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PROGRAMA DE BIOQUIMICA EXPERIMENTAL I: Parte práctica
(14 créditos)
COORDINADORAS:
Elena Bogonez
Departamento de Biología Molecular
CX-450.
Extensión 3505
e-mail: [email protected]
Ana Ruiz Gómez
Departamento de Biología Molecular
CV-201
Extensión: 2681
e-mail: [email protected]
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La Parte Práctica de la asignatura es de 14 créditos (que se completan con 3 créditos de teoría) que se
imparten en el primer cuatrimestre en los Laboratorios del Prácticas del Departamento de Biología Molecular
en el Edificio de Biológicas. Los 14 créditos prácticos se realizan en horario de tarde.
Es necesaria la asistencia a las clases prácticas para aprobar la asignatura, así como la entrega del cuaderno de
laboratorio y la realización del examen.
PROGRAMA:
I.
II.
Proteínas: Constituye el 55% de la parte práctica de la asignatura:
1. Cromatografía de Filtración Molecular: Preparación de la columna de Sephadex
G-100. Calibrado de la columna. Separación de proteínas de una mezcla problema.
Regeneración de la columna.
2. Determinación de proteínas y actividades enzimáticas. Método de Bradford.
Determinación de la actividad catalasa. Determinación de la presencia de
lisozima.
3. Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Preparación del gel de
poliacrilamida. Preparación y carga de las muestras. Tinción del gel de proteínas.
4. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF. Tinción
reversible de proteínas fijadas a filtros de nitrocelulosa y/o PVDF. Detección
inmunológica de proteínas.
5. Purificación de la lisozima a partir de clara de huevo. Preparación de la resina de
intercambio iónica CM-celulosa y purificación de la lisozima. Ensayo enzimático
y determinación de proteínas por la técnica de Lowry. Electroforesis en geles de
SDS-poliacrilamida de las fracciones del proceso de purificación.
6. Fraccionamiento subcelular de hígado de rata. Obtención de las fracciones
mitocondrial y citosólica. Determinación de proteínas.
7. Medida de la actividad piruvato quinasa en la fracción citosólica. Efecto de la
concentración de sustrato en la velocidad inicial. Regulación de la actividad
enzimática por los efectores fructosa 1,6-bisfosfato y L-alanina.
8. Medida de la actividad succinato deshidrogenasa en la fracción mitocondrial.
Establecimiento de las condiciones de ensayo en velocidad inicial: tiempo de
reacción, concentración de enzima. Efecto de la concentración de sustrato.
Inhibición por malonato.
DNA: Constituye el 45% de la parte práctica de la asignatura.
1. Aislamiento de DNA genómico de hígado de rata.. Análisis de la muestra
obtenida, determinación de la concentración de DNA, electroforesis en geles de
agarosa
2. Amplificación del exón 3 de la globina por PCR. Visualización del producto de
PCR por geles de agarosa
3. Aislamiento del plásmido pBluescript por el método de lisis alcalina. Crecimiento
de bacterias en presencia de amplicilina y purificación del plásmido por minipreps.
Determinación de la concentración de DNA por Absorbancia a 260 nm y en geles
de agarosa.
4. Clonaje del producto de la PCR en pBluescript. Digestiones del producto de la
PCR y del plásmido purificado con la enzima Bam H1. Desfosforilación del
plásmido pBluescript. Purificación y cuantificación de los DNAs digeridos.
Ligación. Preparación de bacterias competentes. Transformación de bacterias,
siembra en placa e identificación de colonias recombinantes.
5. Análisis de los clones recombinantes. Análisis por PCR de colonias. Análisis por
minipreps y digestiones de los DNAs recombinantes. Southern-blot.