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Distintas estrategias para obtener Prunus transgénicos resistentes a sharka N. Alburquerque, L. Faize, L. Nortes, L. Burgos 1 Departamento de Mejora de Frutales, CEBAS-CSIC. Aptd. 164, 30100 Murcia. e-mail: [email protected] La enfermedad causada por el virus de la sharka (Plum pox virus, PPV) produce graves daños a los frutales del género Prunus y afecta seriamente la producción. El objetivo del estudio ha sido obtener plantas de albaricoquero y de ciruelo resistentes al virus de la sharka mediante distintas estrategias biotecnológicas. Por una parte, se ha utilizado una construcción diseñada para silenciar genes del virus de la sharka, que ha sido probada con éxito en tabaco y en ciruelo, para obtener plantas de albaricoquero resistentes a la enfermedad. Se infectaron secciones de hipocotilos de semillas maduras de la variedad ‘Canino’ con la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens portando el vector binario h-UTR/P1 (Di Nicola-Negri et al., 2005), siguiendo un protocolo previamente descrito (Wang et al., 2011). Este vector genera un ARNm autocomplementario que contiene, además de la región no traducible 5’ del PPV-M ISPaVe44, parte del gen P1 (nt 1-733). Se obtuvieron líneas transgénicas según un análisis PCR. Por otra parte, los microARNs (miRNAs) están constituidos por ARN de cadena simple de entre 20-24 nucleótidos. Son generados a partir de precursores (pre-miRNA) más largos y reclutados por el complejo RISC, el cual degrada de manera específica una secuencia de ARN mensajero. Tratando de explorar nuevas estrategias para conseguir plantas resistentes a sharka, el grupo de la Dra. Carmen Simón ha diseñado construcciones moleculares introduciendo en estructuras premiRNAs secuencias complementarias del virus: de la región de la replicasa (amiR-C), la región de la cápsida del virus (amiR-D) o ambas (amiR-CD). Estas construcciones se han probado con éxito en plantas transformadas de Nicotiana benthamiana. En este trabajo hemos utilizado la construcción que expresa los amiRNA-CD para producir plantas transgénicas a partir de hipocotilos de semillas de ciruelo europeo (Petri et al., 2008). Se han obtenido distintas líneas y se ha confirmado la presencia de los transgenes mediante PCR. Para la evaluación in vitro, ápices de todas las líneas transformadas se injertarán sobre brotes de melocotonero GF-305 infectados con el virus de la sharka, y mantenidos in vitro (GarcíaAlmodovar et al., 2015). Referencias Di Nicola-Negri, E., Brunetti, A., Tavazza, M., Ilardi, V., 2005. Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus. Transgenic Res. 14, 989-994. García-Almodovar, R.C., Clemente-Moreno, M.J., Díaz-Vivancos, P., Petri, C., Rubio, M., Padilla, I.M.G., Ilardi, V., Burgos, L., 2015. Greenhouse evaluation confirms in vitro sharka resistance of genetically engineered h-UTR/P1 plum plants. Plant Cell Tiss Organ Cult 120, 791-796. Petri, C., Webb, K., Hily, J.M., Dardick, C., Scorza, R., 2008. High transformation efficiency in plum ( Prunus domestica L.): a new tool for functional genomics studies in Prunus spp. Mol. Breeding 22, 581591. Wang, H., Alburquerque, N., Burgos, L., Petri, C., 2011. Adventitious shoot regeneration from hypocotyl slices of mature apricot (Prunus armeniaca L.) seeds: A feasible alternative for apricot genetic engineering. Sci. Hortic. -Amsterdam 128, 457-464.
