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1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA II FUNDAMENTOS TEÓRICOS LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE SUSTRATO Y ENZIMA Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como: E + S k1 k-1 [ES] (1) [ES] k2 k-2 E + P (2) De acuerdo a la ecuación (2) la velocidad inicial (Vo) de una reacción catalizada por enzimas estaría determinada por la desaparición del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentración: Sin embargo, k2 y [ES] son difíciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten V = k [ E S ] ( 3 ) o 2 derivaron la ecuación (3) en términos de otras variables que pueden ser medidas experimentalmente: Vo = V ma x [ S ] ( 4) K m + [S ] El efecto de la velocidad al variar la concentración de sustrato [S], mientras se mantiene constante la concentración de enzima [E], se observa en la siguiente gráfica: Vo Vmáx 3 2 -K m 1 [S] Figura 1: Efecto del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática En la Figura 1 observamos que a bajas [S], V0 incrementa casi linealmente con el incremento de la [S] (1). A concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de velocidad inicial en respuesta a los incrementos de la concentración de sustrato son cada vez menores (2). Finalmente alcanzamos un punto donde los aumentos de velocidad son despreciables frente a los incrementos de S. En este momento decimos que la reacción enzimática tiende a velocidad máxima (3). La curva es una hipérbola rectangular que pasa por el origen y, cuyas asíntotas son [S] = -Km y Vo = Vmáx. Las constantes en la ecuación (4) son Vmáx y Km. La Vmáx depende únicamente de la concentración de enzima y Km es independiente de la concentración de enzima y de la concentración de sustrato. Km se define (en la deducción de la ecuación 1 y 2) como el cociente entre la suma de las constantes de disociación del complejo [ES] y las constantes de formación de dicho complejo. k k -1+ 2 K = (5 ) m k 1 Si consideramos en la ecuación de Michaelis-Menten que Vo es igual a 1/2 Vmáx (ecuación 6), se deduce que Km es numéricamente igual a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima (ecuación 7) y por eso se expresa en unidades de sustrato. 2 V max = 2 V m ax [S] K m + [S] = 2 [S] K m + [S] K m = 2 [S] - [S] (6) El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. Cuanto menor es Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. El cálculo de Km se utiliza, por ejemplo, para comparar la afinidad de una misma enzima por sustratos diferentes o de enzimas diferentes por un mismo sustrato (Figura 2). Vo (A) Vmax Vo (B) Vmax Sus trato 1 Enzima 1 ato 2 Sustr Vmáx 2 Vmáx 2 Enzima 1 : Hexoquinasa a 2 Enzima 2 : Glucoquinasa Enzim Enzima: Hexoquinasa Sustrato 1: glucosa Sustrato 2: fructosa Km1 K m2 [S] Sustrato : glucosa K m=1 0,1 mM K m=2 10 mM K m1 [S] Figura 2: Curvas de sustrato. (A)Una enzima con dos sustratos. (B)Dos enzimas con el mismo sustrato. Vo El conocimiento de Vmáx nos da información sobre la cantidad de enzima presente ya que la Vmáx es directamente proporcional a la concentración de enzima. A medida que aumenta la concentración de enzima aumenta el complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la reacción (Figura 3). Cuando se trabaja con concentraciones de sustrato saturantes, toda la enzima está formando el complejo [ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al aumento de la concentración de enzima, es decir que estamos trabajando en condiciones de Vmáx. Si la concentración de [Enzima] sustrato deja de ser saturante el aumento de la actividad deja 3: Efecto de la concentración de enzima en una de ser proporcional, y la velocidad deja de ser máxima (Figura Figura reacción enzimática 3). Teniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la cantidad de enzima presente en una muestra se recurre a la velocidad de la reacción enzimática que cataliza, en condiciones saturantes de sustrato (Vmáx). Cabe aclarar que los kits comerciales están diseñados para medir actividad enzimática dentro de un rango de concentración de enzima. Si la concentración de enzima es demasiado alta, puede suceder que la concentración de sustrato deje de ser saturante y en esos casos lo correcto es diluir la muestra problema y luego repetir la medición. FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad de una enzima se puede expresar en términos de unidades de enzima o unidades internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato en un minuto (µmol/min). La actividad específica es el número de unidades internacionales de enzima por miligramo de proteína (UI/mg de proteína). Asimismo, es útil definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática a saturación. En una reacción michaeliana k cat= Vmáx/[Et]. La kcat, denominada también número de recambio, es una constante de velocidad de primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al número de moléculas de 3 sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molécula de enzima, cuando la misma está saturada de sustrato. Vmáx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmáx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmáx / [Et] MÉTODOS GRÁFICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE LAS ENZIMAS Diversos métodos han sido propuestos para determinar Km y Vmáx en forma gráfica: Hanes- Woolf, Eadie-Hofstee, Lineweaver-Burk, etc. Todos ellos se basan en modificaciones de la ecuación de Michaelis-Menten para que responda a la ecuación de una recta. MÉTODO DE LA DOBLE INVERSA (Lineweaver-Burk) Invirtiendo y reordenando la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene la ecuación de una recta: 1 Vo 1 = V m ax + Km 1 V m ax x ( 8) [ S] Al graficar 1/Vo en función de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la intersección de la recta con la ordenada se obtiene 1/Vmáx y de la intersección de la recta con la abscisa se obtiene –1/Km. Vo Vmax (A) (B) 1 Vo Pendiente = Vmax 2 Km Vmax 1 Vmax Km [S] 1 Km 1 [S] Figura 4: Curvas de sustrato. (A) Representación de la ecuación de Michaelis-Menten (hipébola rectangular). (B) Representación lineal de Lineweaver-Burk (doble recíproca). La ventaja del uso del método de la doble recíproca respecto a los otros métodos gráficos radica en la determinación más precisa de Vmáx y como veremos más adelante será de utilidad en el análisis de la inhibición enzimática. En la actualidad se usan métodos de regresión no lineal que están disponibles en diversos programas para PC, los que por aproximaciones matemáticas sucesivas (iteraciones) encuentran los valores de los parámetros cinéticos. Cabe aclarar que todas las técnicas de cálculo por métodos gráficos son menos precisas que los métodos de regresión no lineal. INHIBICIÓN ENZIMÁTICA Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis disminuyendo la velocidad de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimática, tales como: análogos de sustratos, toxinas, drogas, complejos metálicos, anticoagulantes, etc. Los estudios sobre inhibición enzimática nos dan información sobre las vías metabólicas, una visión acerca de los mecanismos de acción de drogas y toxinas, y una mejor comprensión de los mecanismos de las reacciones enzimáticas. La determinación de Km y Vmáx tiene gran importancia y utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la presencia y tipo de inhibidor. Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles. INHIBIDORES REVERSIBLES 4 1- INHIBICIÓN COMPETITIVA Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unión del sustrato. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del sustrato simplemente añadiendo más sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra la misma V máx que la reacción sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (K´m) (Figura 5). (A) Vmax n Si or ibid h in 1 Vo (B) Co ni nhi bid or Vo idor inhib Con n Si or bid i inh Vmax 2 1 Vmax Km K´m [S] 1 Km 1 [S] 1 K´m Figura Figura 9: 5: Efecto de un inhibidor competitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor. 2- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA Vo (A) Vmax 1 Vo Co ni bidor inhi n i S Vḿax Co Vmax 2 nh ibi do r Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijación del inhibidor puede o no bloquear la fijación del sustrato, pero si este último se une al sitio activo no se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera efectiva la concentración de enzima activa por lo que disminuye la Vmáx aparente (V´máx). Frecuentemente el efecto sobre Km es nulo (Figura 6). n Si 1 r hibido n in (B) r ido b i inh Vḿax 1 Vmax V´max 2 Km [S] 1 Km 1 [S] Figura Figura10: 6: Efecto de un inhibidor no competitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor. 3- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de Km disminuye (como si la enzima tuviera más afinidad por el S). También disminuye la Vmáx ya que el complejo [SEI] es inactivo (Figura 7). 5 Vo (A) Vmax (B) 1 Vo r do ibi h r n n i ido Co nhib ni Si bidor inhi Sin Vḿax ibidor n inh Co Vmax 2 1 Vḿax Vḿax 2 1 Vmax K´m Km [S] 1 Kḿ 1 Km 1 [S] Figura7:11: Efecto de un inhibidor acompetitivo en una reacción enzimática. (A) Curva de sustrato en presencia Figura y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recíproca en presencia y en ausencia del inhibidor. INHIBIDORES IRREVERSIBLES Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy útiles para estudiar los mecanismos de reacción. Estos juegan un papel central en los métodos modernos para obtener nuevos agentes farmacéuticos, proceso que se denomina diseño racional de fármacos. Debido a que el inhibidor se ha diseñado para una enzima específica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo de la enzima, los fármacos basados en este método son con frecuencia muy efectivos y tienen pocos efectos secundarios. Método continuo para la determinación de actividad enzimática Los métodos utilizados para determinar las actividades enzimáticas pueden ser de dos tipos: los métodos Punto Final (como el utilizado hasta aquí) y los métodos Continuos. Abs Un método continuo para la determinación de la actividad de una enzima consiste en la lectura de muchos puntos de datos primarios (podría ser absorbancia o fluorescencia) durante el tiempo que dura la determinación. Si el sustrato o producto de la reacción no presentan absorbancia o fluorescencia fácilmente detectable se emplean reacciones acopladas a la reacción enzimática a determinar. Se utiliza el producto de la reacción como sustrato de una segunda reacción “acoplada” que producirá un cambio que se puede monitorear fácilmente en un espectrofotómetro. A menudo la reacción acoplada también está catalizada por una enzima. Esta reacción no debe ser limitante de la velocidad, lo que se logra agregando una gran cantidad de la enzima que cataliza la reacción acoplada, para que todo el producto formado por la primera reacción sea consumido en la reacción acoplada inmediatamente después de su formación. En la mayoría de los casos las reacciones enzimáticas se acoplan a una segunda reacción en la que interviene una enzima que tiene como cofactor al NAD+ o al NADH. Como resultado de estas reacciones acopladas la concentración de NADH 100 irá disminuyendo o aumentando en función del 80 tiempo, en forma proporcional a la aparición del producto de la primera reacción. 60 NADH + H+ NAD+ + 2H+ + 2 e- El cofactor tiene un espectro de absorción diferente en su forma oxidada (NAD+) o en su forma reducida (NADH) (ver Figura 8). La concentración de NADH se puede determinar espectrofotométricamente siguiendo el cambio de absorbancia a 340 nm. NADH + H+ 40 20 NAD + 0 220 260 300 340 380 Longitud de onda (nm) Figura 8. Espectro de absorción del NAD+ y NADH. 6 Objetivos del Trabajo Práctico: 1) Determinar las constantes cinéticas, Vmáx y Km, de la ureasa de soja. 2) Analizar el efecto de inhibidores sobre las constantes cinéticas de la ureasa de soja. 3) Medir la actividad enzimática de ureasa por un método continuo. PARTE EXPERIMENTAL IMPORTANTE: repasar todos los conceptos del práctico Nº3 (Cinética Enzimática I) y los resultados obtenidos y discutidos en el laboratorio. Traer delantal, papel milimetrado, calculadora, marcador indeleble para tubos, lápiz, regla, y goma de borrar a la clase de laboratorio. 1) Determinación de constantes cinéticas de la ureasa de soja La actividad de ureasa de soja se determinará con distintas concentraciones de sustrato por el método de punto final ensayado en el práctico anterior (repasar los fundamentos del método y los ensayos realizados). El siguiente protocolo experimental se seguirá para determinar las velocidades iniciales para diferentes concentraciones de sustrato, utilizando para ello la [E], el pH, la temperatura y el tiempo de incubación considerados más adecuados según los resultados del práctico anterior. Curva de sustrato TUBO UREA 5 mM B -------- BUFFER pH: 7 ENZIMA dil ........ 0,8 ml 0,2 ml Incubar Reactivo 37oC A 10 ' Reactivo B Incubar 37oC 2 ml 2 ml 20 ' 1 0,1 ml 0,7 ml " " " " " 2 0,2 ml 0,6 ml " " " " " 3 0,3 ml 0,5 ml " " " " " 4 0,4 ml 0,4 ml " " " " " 5 0,5 ml 0,3 ml " " " " " 6 0,6 ml 0,2 ml " " " " " 7 0,7 ml 0,1 ml " " " " " Abs. 540 nm Calcular la concentración de urea en cada tubo teniendo en cuenta la concentración de la solución de trabajo de urea (5 mM) y las diluciones realizadas. Calcular los moles de producto formado con las absorbancias obtenidas, usando la curva patrón para amoníaco (ver Guía TPN 3). Dividiendo estos valores en el tiempo de incubación, obtener los valores de velocidad inicial ( Vo ). Graficar Vo en función de la concentración de sustrato. Calcular las inversas de Vo y [S] y determinar las constantes cinéticas con el método gráfico de Lineweaver-Burk (doble inversa). 2) Determinación de constantes cinéticas de la ureasa de soja en presencia de inhibidores Para ello se realizarán curvas de sustrato en presencia de distintos inhibidores de la enzima. Los inhibidores usados serán: Cloruro de Guanidina: Solución 20 mM en buffer fosfato-citrato 10 mM, pH 7 Glicina: Solución 20 mM en buffer fosfato-citrato 10 mM, pH 7 CuCl2: Solución 1 M en ácido clorhídrico 10 mM H2N N H -C H -C O O H 2 2 C = NH H2N Guanidina G lic in a 7 Curvas de sustrato en presencia de Inhibidores TUBO B 5 mM Inhibidor BUFFER pH: 7 X mM -------- 0,1 ml UREA ENZIMA dil X 0,7 ml 0,2 ml Incubar Reactivo Reactivo Incubar 37oC A B 37oC 10 ' 2 ml 2 ml 20 ' 1 0,1 ml " 0,6 ml " " " " " 2 0,2 ml " 0,5 ml " " " " " 3 0,3 ml " 0,4 ml " " " " " 4 0,4 ml " 0,3 ml " " " " " 5 0,5 ml " 0,2 ml " " " " " 6 0,6 ml " 0,1 ml " " " " " 7 0,7 ml " 0 ml " " " " " Abs. 540 nm Calcular las Vo y las [S] según se indica en el apartado anterior. Graficar. Determinar las constantes cinéticas en presencia de los inhibidores, aplicando el método de Lineweaver-Burk. Determinar el tipo de inhibición en cada caso comparando los valores de las constantes en presencia y ausencia de los inhibidores. 3) Fundamentos del método continuo para la determinación de la actividad de ureasa La determinación de la actividad de ureasa se basa en el siguiente esquema de reacción: ureasa urea + H2O 2 NH3 + CO2 GlDH NH3 + NADH + H+ + 2-oxoglutarato L-glutamato + NAD+ + H2O La actividad de la ureasa es proporcional al consumo de NADH, que se sigue por disminución de la absorbancia a 340 nm. PROCEDIMIENTO a) Determinación de la actividad de ureasa. 1- Llevar a cero el espectrofotómetro con un blanco de agua destilada. Equilibrar los reactivos a la temperatura de trabajo (37ºC). 2- En una cubeta colocar 1 ml de Reactivo de Trabajo y medir la abs. 340 nm. 3- Agregar 20 l de sustrato, mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente un cronómetro. 4- Tomar una lectura de absorbancia inmediatamente (T0) y continuar tomando los valores de absorbancia cada 1 min durante 10 min. 5- Graficar los valores de absorbancia en función del tiempo y calcular la Vo a partir de la pendiente, usando el coeficiente de extinción mmolar del NADH (NADH: 6,22 mM-1 cm-1). Comparar y discutir las ventajas y desventajas de este procedimiento con respecto al método de punto final para la determinación de actividad de la ureasa de soja (por cuantificación de amoníaco formado) utilizado en los Trabajos Prácticos Nº 3 y 4. b) Efecto de inhibidores. Se sabe que los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la acción de la ureasa. Probaremos el efecto inhibitorio del mismo repitiendo una reacción como la de a) en la que se agrega 100 mM NaF antes del agregado de urea. Comparar con la reacción no inhibida mediante gráficos y numéricamente. Reactivos (almacenar en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento): Sustrato: solución de urea 15 mM. Buffer: solución de buffer Goods 100 mmol/l, pH 7,9. Liofilizado: viales conteniendo 2-oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato deshidrogenasa (GlDH). Para preparar el Reactivo de Trabajo disolver el contenido de un vial de liofilizado en un frasco de buffer. Mezclar suavemente por inversión hasta disolución completa, evitando la formación de espuma, y fechar. Una vez preparado el Reactivo de Trabajo es estable 30 días en refrigerador (2 a 10ºC). El Reactivo de Trabajo se deteriora y debe descartarse cuando las lecturas de Absorbancia a 340 nm contra agua son inferiores a 1. El método cinético continuo que ensayamos en el práctico es una adaptación del que se utiliza en los laboratorios de análisis clínicos para la determinación de urea en suero o plasma (Urea cinética AA. Wiener Laboratorios SAIC. Riobamba 2944, 2000, Rosario, Arg. www.wienerlab.com.ar).