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Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica III – 2009
Seminario 4: Generalidades de transcripción y métodos de estudio
Temario
Metabolismo de RNA en procariotas y eucariotas
 Propiedades estructurales y funcionales de los diferentes RNAs. Relaciones vida mediafunción.
 Terminología: cistrones, secuencias codificantes y marcos de lectura abiertos.
 Características generales de los mecanismos de transcripción. Iniciación, elongación y
terminación en bacterias y en células eucariotes. Inhibidores de la transcripción.
 Estructura de las RNA polimerasas
 Secuencias promotoras.
Mecanismo de transcripción en procariotas
 El inicio de la transcripción y el rol de factores sigma
 Terminación: Rho dependiente e independendiente
Métodos de estudio
Northern Blot, S1 Mapping, Primer extension, Transcripción in vitro, Run off Transcription,
Nuclear Run on Transcription, Expresión transitoria, Footprinting con DNasa I, Ensayos de retraso
(Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA).
Bibliografía





Lehninger Principles of Biochemistry, Nelson, D.L. & Cox, M.M., 4th Ed (2005) Worth Publishers.
RNA metabolism- Lehninger. Capitulo 26.
Molecular Biology. Clark, David, (2005) Elsevier Academic Press: Transcription of Genes,
Capítulo 6, 132-153.
Molecular Biology. Weaver, Robert F, (2008) 4th Edition The McGraw-Hill Companies: Molecular
Tools for studying genes and gene activity Chapter 5, pages 106-119. The Mechanism of
Transcription in Bacteria, Chapter 6.
Biochemistry by Voet and Voet. (Wiley Publishers, 3rd Ed.),http://bcs.wiley.com/hebcs/Books?action=index&bcsId=1847&itemId=047119350X
Biología Celular y Molecular. Lodish, H, Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P. &
Darnel,J.. 5a ed. Capitulo 4.
Páginas web
Animaciones del mecanismo de transcripción
 http://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/animaciones
Transcripción mecanismo general 1
Transcripción mecanismo general 2
Transcripción mecanismo general 3
Transcripción en procariotas
Preguntas guía
I-Indique si alguna/s de las siguientes afirmaciones es correcta
1) RNA polimerasas
a) Sintetizan RNA en la dirección 5’ a 3’ a partir de un DNA molde
b) Sintetizan RNA en la dirección 3’ a 5’ a partir de un DNA molde
c) Requieren un primer para iniciar la síntesis de una nueva cadena de RNA
d) Pueden leer la secuencia del DNA molde sin romper el apareamiento de bases de la doble hélice
2) La unión de la RNA polimerasa holoenzima de E. coli al promotor:
a) cubre completamente ambos lados del DNA doble cadena.
b) ocurre por interacción de la subunidades beta con las hebras de DNA
c) es favorecida por la metilación de purinas.
d) produce un desenrollamiento del DNA de aproximadamente 10 bp
3). Después que el factor sigma ha participado en la iniciación
a) Comienza el proceso de elongación.
b) Se reasocia con la holoenzima.
c) Se disocia de la enzima core (núcleo)
d) Se reasocia con la enzima core.
4) Las secuencias promotoras
a) Deben estar como cadena simple para ser reconocidas por la RNA polimerasa.
b) Todas tienen exactamente la misma secuencia consenso
c) Determinan tanto el lugar como la dirección de inicio de transcripción.
5) La terminación de la transcripción
a) Está desfavorecida por la procesividad de la RNA polimerasa.
b) Está favorecida por la estructura secundaria del RNA transcripto y desfavorecida por la estabilidad
de los heterodúplex RNA/DNA.
c) Puede ser favorecida por interacciones proteína-RNA.
d) Todas las anteriores.
6) La señal de terminación de la transcripción rho-independiente en procariotes posee secuencias de
DNA
a) Ricas en GC seguidas por una secuencia de uracilos.
b) Ricas en GC seguidas por una secuencia de adeninas.
c) Varios codones de terminación.
d) Las secuencias TTGACA y TATATT repetidas cada 17 bases.
e) La secuencia de AAUAAA y una cola de poly-A de un tamaño hasta 250 nucleótidos separadas
por aproximadamente 20 bases.
7) Cuales de las siguientes afirmaciones sobre la expresión de genes en procariotas son correctas
a) Los mRNAs procariotas contienen el transcripto de un único gen
b) Los mRNAs procariotas son traducidos antes de que se complete su síntesis
c) Los mRNA procariotas sufren splicing autocatalítico
d) Todas las anteriores
8) Si Ud quiere determinar la localización precisa del sitio de inicio de transcripción, cuál de los
siguientes ensayos escogería:
a) Southern blot
b) Northern blot
c) Primer extension
d) Dideoxi Secuenciación
e) Ninguno de los anteriores sería útil
9) ¿Qué ensayos utilizaría si quiere determinar los niveles de expresión de una proteína?
a) Southern blot
b) Northern blot
c) Primer extension
d) Dideoxi secuenciación
e) Ninguno de los anteriores sería útil
II-Responda brevemente las siguientes preguntas
A-¿Cómo es la abundancia relativa de los distintos tipos de RNA y su vida media? ¿Cómo estimaría
el tamaño de ese mRNA y los niveles de transcripción de este RNA en diferentes tejidos?
B) ¿Qué es un marco de lectura abierto (ORF) y cómo se lo busca? ¿Cómo se puede saber si se
relaciona con un gen funcional?
C) Haga un esquema mostrando la organización genómica de genes procariotas, indicando la
dirección de transcripción En otro esquema muestre los elementos característicos de un mensajero
procariota. Compárelo con la estructura de un mRNA eucariota.
D) ¿Cuáles son las etapas de la transcripción de un gen procariota típico? ¿Cuál es la velocidad de
estas etapas? Haga un esquema representando los eventos que ocurren en cada etapa. Indique
claramente cuál es la hebra molde y cuál la codificante, polaridad de las mismas y dirección de
transcripción.
¿Cómo es la velocidad de transcripción en relación con la de replicación y traducción?
E) En la micrografía que se muestra a continuación indique:
2
-Hebras de DNA
-RNA
-Ribosomas
-Inicio y fin de cada gen
-Dirección de transcripción
F) Señale las analogías y diferencias:
-Entre los procesos de replicación y
transcripción
-Entre las DNA-polimerasas y RNA-polimerasas en cuanto a la formación del primer enlace
fosfodiéster de la nueva cadena sintetizada (DNA y RNA, respectivamente)
G) Indique cuál será la secuencia del RNA que resulte de la transcripción de una región de DNA cuya
secuencia (en la hebra molde) es:
GGCATTTCGAACACGTACAC
Respuestas:
.1
.2
.3
.4
.5
GGCAUUUCGAACACGUACAC
CACAUGCACAAGCUUUACGG
CCGUAAAGCUUGUGCAUGUG
GUGUACGUGUUCGAAAUGCC
GTGTACGTGTTCGAAATGCC
H) Indique si la siguiente frase es correcta
“La hebra molde de un DNA sufre el proceso de la transcripción para dar un transcripto de RNA. Por
ello, dicha hebra recibe también el nombre de cadena no-codificante, no-informativa, antisentido o
cadena (-).
I) En bacterias los boxes –10 y –35 están separados por aproximadamente dos vueltas de hélice.
¿Cómo se afectará la transcripción si se introduce una deleción en la región promotora moviendo el
box -35 a la posición -29? Explique su respuesta
J) La secuencia de consenso del box -10 es TATAAT. Si se analizan los niveles de expresión de dos
genes A y B que tienen promotores idénticos, excepto por la secuencia box -10 que es TATAAA para
el gen A y ACTGCT para el gen B, ud espera que la relación de los productos de transcripción gen
A/gen B sea mayor o menor que 1.0. ¿Por qué?
K) ¿Cómo funciona la terminación de la transcripción rho independiente?
L) En forma esquemática muestre como ocurre la terminación de la transcripción rho dependiente
Problemas
1
1-Con el fin de determinar zonas importantes
para la expresión del gen grp1.8 de tomate se
realizó un ensayo de de retraso en geles
(EMSA = Electrophoretic Mobility Shift Assay)
empleando fragmentos de una región del
promotor (indicados en la figura) y extractos
de proteínas nucleares de tomate.
a. Explique en qué consiste el ensayo (EMSA
= Electrophoretic Mobility Shift Assay).
b. Indique qué zona/s considera importante/s
para la actividad de dicho promotor
(márquelas en esta hoja) y justifique su
respuesta.
c.¿Qué ensayos realizaría para corroborar la
funcionalidad de la/s region/es del inciso a?
Explique cómo los haría y qué resultados
esperaría obtener.
Figura 1: Ensayo de retraso
en geles
A: Regiones del promotor
grp1.8 empleadas como
sondas.
B: Resultados del ensayo
Figura 2: Ensayo de primer extension. El
ensayo se realizó empleando una preparación
de RNA de tomate como molde ( calle 1) o
plásmido conteniendo una secuencia genómica
del gen grp1.8 (calles C,G,T, A). C, G; T, A3
indica reacciones realizadas en presencia de
ddCTP, ddGTP, ddTTP y ddATP,
respectivamente.
d. Explique cómo prepara el DNA marcado que utiliza en el ensayo.
e.Continuando con los estudios del promotor grp1.8 Ud. realiza un ensayo de "primer extension" para
identificar el sitio de inicio de transcripción. Con este fin emplea un primer que se aparea en la zona
del codón de iniciación del gen codificante para grp1.8. Los resultados obtenidos cuando se emplea
una preparación de RNA total de tomate como molde se muestran en la calle 1 del gel de la figura 2.
e Explique cómo se realiza el ensayo de primer extension
f. Escriba los 10 primeros nucleótidos del mRNA de grp1.8. y dibuje un esquema del ensayo
(indicando mRNA, el ORF, el primer, etc.)
2.
Se estudió la interacción entre el
DNA del bacteriófago T4 y la RNA pol.
Para ello se realizó un ensayo de unión
a filtros de nitrocelulosa en presencia y
ausencia del factor sigma y también a
distintas temperaturas, obteniéndose los
resultados de las figuras.
a) Indique cómo está compuesta la RNA
pol procariota y cúal es el rol de cada
subunidad.
b) Indique cuáles son las mejores
condiciones para la unión de la RNA pol
al promotor.
cpm incorporados/ml
Continuando con estos ensayos se analizó la transcripción
1100
in vitro, empleando también DNA del bacteriófago T4
1000
como molde, la RNA polimerasa núcleo ("core") de E.coli
900
reacción 2
con y sin la subunidad . En ausencia de la subunidad 
800
se observó que no hay síntesis de RNA. Si se agrega 
700
purificado (PM 1.105 Da) a la enzima núcleo (PM 4.105 Da)
600
se recupera la actividad. Se hacen dos experimentos para
500
estudiar el rol de  en la iniciación, la cuál se mide por
400
300
incorporación de 32P a RNA (por precipitación con TCA) en
200
función del tiempo, usando una mezcla de NTPs
reacción 1
100
marcados en .
0
La mezcla de reacción 1 contiene 0,4 g de enzima
0
1
2
3
4
5
"núcleo" y 0,1 g de 
La mezcla 2 contiene 4 g de núcleo y 0,1 g de  .
Tiempo (min)
Ambas mezclas contienen DNA de T4 en exceso y 1 mmol
de 32P NTPs (108 cpm/mmol) en un volumen de 1 ml.
Los resultados de los experimentos (cpm incorporados/ml en función del tiempo de incubación) se
muestran en la figura.
c. ¿Es válido el ensayo como medida de iniciación de síntesis de RNA? ¿Por qué?
d. ¿Cuántas iniciaciones se producen por molécula de enzima núcleo y por molécula de  en cada
reacción? Da 1000 iniciaciones por core, cosa que no cierra con el equilibrio a los 5 min
e. ¿Cuál es el rol de  en la iniciación de la transcripción de acuerdo a estos resultados?
f. ¿Hay evidencias de re-iniciación de síntesis de RNA de acuerdo a estos resultados?
g. Dibuje el gráfico que obtendría en este sistema si la mezcla de reacción tuviera 4 g de enzima
nucleo y 1 g de  .
4
6
7