
Enfermedad de los Legionarios. La distribución será realizada por la firma Gem-Probe y
constituye una variante de los métodos ya descritos. En lugar de hibridizar el DNA de la
bacteria o el RNA mensajero, se hibridiza el RNA ribosomal. Este es un tipo de RNA, que
normalmente se combina con proteínas celulares para formar los ribosomas (ver capitulo
1""). La mayor ventaja de esta variante es que en cada célula hay miles de copias de RNA
ribosomal, lo que aumenta la sensibilidad del método. Este método no requiere cultivo del
microorganismo y se puede hacer directamente en el esputo.
El DNA en el Diagnóstico de Enfermedades Genéticas
Durante las últimas décadas se han descrito más de 3000 diferentes enfermedades cuya
etiología se debe a la alteración de un gen funcional, el que a su vez codifica una proteína
anómala que no cumple su función bioquímica normal, ocasionando una enfermedad.
Generalmente la causa de esta anomalía es el cambio de un par de bases del DNA, lo que
significa que se codificarán uno a más aminoácidos diferentes en la estructura de la
proteína, la cual tiene un alto riesgo de no cumplir la función para la que fue diseñada y si
se trata de una enzima, puede alterar toda una vía metabólica y con ello, la funcionalidad
celular.
En algunas de esas enfermedades ya se ha logrado identificar el gen responsable siendo
posible fabricar un kit para efectuar el diagnóstico. Tal es el caso de las talasemias, donde
la proteína anómala es una cadena de la hemoglobina. La anemia que se produce en esta
enfermedad es en algunos casos fatal. Un caso similar lo constituye otra enfermedad, que
también afecta a la hemoglobina, la anemia de células falsiformes. En este caso se
produce la sustitución de un par de bases, en uno de los genes que codifican para una de
las cadenas de la hemoglobina, lo que produce el cambio de un aminoácido en la
hemoglobina, alterándose de este modo su función. Hasta hace algún tiempo la
enfermedad se diagnosticaba examinando esa irregularidad en la proteína, sin embargo,
ahora se puede detectar en forma más precoz identificando el gen alterado.
Otra enfermedad, como el Corea de Huntington, también se puede diagnosticar por el
mismo método. Esta es una enfermedad fatal del sistema nervioso central que se
caracteriza por la pérdida de la coordinación muscular y por el deterioro mental
progresivo. En los enfermos los síntomas comienzan a hacerse evidentes después de los
20 años. En la actualidad ya se puede realizar el diagnóstico precoz de esta enfermedad,
aún antes de aparecer los síntomas.
Este método está siendo usado también en otras enfermedades genéticas, como la
distrofia muscular del tipo Duchenne, que produce parálisis progresiva en adultos jóvenes.
También ha sido utilizado en el diagnóstico de la retinitis pigmentosa, una enfermedad de
la vista.
Hasta ahora, son pocas las enfermedades en las que se ha podido detectar el gen
alterado, dada Ia complejidad del genoma celular, pero no cabe duda que cada día se
podrán detectar más enfermedades, sobre todo con el uso de las enzimas de restricción y
Ia automatización de muchos de estos procesos. Ya existe una máquina automática que
permite estudiar la secuencia de bases del DNA y existe también otra que puede sintetizar
secuencias de DNA según programación previa (ver capítulo 14).
Todos estos métodos están permitiendo hacer el diagnóstico prenatal de las enfermedades
genéticas. Para esto basta tomar una muestra de líquido amniótico por punción a través
de la pared abdominal de Ia madre. Debido a la escasa cantidad de células así obtenidas,
se hace necesario cultivarlas para lograr una cantidad adecuada de DNA que permita su
identificación.
Sin embargo, se ha comenzado a utilizar un nuevo método que permite tomar una biopsia
de las vellosidades coriales de la placenta que proporciona suficiente cantidad de células.
Todas las células del cuerpo, contienen la misma cantidad de DNA, ya sea, si codifica una
proteína determinada o no. Así, en el caso de la talasemia no sólo está alterado el gen de
la célula que produce la hemoglobina, sino que ese mismo gen está también alterado en
las demás células, aun cuando no sinteticen la hemoglobina. Por tal motivo, también las
células de Ia placenta del feto presentan el gen anómalo de Ia hemoglobina. Así, al tomar
una biopsia de Ia placenta se podría teóricamente detectar cualquiera de las tres mil
enfermedades genéticas conocidas. La biopsia de Ia vellosidad se puede obtener a las
ocho semanas de embarazo, porque en ese periodo el embrión está envuelto en el corión,
para de la membrana que constituirá Ia placenta. Este corión tiene en su superficie
pequeñas agrupaciones de células, llamadas vellosidades. La biopsia se obtiene a través
de la introducción de un catéter, por Ia vagina, guiado por ultrasonido. La biopsia se
succiona de una de estas vellosidades.
Hasta ahora son pocas las enfermedades que se pueden detectar por el método de la
sonda de DNA radioactivo, pero teóricamente se podrían detectar todas ellas antes de su
nacimiento, siempre y cuando se identifiquen los genes, Io que se espera sea posible en el
futuro. Con este examen, una pareja puede elegir entre continuar o no con el embarazo.
Más aún, recientemente se ha descrito que tempranamente, cuando se anida el huevo en
el útero, células indiferenciadas del huevo, llamadas trofoblastos, pasan a la circulación
materna y al tomar una muestra de sangre de la madre pueden separarse y estudiar en
ellas su DNA. Es decir, bastaría una muestra de sangre de Ia madre para realizar muy
precozmente el diagnóstico de cualquier enfermedad genética del futuro hijo.
En Ia medida que el método del DNA se perfeccione, éste aún podría dar mayor
información, como por ejemplo, saber si un determinado individuo es heterozigoto para
una determinada enfermedad genética. Savio Wov de Ia Escuela de Medicina de Baylor en
Texas, USA, usando un oligonucleótido de 19 bases, en el cual se ha identificado el sitio de
Ia mutación, ha podido determinar si un individuo contiene genes mutantes o una mezcla
de genes mutantes y normales (heterozigoto) a todos normales. El Dr. Wov ha ensayado
este método en una enfermedad llamada deficiencia de alfa 1 antitripsina. Se trata de una
enfermedad genética en que falla esta enzima y se produce una digestión tríptica
descontrolada de tejidos, especialmente en eI pulmón y el hígado, Io que llega a producir
enfisema pulmonar y daño hepático. Por esta técnica, se pueden detectar mutaciones en
cantidades tan pequeñas de DNA, como 5 microgramos.
En resumen se trata de una tecnología que está en pleno desarrollo y cuyas posibilidades
pueden extenderse aún mucho más. Por ejemplo, en el estudio de las susceptibilidades
individuales a ciertas enfermedades, o a carcinógenos o a mutágenos. Podrían identificarse
a individuos que sean propensos a Ia diabetes insulina dependientes y así intervenir para
evitar Ia destrucción de las células beta del páncreas y prevenir Ia enfermedad con
vacunas, ya que algunos investigadores piensan que es producida por infecciones virales.
Mucho queda por conocer y avanzar en este campo en la medida que se vayan
identificando genes que condicionen Ia mayor o menor sensibilidad a diversas
enfermedades.
Diagnóstico en el Cáncer
Ya existe un consenso, entre los investigadores, que el cáncer es debido a una alteración
del DNA (ver capitulo 8). Es ya un hecho demostrado la existencia de genes que
potencialmente pueden inducir la iniciación de un cáncer, como son los proto oncogénicos.
Diversos factores pueden inducir el cambio de un gen de proto oncogénico a oncogénico
como son las radiaciones, los virus, los mutágenos, etc. Para que este cambio ocurra tiene
que modificarse el DNA del gen proto oncogénico mediante una mutación, en una o dos de
sus bases. Este gen alterado puede detectarse mediante las técnicas de DNA sintético.
Probablemente esta metodología no sea útil en el diagnóstico precoz del cáncer, desde el
momento que los genes oncogénicos están sólo presentes en las células del tumor, pero
pueden ser útiles para planificar un tratamiento efectivo, Lamentablemente, una de las
características más sobresalientes de la célula cancerosa, es su gran potencial mutagénico,
Io que ha postergado considerablemente el empleo de esta técnica con estos fines.
Ya están disponibles varias muestras comerciales con DNA de este tipo, pero ninguno ha
sido aprobado aún por Ia Administración de Alimentos y Drogas de USA, por lo que su uso
está sólo disponible para investigadores que se dediquen al tema.
En Ia medida que progresen las investigaciones cada día serán más útiles estas técnicas
de diagnóstico. Por ahora se puede afirmar que están aún en etapas de desarrollo como lo
estuvieron hace veintidós años los métodos que hoy se utilizan aprovechando la reacción
antígeno/anticuerpo. Seguramente se continuará investigando en este sentido por la
importancia que tiene el diagnóstico precoz de una enfermedad.
Artículo extraído de CRECES EDUCACIÓN - www.creces.cl