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CUESTIONARIO N° 5
ARN y Síntesis de Proteínas
1) El ADN está compuesto por dos hebras. Una hebra es codificante y la otra no codificante. La
hebra no codificante es usada como molde para hacer el ARNm. ¿Cuál es la relación entre la
secuencia de bases de las hebras codificante y no codificante?
2) ¿Cuál es la relación entre la secuencia de bases de la hebra codificante y de la secuencia de
bases en el ARNm?
3) ¿Cuál es la relación entre la secuencia de bases de la hebra no codificante y de la secuencia
de bases en el ARNm?
4) ¿Qué es un dogma? ¿Qué establece el “Dogma Central de la Biología Molecular”? ¿Qué puede
decir de los priones, ribozimas y de la enzima transcriptasa reversa en relación con el Dogma?
5) ¿Qué quiere decir que el código genético es universal y redundante? ¿Es estrictamente
universal?
6) ¿Qué función cumplen las aminoacil-tRNA sintetasas?
7) ¿Qué función cumple la peptidil-transferasa? ¿Se trata de una proteína?
8) Describa los procesos que tienen lugar luego de la llegada de un aminoacil-tRNA al ribosoma,
hasta la llegada del siguiente aminoacil-tRNA.
9) Completa cada afirmación con los distintos tipos de ARN según corresponda:
a- Hay más de 50 tipos distintos…..
b- Es monocistrónico en eucariotas…
c- Su vida media es muy corta….
d- En procariotas lleva información para más de una proteína…
e- Tienen función catalítica….
f- Su función es copiar la infomación genética…
g- Se asocian con proteínas…
h- Son moléculas largas y monocatenarias …
i- Da origen a los distintos ARNr...
j- Agrupa ARN de muy diferentes masas moleculares…
k- Transportan los aminoácidos hasta los ribosomas…
l- Presenta estructura lineal .…
ll- Hasta un 10% de sus bases nitrogenadas puede ser distinta de las normales (A, C, U, G)..
m- Su masa molecular es pequeña en comparación con otros ARN…
n- Tiene un triplete de bases denonimado anticodón…
ñ- Se forma en el nucléolo…
o- Constituye hasta el 80% del ARN total de la célula…
10) Completa las siguientes afirmaciones.
a- Cada aa se ubica para la síntesis polipeptídica en el ribosoma por el apareamiento de bases
entre ______________ de una molécula aminoacil-ARNt y __________ del ARNm.
b- Los sitios en el ADN a los cuales se une la ARNpolimerasa para iniciar la transcripción se
llaman_____________________.
c- La subunidad de la ARN polimerasa conocida como factor sigma participa en el reconocimiento
de los sitios sobre el ADN que especifican _______________de la síntesis de ARN.
d- La subunidad ribosomal _______________contiene el sitio de unión para el ARNm.
e- El codón de iniciación para la síntesis polipeptídica es siempre___________________
f- El complejo de muchos ribosomas
_______________________
unidos
a
una
molécula
de
ARNm
se
llama
g- Al final de cada ciclo de formación de uniones peptídicas en el ribosoma la cadena creciente
queda unida al sitio ________________ como peptidil-ARNt.
11)
abcdefghijk-
¿Cuáles de los siguientes eventos forman parte de la síntesis de proteínas en procariotas?:
el tRNA met se une a la subunidad 50 S del ribosoma;
el tRNA met se une al ribosoma 80 S;
el tRNA met se une a la subunidad 30 S del ribosoma;
el DNA del intrón forma una estructura en forma de lazo;
el aa se une covalentemente al ribosoma por medio de una peptidil transferasa;
el ribosoma 70 S se disocia para formar partículas 30 S y 50 S;
las enzimas de restricción cortan DNA de doble cadena;
el tRNA reconoce a una molécula de DNA;
el tRNA reconoce a un codón;
el tRNA reconoce a un anticodón;
la aminoacil sintetasa reconoce al codón.
12) De arriba hacia abajo la figura muestra 3 etapas consecutivas de la elongación de la
traducción en los ribosomas.
a) Identifique en los dibujos lo siguiente: extremos 5' y 3' del ARNm, extremo NH2-terminal del
polipéptido naciente, extremos 5' y 3' de cada anticodón, sitios "A", "P" y "E" del ribosoma,
uniones peptídicas, uniones covalentes no peptídicas, puentes de hidrógeno.
b) Sabiendo que los círculos negro, rayado, punteado y gris representan respectivamente a los
aminoácidos metionina, triptofano, fenilalanina y ácido aspártico asigne las bases que pueda al
ARNm y a los anticodones.
c) ¿En qué etapa actúa la peptidil transferasa?
13) El antibiótico pirulina tiene la propiedad de inhibir la disociación de los ribosomas 70 S
bacterianos. ¿Cuál es su efecto sobre la síntesis de proteínas? ¿En qué difieren los péptidos
formados en presencia de pirulina, de aquellos formados en presencia de puromicina?
14) Una nueva rama de la biotecnología es la ingeniería de proteínas. En ella los biólogos
moleculares trabajan hacia atrás en el proceso de síntesis proteica. Primero determinan la
secuencia exacta del polipéptido en estudio y luego dilucidan la secuencia de ADN que lo produce.
Use las reglas de transcripción y traducción para averiguar la secuencia de ADN que origina al
siguiente péptido.
ADN
Codificante
No codificante
ARNm
ARNt
Aminoácidos
Met
Inicio
Leu
Val
Pro
Gly
Asn
Ser
Glu
Glu
Pro
Val
15) Si el siguiente dúplex de ADN es transcripto de derecha a izquierda:
a- ¿Cuál es la hebra sentido?
b- ¿Cuál es la secuencia del ARNm resultante?
c- ¿Qué relación de información existe entre la secuencia del ARNm y la hebra antisentido del
ADN?
5´ - A-T-T-C-G-C-A-G-G-C-T-3´
3´ - T-A-A-G-C-G-T-C-C-G-A-5´
dirección de la transcripción
16) La secuencia nucleotídica cercana al sitio de iniciación en el ARNm para la proteína de la
cubierta del fago ARN R17 es
5´….G-A-A-G-C-A-U-G-G-C-U-U-C-U-A-A-C-U-U-U-….3´
a- ¿Cuál es el codón para el primer aa de la proteína?
b- ¿Por qué el trinucleótido U-A-A cercano al extremo derecho de la secuencia no produce la
terminación de la cadena?
17) Una hebra de una sección de ADN aislado de E. coli se lee:
5'-GTAGCCTACCCATAGG-3'
a- Suponga que el ARNm es transcripto de este ADN usando la hebra complementaria como molde.
¿Cuál será la secuencia de ARN mensajero?
b- ¿Qué péptido se obtendría si la traducción comenzara exactamente en el extremo 5' de este ARN
mensajero? (Asuma que no se requiere un codón de iniciación, como sucede bajo ciertas
condiciones de laboratorio). Cuando el tARNAla deje el ribosoma, ¿cuál será el siguiente tARN que
se unirá? Cuando el grupo amino de la alanina forme un enlace peptídico, ¿qué enlaces, si existe
alguno, se romperán y qué sucederá con el tARNAla?
c- ¿Cuántos y cuáles péptidos diferentes están codificados en este ARN mensajero? ¿Se habrían
originado los mismos péptidos si la otra hebra de ADN hubiera servido como patrón para la
transcripción?
18) Se cultivaron los microorganismos:
S. cerevisiae, E. coli y Rhodotorula sp.
En dos medios ricos, uno conteniendo Cloranfenicol y otro Cicloheximide en un rango de
concentraciones. Los cultivos se incubaron 24 h a 37°C y se observó si hubo crecimiento. Los
resultados fueron los siguientes:
S. cerevisiae
Concentración
del Crecimiento
con Crecimiento
Cicloheximide
Cloranfenicol
antibiótico (g/ml)
100
+
con
50
25
12,5
6,25
3,115
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
E. coli
Concentración
del Crecimiento
con Crecimiento
Cicloheximide
Cloranfenicol
antibiótico (g/ml)
100
+
50
+
25
+
12,5
+
6,25
+
3,115
+
0
+
+
Rhodotórula sp.
Concentración
del Crecimiento
con Crecimiento
Cicloheximide
Cloranfenicol
antibiótico (g/ml)
100
+
50
+
25
+
12,5
+
6,25
+
3,115
+
+
0
+
+
con
con
a)- Explique los resultados obtenidos considerando la forma de acción de los antibióticos usados y
su relación con la síntesis de proteínas.
b) ¿Cuál puede ser la causa de que aparezcan efectos secundarios cuando se utiliza un antibiótico
típicamente antiprocariotas como el cloranfenicol ante una infección bacteriana en animales? Ver
anexo “Antibióticos y síntesis de proteínas”.
19) La secuencia de un fragmento de DNA interno a un gen de E. coli es la siguiente:
5' C C G G C T A A G C C A T G A C T A G C 3'
3' G G C C G A T T C G G T A C T G A T C G 5'
a) Escribir las secuencias de mRNA que podrían producirse por transcripción de este segmento.
b) Identificar los codones, en todas las fases de lectura posible, de estos RNAs ¿Cuál es la
secuencia de aminoácidos más probable que podría formarse por la transcripción-traducción de
este fragmento?
20) La región codificadora de un gen en eucariotas está formada por cuatro exones de 99, 75, 66
y 90 nucleótidos y tres intrones, intercalados entre los exones, de 45, 63 y 42 nucleótidos,
respectivamente. Indicar: a) cuántos nucleótidos tendrá el ARNm precursor; b) cuántos
nucleótidos tendrá la región que se traducirá del ARNm maduro y c) cuántos aminoácidos tendrá el
péptido codificado.
Extraído de Cooper, La Célula.
CUESTIONARIO N° 6
Síntesis de ARN y control genético
1) ¿A partir de qué sustratos se sintetiza ARN mensajero? ¿Sobre qué molde? ¿Se requiere de un
cebador? Describa las enzimas que realizan la transcripción en procariotas y eucariotas.
1) Describa las diferencias entre los ARN mensajeros en procariotas y eucariotas.
3) Una mutación en un gen X provoca la ausencia total de actividad biológica de la proteína
codificada por el mismo. El gen X tiene una longitud de 35 Kb; el ARNm normal tiene una longitud
de 2.5 Kb. Se observó que el ARNm producido por el gen mutado tiene una longitud de 4.2 Kb.
¿Cuál puede ser la naturaleza de la mutación del gen X y de qué manera afecta negativamente su
expresión?
4) Defina los siguientes términos, identificando si se trata de una proteína, de un segmento de
ADN (gen), o una molécula pequeña (metabolito) distinto de ADN y proteína.
a- Operador; b- represor; c-inductor; d-promotor; e-co-represor, f--galactosidasa; g-alolactosa.
5)
Distinga
los
siguientes
operón/promotor/operador.
términos:
enzima
inducible/enzima
represible;
6) ¿Qué papel juega el AMP cíclico (cAMP) en la transcripción de los genes del operón lactosa?
7) ¿Qué es la represión catabólica?
8) ¿Qué ocurre con la concentración intracelular de cAMP en E. coli cuando ésta es crecida en un
medio con glucosa? Relacione su respuesta con las de las preguntas 6 y 7.
9) ¿Qué es el fenómeno de diauxia?
10) ¿Qué elementos del sistema del operón lactosa actúan en cis y cuáles en trans?
11) E. coli crece más rápido usando el monosacárido glucosa que el disacárido lactosa por dos
razones:
1) La lactosa es incorporada más lentamente que glucosa y 2)- lactosa debe ser hidrolizada a
glucosa y galactosa (por la ß-galactosidasa) antes de poder ser metabolizada.
Cuando E. coli crece en un medio conteniendo una mezcla de glucosa y lactosa, se observa una
cinética de crecimiento compleja (Fig. 1). Esta bacteria crece más rápido al comienzo que al final
de la experiencia, además existe una fase lag intermedia donde virtualmente se detiene el
crecimiento. Análisis de las concentraciones de los dos azúcares en el medio muestran que la
glucosa disminuye a niveles muy bajos luego de unos ciclos de división celular, pero la lactosa
permanece en concentraciones elevadas casi hasta el final de la experiencia. A pesar de que la
concentración de lactosa es elevada durante el experimento, la ß-galactosidasa, la cual es
regulada como parte del operón lac, no es inducida hasta que han pasado más de 100 minutos.
a- Explique la cinética de crecimiento bacteriano durante el experimento. Justifique la alta velocidad
inicial de crecimiento, la baja velocidad final, y el retraso o fase lag observado.
b- Explique porque el operón lac no es inducido por la lactosa durante la fase rápida inicial de
crecimiento bacteriano.
tiempo (min)
glucosa
galactosidasa
bacteria
12) Describa el fenotipo correspondiente a los siguientes genotipos:
GENOTIPO
FENOTIPO
NO INDUCIDO
Actividad -Gal
INDUCIDO
crm
Actividad -Gal
crm
i+p-ocz+
i+p+ocz+
I –p+o z+
i+p+oczCRM
i+p+ocz+
i+p-oczCRM
i: gen que codifica el represor; p: promotor; o: operador;
oc: operador constitutivo (no reconoce al
CRM
represor); z: gen estructural de la -gal; z
: mutante del gen estructural z, que produce una enzima
inactiva, pero que es capaz de ser reconocida por los anticuerpos anti--gal. crm: cross reacting material:
material que reacciona en forma cruzada con anticuerpos contra la -galactosidasa.
13) Una cepa de E. coli posee en su cromosoma el gen del represor del operón lac inactivo (i-), un
promotor normal (p+), un gen operador normal (o+), y un gen de -gal que produce una enzima
inactiva (z-). En esta cepa se puede introducir un plásmido que lleva un gen represor normal (i+),
un operador constitutivo, y un gen de -gal normal (z+). Completar el siguiente cuadro:
Actividad de -gal
sin inductor, sin plásmido
sin inductor, con plásmido
con inductor, sin plásmido
con inductor, con plásmido
* Reconocimiento por anticuerpos anti-ßgalactosidasa
CRM*
Cuestionario N° 7
Replicación, reparación y mutación de ADN
1) Describa el proceso de replicación del DNA, teniendo en cuenta lo siguiente:
a- Explique por qué al producirse la estructura en Y (horquilla de replicación) una de las cadenas
hijas se sintetiza en fragmentos.
b- Describa la acción de todas las enzimas involucradas en el proceso de replicación del DNA.
2) ¿Qué consecuencias tendría para una bacteria la pérdida, por mutación, de la actividad exonucleasa de 3' a 5' de la DNA polimerasa III? Justifique.
3) Explique los siguientes conceptos
a- mutación inducida; mutación espontánea
b- mutación somática; mutación germinal
c- transición (los 4 casos posibles)
d- transversión (los 8 casos posibles)
e- mutación silenciosa; mutación neutra
f- mutación por corrimiento del marco de lectura (o "frame-shift")
g- mutación por sustitución "missense" y "nonsense"
4) Explique el modo de acción de los siguientes mutágenos y el tipo de mutación (a nivel
molecular) que producen:
a- los análogos de bases (ej. 5-bromouracilo)
b- los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej. etilmetanosulfato y
nitrosoguanidina)
c- aflatoxina B1 (producida por el hongo Fusarium)
d- los agentes intercalantes (ej. proflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio)
5) Complete las siguientes afirmaciones.
a- Cada fragmento de Okazaki es sintetizado con una corta extensión de ___________ unida a su
extremo ________________
b- La mayoría de los cambios espontáneos en el ADN son rápidamente eliminados por un proceso
de corrección llamado _____________________, solo raramente los procesos de
mantenimiento del ADN fallan y permiten un cambio permanente en una secuencia, lo cual se
conoce como ________________________
c- Dos cambios espontáneos comunes en el ADN son _____________________, el cual resulta
de la disrupción del enlace N-glicosil de adenina y guanina a la deoxiribosa, y
________________________, el cual transforma citosina en uracilo.
d- La reparación de ADN comprende tres pasos: reconocimiento y remoción de la porción alterada
de ADN por enzimas llamadas ________________________, resíntesis de la región perdida
por
_____________________________,
y
unión
de
los
extremos
por
la
enzima________________________________.
e- La enzima responsable de la síntesis de ADN tanto para la replicación como para la reparación
es la _______________________________.
f- La apertura de la hélice de ADN en la horquilla de replicación es catalizada por la
________________________________, la cual usa la energía de la hidrólisis de ATP para
moverse unidireccionalmente por la hebra de ADN.
g- _______________________________, que colaboran con la apertura del ADN, se unen a
hebras simples de ADN de tal modo que las bases están aún disponibles para las reacciones de
apareamiento.
h- Para bacterias y levaduras, así como para varios virus que crecen en células eucariotas, se ha
visto que las burbujas de replicación se forman en una secuencia especial de ADN
llamada______________________________
6) ¿Por qué posee el genoma humano miles de orígenes de replicación y el genoma de E. coli solo
contiene 1?
7) En la siguiente figura se observa un cromosoma. a) Indica si es de un procariota o de un
eucariota; razona la respuesta. b) ¿Qué procesos se están dando en a y en b?
8) El genoma entero de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, está constituido por
1,65x108 pares de bases. Si la velocidad de replicación de una sola horquilla es de 30 pares de
bases/segundo. Calcular cuánto tiempo tardaría en replicarse el genoma entero si la replicación se
inicia:
a) en un único origen.
b) en 2000 orígenes.
c) La replicación en los embriones tempranos es de 5 a 6 veces más rápida. ¿Podría este tiempo
de replicación estar justificado por 16.000 orígenes?
9) El fragmento de ADN de la Fig 1. está constituido por dos hebras en los extremos pero una sola
hebra en el medio. Se indica la polaridad de la hebra superior.
Fig. 1
5'_____________________________________ 3'
_________________P HO______________
a- ¿El grupo fosfato (P) en la hebra inferior esta en el extremo 5' o en el 3' del fragmento al cual
esta unido?
b- ¿Cómo esperarías que la brecha sea completada por el proceso de reparación de ADN en una
célula?
c- ¿Cuántas partes formarían la hebra inferior si la brecha fuera completada mediante una reacción
in-vitro conteniendo solamente deoxiribonucleósidos trifosfato y ADN polimerasa?
10) El mecanismo de replicación semiconservativa fue predicho por Watson y Crick basándose en
la manera de apareamiento de las bases en la doble hélice. Más tarde este mecanismo fue
probado correctamente por Meselson y Stahl, quienes demostraron que cuando células de E. coli
marcadas isotópicamente en su ADN replicaban su cromosoma a partir de precursores no
marcados, la distribución del isótopo en las moléculas hijas luego de 1, 2 ó 3 generaciones
correspondía al modo de replicación semiconservativa. Meselson y Stahl emplearon 15N como un
marcador de densidad para el ADN y un equilibrio de sedimentación en solución de CsCl para
separar las moléculas de ADN totalmente marcadas con 15N de aquellas marcadas sólo
parcialmente (15N-14N) y de las no marcadas (14N), obtenidas de hacer crecer células marcadas
con 15N en un medio con 14N.
Si a las células de E. coli marcadas con 15N se les permitió crecer durante 3 generaciones
(aumentan su población 8 veces) en un medio con 14N.
a- ¿Cuáles de las siguientes distribuciones de ADN totalmente marcado, parcialmente marcado
y no marcado esperaría encontrar luego de extraer el ADN, con un PM promedio de 106, y
determinando su densidad en un equilibrio de sedimentación?
b- Si la replicación del ADN fuera conservativa en lugar de semiconservativa, ¿qué resultados
hubieran obtenido Neselson y Stahl?
c- Leer el artículo anexo sobre replicación de ADN.
ADN
15
N puro
híbrido
14
N-15N
14
N puro
a-
1/8
1/8
6/8
b-
1/8
0
7/8
c-
0
1/8
7/8
d-
0
2/8
6/8
e-
0
4/8
4/8
11) El fármaco didesoxicitidina (utilizado para tratar ciertas enfermedades virales) es un nucleósido
formado con 2`,3` didesoxirribosa. Este azúcar carece de grupo –OH tanto en las posiciones
2`como 3`. Explique porque este fármaco detendría el crecimiento de una cadena de ADN si se lo
agregara al ADN.
12) Ocurren errores en la transcripción cerca de 100.000 veces más que los errores en la
replicación del ADN. ¿Por qué puede tolerarse esta tasa elevada en la síntesis del ARN pero no en la
síntesis del ADN?
13) ¿La sustitución de una base por otra en una zona del DNA que codifica para proteínas (mutación
puntual) da lugar necesariamente a un cambio de aminoácido?
14) En la hebra codificante de un gen, el codón ATA ha cambiado por mutación a ATG. Tras una
replicación de esta molécula, ¿cabría esperar algún cambio en la secuencia de la proteína codificada?
15) Una mutación puntual (C que cambia a G) en un gen bacteriano produce la aparición de un
codón stop UAG en la mitad de su mensajero, lo cual provoca la pérdida de la capacidad de usar
ácidos grasos como fuente de alimento.
a) ¿Cuál es el aa codificado por el codón alterado? (utilice el código genético)
Una segunda mutación en un gen que codifica para un RNA de transferencia provoca la alteración
de su anticodón de manera tal que se aparea con el codón stop UAG, incorporando el aminoácido
tirosina en esa posición. Tal mutación suprime los efectos de la primera, restaurando a las bacterias
su capacidad de alimentarse de ácidos grasos.
b) ¿Qué cambio de base es el que determina la segunda mutación?
c) ¿Qué mecanismos garantizan:
i- que se incorpore tirosina en las posiciones correctas de esa y otras proteínas?
ii- la terminación de la traducción de aquellos mensajeros cuyo codón stop natural es UAG?
d) Discuta las consecuencias fisiológicas que puede ocasionar a la bacteria la adquisición de esta
nueva mutación supresora.
16) Está estudiando una enzima en la cuál existe un residuo de cisteína activo que esta codificado
por el triplete UGU. ¿Cómo afectaría a la función enzimática la mutación de la 3ra base por una C?
¿Y la mutación por una A?
17) Utilizando el código genético, indica una posible mutación en el ADN que haya podido originar
los mutantes 1, 2 y 3 de la figura.
Cuestionario N° 8
Técnicas utilizadas en biología molecular
1) ¿Qué es necesario conocer antes de poder diseñar un protocolo basado en PCR para la
detección de un gen determinado?
2) ¿Cómo se podría asegurar que los cebadores utilizados en un ensayo sólo hibridizarán con el
ADN que se quiere detectar?
3) ¿Qué son y cómo funcionan los “terminadores de cadena” utilizados para secuenciar ADN?
4) ¿Qué terminadores de cadena se utilizan actualmente en el secuenciado de ADN y como drogas
anti-AIDS?
5) ¿Cómo se puede diagnosticar una enfermedad causada por una inserción de material genético
(fragmento de ADN) dentro de un gen?
6) ¿Qué es una enzima de restricción? ¿De dónde se obtienen? ¿Para qué se usan? ¿Qué tipos de
extremos pueden dejar en el DNA de cadena doble?
7) ¿De qué manera se protege el ADN de la bacteria de la acción de sus propias enzimas de
restricción?
8) ¿Qué es un plásmido? ¿Qué características debe reunir para funcionar como vector?
Esquematizalo ¿A qué se llama plásmido recombinante? ¿Cómo se logra?
9) Al hacer ADN recombinante, ¿Cuál es el beneficio de usar una enzima de restricción que corte el
ADN dejando extremos pegajosos?
10) Dadas las siguientes moléculas de ácidos nucleicos de cadena doble:
a) AAGTTCTCTGAA
b) GTCGTCAATGCA
c) GGACCTCTCAGG
TTCAAGAGACTT
CAGCAGTTACGT
CCTGGAGAGTCC
Señale V o F:
a- Ninguna de las tres moléculas puede ser degradada por una RNasa.
b- Las tres moléculas tienen igual temperatura de fusión (Tm) porque tienen la misma longitud.
c- Las tres tienen igual Tm porque [T]/[A] = 1 y [G]/[C] = 1 (Reglas de Chargraff).
d- Las dos hebras de cada una de ellas son antiparalelas.
e- Tm a >Tm b > Tm c
f-
Tm b > Tm a > Tm c
g- Tm c > Tm b > Tm a
h- Tm a > Tm c > Tm b
Justifique
11) Coloca según corresponda(N=Northern; S= Southern; W=Western o X= Ninguna) a qué
técnica de hibridación corresponde cada una de las siguientes afirmaciones
La detección de fragmentos de ARN sobre una membrana usando anticuerpos específicos radioactivos
La detección de fragmentos de ARN sobre una membrana usando una sonda de ADN radioactivo
La detección de proteínas sobre una membrana usando anticuerpos específicos marcados
La detección de de fragmentos de ADN sobre una membrana usando anticuerpos específicos radioactivos
La detección de de fragmentos de ADN sobre una membrana usando una sonda de ADN radioactivos
12) Cuál de las siguientes enzimas de restricción que se detallan a continuación podrían escindir el
segmento de ADNc que codifica el péptido KIGPACF?
Enzima de restricción
 Alu 1
 Sau 96I
 Hind III
* cualquier nucleótido
Secuencia de reconocimiento
AGCT
GGN*CC
AAGCTT
13) Las enzimas de restricción BamHI y PstI reconocen ciertas secuencias de ADN y producen
cortes como se ilustran a continuación:
PstI
5`--- C T G C A G---3`
3`--- G A C G T C---5`
--- C T G C A
--- G
G--A C G T C---
BamHI
5`--- G G A T C C---3`
3`--- C C T A G G---5`
--- G
--- C C T A G
G A T C C--G---
a- Indicar los extremos 5`y 3`de las moléculas de ADN escindidas
b- ¿Cómo se podrían modificar los extremos de las moléculas cortadas si se las incubara con
ADNpol en presencia de todos los dNTPs?
14) En un experimento se usaron bacterias E. coli a las cuales se le introdujo el gen de una
proteína de algas que emite fluorescencia verde, llamada green fluorescent protein (GFP). Este
gen había sido modificado previamente in vitro de la siguiente manera: su ADN estaba formado
por una hebra con secuencia normal (wild-type) acompañada de su hebra complementaria que
tenía una mutación, de modo de crear un apareamiento erróneo o missmatch en uno de de sus
pares de bases, es decir que no cumple con las reglas de Watson y Crick. (Tal missmatch en la
doble hélice resultó ser estable en estas bacterias porque estas tenían mutaciones en algunos de
sus genes, que les impedía hacer la habitual reparación de missmatches). Luego de la
modificación genética mencionada, las bacterias fueron sembradas en un caja de Petri con medio
de cultivo sólido e incubadas a 37°C. ¿Qué tipo de colonias esperaría Ud. ver al día siguiente?



Colonias blancas
Colonias verdes
Colonias mixtas
15) Ud. ha clonado un fragmento BamHI de 3Kb conteniendo el gen que quiere secuenciar.
Quiere realizar un mapa de restricción del fragmento clivándolo en subfragmentos menores y
determinar su orden relativo. Para eso digiere 3 muestras separadas del fragmento purificado con
EcoRl, Hpall y una mezcla de las dos enzimas.
Los digestos los somete a una electroforesis en gel de agarosa y los revela con bromuro de etidio
para visualizar el patrón de bandas. De acuerdo a los resultados obtenidos diagrame un mapa de
restricción y exprese las distancias en Kb.
EcoRl
EcoRl + Hpall
Hpall
1,6 Kb
1,4 Kb
1,7 Kb
1,2 Kb
0,9 Kb
0,9 Kb
0,4 Kb
0,5 Kb
0,4 Kb
16) Se ha cortado con la enzima de restricción BglII un plásmido bacteriano circular que contiene
un gen de resistencia a tetraciclina. Tras la electroforesis, se observa una única banda de 14 kb. a¿Qué deduciría de este resultado?
Ese plásmido cortado con EcoRV produce dos bandas de 2,5 y 11,5 kb. b- ¿Qué puede deducir de
este resultado?
La digestión con las dos enzimas a la vez produce tres bandas, de 2,5; 5,5 y 6,0 kb. c-¿Qué indica
este resultado?
El DNA del plásmido cortado con BglII se mezcló y ligó con fragmentos de DNA donante también
cortado con BglII, para generar moléculas recombinantes. Todos los clones recombinantes
resultaron ser resistentes a tetraciclina. d- ¿Qué deduciría de este resultado?
e. Tras cortar un clon recombinante con BglII, se observan dos fragmentos, de 4 y 14 kb. Explique
este resultado.
f. Explique el conjunto de resultados mostrando un mapa de restricción del DNA recombinante.
17) Un ejemplo de plásmido de clonación idóneo es el pBR322 que se replica en E. coli. Este
plásmido tiene varias características que le hacen adecuado como vector de clonación, entre ellas
podemos mencionar: su pequeño tamaño y el conocimiento de su secuencia completa, presenta
sitios únicos de corte para varias enzimas de restricción (PstI, SalI, EcoRI, HindIII y BamHI),
además posee un gen responsable de resistencia a la tetraciclina y otro que le confiere resistencia
a la ampicilina. El sitio para BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, mientras
que el sitio para PstI está dentro del gen de resistencia a la ampicilina.
Cultivos de E. coli que contienen el plásmido pBR322 fueron tratados con las enzimas BamHI y
PstI y luego cultivados en distintas placas de agar conteniendo ambos antibióticos (tetraciclina +
ampicilina), sólo ampicilina, solo tetraciclina o ninguno de ellos. En algunos casos se sabe que
luego de la digestión enzimática y linearización se ha producido la recircularización del plásmido
sin que se haya introducido ningún otro fragmento de ADN.
Según los datos que se muestran en la siguiente tabla, ¿podría indicar que tipos de tratamientos
recibieron cada cultivo?
Muestras
A
B
C
D
E*
Amp+Tet
++
+
+
-
Crecimiento de E. coli en:
Amp
Tet
++
++
++
-++
+
+
Sin ATB
+++
+++
+++
+++
+++
*¿Puede ser cierto este resultado? Explique.
18) Un científico distraído guardó los primers sin rotular de una bacteria pero no sabe cuál es el
foward y el reverse. Sólo cuenta con las secuencias de cada uno que se indican a continuación:
AAGAAAAAGAAGTAGACCAAC
AAACGGCAAGACAAGTAAATA
Al estudiar las secuencias en la base de datos (BLASTn) encuentra los siguientes resultados:
Primera secuencia analizada
Accession
X17214.1
Description
S. faecalis plasmid pAD1 asa1 gene for aggregation substance and
Query
coverage*
Max
ident
100%
100%
AE016831.1 Enterococcus faecalis V583 plasmid pTEF2, complete sequence
100%
100%
AE016833.1 Enterococcus faecalis V583 plasmid pTEF1, complete sequence
100%
100%
AE016830.1 Enterococcus faecalis V583, complete genome
100%
100%
100%
100%
U91527.1
ORF 1
Enterococcus faecium plasmid pHKK701 aggregation substance
(ash701) gene, complete cds
* Analizó las 21 letras de la secuencia
Segunda secuencia analizada
Accession
AL807827.11
AC102164.7
Description
Zebrafish DNA sequence from clone CH211-220J6, complete
sequence
Mus musculus chromosome 3, clone RP23-438M14, complete
sequence
Query
coverage
Max
ident
80%
100%
80%
100%
AC190269.3
Callithrix jacchus BAC clone CH259-1H12 from chromosome
unknown, complete sequence
76%
100%
AC145321.3
Oryza sativa Japonica Group chromosome 11 clone
OSJNBa0094P07, complete sequence
76%
100%
AC079356.2
Oryza sativa Japonica Group chromosome 5 clone P0016H04,
complete sequence
76%
100%
76%
100%
76%
100%
XM_676666.1
AC126444.3
Aspergillus nidulans FGSC A4 hypothetical protein (AN8489.2),
mRNA
Mus musculus BAC clone RP24-136A8 from chromosome 14,
complete sequence
a- Analice los resultados obtenidos
19) Suponga que Ud. desea amplificar por PCR el fragmento escrito en mayúsculas en la siguiente
secuencia de DNA:
`5−TAACCTGCAACCCTTTTCGGTATTGCTGATGAATCGAT……480NT….GAAGTCCGATTCGATGTGATGGGCATACCT
ATGGCCATGG-3’
a. Escriba la secuencia de dos posibles oligonucleótidos (aprox. 18 a 24 pb cada uno) que le
permitan amplificar el fragmento del problema.
b. Indique los componentes necesarios para la mezcla de reacción y diga en qué consisten los
ciclos de amplificación, aclarando qué ocurre en cada etapa.
c. Explique cómo evalúa la obtención del producto de la reacción y como procedería para
purificarlo y clonarlo.
d. ¿Cómo verificaría que obtuvo el producto esperado?
ANEXO
El objetivo de este grupo de problemas es presentar una introducción al uso del método de
Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP, por sus iniciales en inglés)
para la caracterización de muestras de ADN humano, en los análisis de paternidad y en la
investigación de delitos. Tendrá Ud. la ocasión de interpretar resultados de casos reales tales como
los que se obtienen en el laboratorio del FBI o en un servicio comercial de ensayo de paternidad.
RFLP
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de
distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes
organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los pequeños derivados de la digestión del
genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones
pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de
agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de
mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario
utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern
Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos,
aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP
evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros
mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de
entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas
radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP
1.
Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del
delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras
de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que
es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuencia
característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es
HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su
tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo.
Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la
matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a
través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce
una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de
modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con
referencia al origen o punto de aplicaión de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras
permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina.
Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la
superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la
traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante").
Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de
Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la
aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de
la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de
nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en
el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radiactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de
hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la
molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el
"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern
resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración de sales
que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda
no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de
nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6.
Detección
de
los
RFLPs
mediante
autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del
ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X
dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde
hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el
registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía
( abreviado coloquialmente en inglés a "autorad").
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios
cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera
sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura,
que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se
una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un
locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de
Southern se conoce como un "perfil de ADN".
VNTR significa "número variable de repeticiones en tándem" (Variable Number of
Tandem Repeats)
Una repetición en tándem es una secuencia corta de ADN que se repite consecutivamente, cabeza
con cola, en un locus cromosómico específico. Se encuentran repartidas por todo el genoma
humano. Algunas secuencias se encuentran en un solo sitio -un locus único- del genoma. Para
muchas de las repeticiones en tándem, el número de unidades repetidas varía entre individuos;
tales loci se llaman VNTRs. Un ejemplo de VNTR en humanos es una secuencia de ADN de 17 pb
que se repite entre 70 y 450 veces en el genoma. El número total de pares de bases en ese locus
puede así variar entre 1190 y 7650.
Los VNTRs se detectan como RFLPs mediante hibridación de Southern
El método medicolegal más habitual para caracterizar los VNTRs es el uso de la hibridación de
Southern, descrita en el Problema 1. Si el ADN que flanquea un VNTR se corta con una
endonucleasa de restricción, el tamaño del fragmento resultante puede variar, conduciendo a un
RFLP, o "polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción" (Restriction Fragment
Length Polymorphism). Esto se muestra esquemáticamente en la figura, en la que los rectángulos
rojos representan la unidad de repetición y los círculos azules, los sitios de corte por una
endonucleasa de restrición. En esta figura, sólo se ilustran tres variantes diferentes (alelos) para el
locus VNTR, pero es habitual en los loci VNTR humanos encontrar 50 o más alelos distintos.
Se hereda un VNTR de cada progenitor
El análisis de un locus VNTR mediante hibridación de Southern suele mostrar un patrón de dos
bandas, una heredada de cada progenitor (padre y madre). Puede darse un patrón de una sola
banda, si el tamaño de las dos bandas es el mismo o muy similar. Para nuestro ejemplo sencillo de
tres alelos diferentes, designados A, B y C, son posibles seis perfiles distintos de ADN.
Los genotipos posibles son AA, BB, CC, AB, BC y AC, como se muestra en la figura de abajo. Cada
uno de estos genotipos se puede distinguir como un patrón diferente de una o dos bandas tras la
hibridación de Southern, como se aprecia en la autorradiografía de la derecha.
Los perfiles de ADN varían de una persona a otra
Cuando se comparan los perfiles de un solo locus VNTR para individuos no relacionados entre sí,
habitualmente son diferentes. No obstante, es posible que dos personas tengan el mismo perfil en
uno o dos loci por casualidad. Sin embargo, la probabilidad de que dos personas tengan el mismo
perfil de ADN en 4, 5 o 6 loci VNTR diferentes es extremadamente baja. Cuando se usan los
perfiles de ADN con fines medicolegales, se analizan de 4 a 6 loci VNTR diferentes.
Problema 1
Determinación de la paternidad
La autorradiografía mostrada corresponde a los resultados de un análisis de huella dactilar de
ADN, con una sonda de locus único, aplicado a un varón, una mujer y sus cuatro hijos/as. ¿Cuál
de los hijos/as es el que con menor probabilidad desciende de esta pareja?
Problema 2
Perfil del padre
La figura muestra los resultados del análisis de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus
único, para un varón y sus cuatro hijos/as. ¿Qué calle contiene el ADN del padre?
Problema 3
Investigación de una violación
Esta figura muestra la parte significativa de la autorradiografía de un análisis, con sonda de locus
único, de varias muestras de ADN procedentes de la investigación de una violación.
Las muestras de ADN se cargaron en las calles del gel de este modo:
1.
2.
3.
4.
5.
Muestra de sangre de la víctima.
Muestra de sangre del acusado.
Marcadores de tamaño de ADN.
Fracción femenina de la muestra vaginal de la víctima.
Fracción masculina de la muestra vaginal de la víctima.
Si Ud. fuera el analista de ADN, debería sacar como conclusión:
A. El sospechoso es culpable.
B. El sospechoso podría ser culpable, pero deben usarse más sondas.
C. La muestra vaginal procede de una víctima errónea.
D. El sospechoso queda excluido como origen del ADN presente en la prueba del delito.
E. NINGUNA de éstas.
Problema 4
Investigación de una violación con dos sospechosos
La figura muestra la parte significativa de la autorradiografía resultante de analizar, con una sonda
de locus único, varias muestras de ADN en una investigación de violación.
Las muestras de ADN fueron las siguientes:
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
muestra conocida de sangre de la víctima
muestra conocida de sangre del sospechoso A
muestra conocida de sangre del sospechoso B
ADN marcadores de tamaño
fracción femenina de la prueba de ataque sexual
fracción masculina de la prueba de ataque sexual
Si fuera Ud. el analista de ADN, sacaría como conclusión:
A. Ambos sospechosos, A y B, quedan excluidos como origen de la prueba del delito.
B. El sospechoso A queda excluido como origen de la prueba del delito, pero no se puede descartar al
sospechoso B.
C. El sospechoso B queda excluido como origen de la prueba del delito, pero no se puede descartar al
sospechoso A.
D. No se puede descartar al sospechoso A ni al B como origen de la prueba.
E. No se puede descartar al sospechoso B como origen de la prueba del delito. Los resultados del
sospechoso A no son concluyentes.
Problema 5
Reconstrucción del perfil de una madre ausente
En ocasiones, los científicos medicolegales deben reconstruir el perfil de ADN de una persona
desaparecida o ausente a partir del estudio de los perfiles de ADN de parientes cercanos. En este
caso, falta la madre de cuatro hijos/as, todos ellos con un mismo padre biológico. La figura
muestra los resultados del análisis de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus único, de los
cuatro niños y del padre. Lamentablemente, el analista olvidó rotular cuál es la calle donde puso el
ADN del padre.
A pesar de ello, se puede deducir que los alelos de la madre ausente son:
1.
2.
3.
4.
5.
B
A
A
B
A
y
y
y
y
y
C
B
C
D
D
VER ANEXO CON LAS FIGURAS DE CADA PROBLEMA.
Problema 1
Problema 2
Problema 3
Problema 4
Problema 5