Download El termino electroforesis se refiere a una técnica separativa que

Tarea Promocional N° 3
Electroforesis de
Proteínas
Plasmáticas.
Grupo 13
Profesor: Juan Luis Zarza
Año: 2014
Introducción
El termino electroforesis se refiere a una técnica separativa que
emplea un campo eléctrico aplicado que actúa sobre partículas
cargadas causando su movimiento a través de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por
Tiselius en 1937, quien desarrollo el concepto de frente móvil
(moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis
de zona y se usó para separar proteínas en solución.
Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis,
aplicándose a diversas moléculas, desde proteínas grandes hasta
aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis de zona se
sumaron además el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas
en diferentes propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis
separados a una misma muestra o bien propiedades físicas. Esto
permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien
realizar combinaciones de métodos.
La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las
matrices empleadas en cada una, que brindan ventajas
comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar.
Asi, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es
fácil de usar dado que no es necesaria una preparación previa, pero
con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices tipo gel. Smithies
en 1955 introdujo el uso de geles de almidón y dos años más tarde
Kohn uso acetato de celulosa. En 1959 Ornstein y Davis y Raymond
y Weintraub usan un gel de poliacrilamida. Los capilares fueron
introducidos por Jorgenson y Lukacs a principios de los 80.
Las técnicas de detección han evolucionado con los años también.
Algunas de estas técnicas incluyen teñido químico, técnicas
inmunoelectroforeticas, análisis bidimensional y varias técnicas de
inmovilización en membranas.
Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de
muestras biológicas, es ampliamente usada en análisis de DNA y
en la investigación biológica.
Principio General
La electroforesis separa partículas en base al movimiento inducido
por un campo eléctrico. El campo eléctrico resulta en la aplicación
de una fuerza sobre las partículas que es proporcional a su carga o
potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad
diferente en las distintas macromoléculas. En otras palabras, si se
aplica un campo eléctrico durante un periodo de tiempo dado a
través de una matriz que contiene una mezcla de macromoléculas
con diferentes potenciales de superficie, las moléculas estarán en
diferentes lugares al detener el campo.
El estudio del movimiento electroforético se enfoca en el potencial
eléctrico en la superficie de la macromolécula, y la relación de ese
potencial con la velocidad del objeto en el campo eléctrico. El
potencial de superficie está causado por la interacción de la
superficie de la molécula con el medio que la rodea.
• Consiste en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de
un campo eléctrico, produciendo la migración de las partículas
hacia el ánodo o el cátodo (electrodos – y +) en dependencia de
su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
• Es un método de alta sensibilidad, poder de resolución y
versatilidad. Aporta un potente criterio de pureza.
• Permite evaluar las características acido básicas de las proteínas
presentes en un extracto crudo.
• Permite determinar peso molecular, punto isoeléctrico y numero
de cadenas polipeptídicas.
Tipos de análisis electroforético
Los diferentes tipo de análisis pueden ser distinguidos por las
propiedades físicas de la muestra que se van a emplear para su
separación o por el tipo de matriz usadas. Los cuatro tipos básicos
que se fundamentan en diferentes propiedades físicas son: límite
móvil, electroforesis de zona, isoelectroenfoque e isotacoforesis.
Limite Móvil: en este método la muestra se coloca en una solución
buffer en un tubo con forma de U. Se aplica un campo eléctrico por
medio de electrodos sumergidos en cada extremo del tubo. Las
partículas de la muestra pueden entonces migrar en relación al
campo eléctrico. Este método unas solamente la carga de la
partícula y el potencial Z resultante cuando la muestra se encuentra
en contacto con el buffer. La dirección y la velocidad de la migración
están determinada por la movilidad electroforética de cada
componente.
Electroforesis de Zona: esta es la forma más practicada de
electroforesis. Este método es parecido al límite de movilidad dado
que cada componente migra de acuerdo con su propia movilidad.
La gran diferencia es que se realiza sobre un medio de soporte para
lograr la completa separación de cada componente. Otra de las
diferencias es que la muestra es aplicada en una banda angosta o
zona. En la electroforesis de límite móvil los componentes tienden a
mezclarse debido a convección causada por gradientes de
densidad o temperatura o por vibraciones mecánicas.
A través del uso de soportes estos problemas son minimizados. Los
medios más comunes son geles papel o capilares.
En la electroforesis de zona los componentes son aplicados en una
banda angosta rodeada por buffer. Se aplica un campo eléctrico y
cada banda migra con una velocidad característica determinada por
su movilidad electroforética. Cada componente separa de su vecino
para formar una zona pura. Las zonas puras se estabilizan por
medio del soporte, que previene el mezclado debido a corrientes de
convección.
Los extremos del tubo o de las placas se sumergen en un buffer
apropiado y luego se aplica el campo eléctrico para comenzar el
proceso separativo, este método da una rápida idea de la cantidad
de componentes que tiene una mezcla biológica.
Isoelectroenfoque: separa componentes usando un gradiente de
pH. El gradiente va desde un pH bajo en el ánodo hasta que
encuentre un pH igual a su punto isoeléctrico, donde la carga neta
es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes
se detienen se llega al estado estacionario. Se usan geles como
soporte, lo que minimiza la difusión una vez que se llega al estado
estacionario y el campo eléctrico es eliminado. La clave del método
es lograr un buen gradiente de pH.
Isotacoforesis: Electroforesis a velocidad uniforme tiempo
transcurrido en el capilar bajo condiciones isotacóforeticas es
independiente de la velocidad. Se basa en la separación por
desplazamiento.
El capilar se debe llenar de un electrolito líder, éste debe tener una
gran movilidad, mayor a la de los componentes a separar, luego se
introduce un electrolito terminal, de movilidad menor a la muestra.
Objetivos
GENERAL
Aplicar de manera teórica y experimental el análisis de proteínas
plasmáticas, valiéndose de técnicas como la electroforesis.
ESPECÍFICOS
Aplicar los conocimientos adquiridos en la práctica experimental.
Utilizar de manera adecuada e identificar los diferentes equipos,
implementos y reactivos del laboratorio.
Analizar y justificar de acuerdo a las propiedades de las proteínas y
los resultados obtenidos.
Conocer y estudiar aplicaciones clínicas y bioquímicas en las que
son útiles estas técnicas de separación.
Identificar las ventajas de los diferentes métodos de separación.
Desarrollo
1- Velocidad de migración
La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente
proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente
de potencial eléctrico (E) e inversamente al coeficiente de fricción
(f) según la forma y el tamaño de la partícula.
V= q E / f
2- Movilidad electroforética:
La movilidad electroforética (me) es un caso particular de la
velocidad de migración de un ion, cuando se aplica un campo
eléctrico de 1 V/cm. Su signo es igual a la de la carga de la
partícula.
La movilidad, µ se define como la velocidad que toma la partícula
por unidad de campo.
µ= v/E = q/f
q.E=𝑭𝐟
q.E=6𝝅nr v
v=q.E / 6𝝅nr
µ=v/E = q/6𝝅
Factores que influyen en la movilidad electroforética
 Densidad de carga de la molécula (relación carga / peso)
 Voltaje aplicado
 Porosidad del gel de electroforesis
 Punto isoeléctrico: Por debajo la partícula tiene carga (+ ) y migra
hacia el cátodo. Por debajo la partícula tiene carga (–) y migra
hacia el ánodo
Actúan también dos fuerzas adicionales:
- Fricción con el solvente (dificulta el movimiento)
- Movimiento browniano (el movimiento molecular es aleatorio,
por EK propia)
La sumatoria de fuerzas provoca que las moléculas no migren de
manera homogénea. Los iones comienzan a moverse formando un
frente cuya anchura aumentará con el tiempo.
Si se aumenta la intensidad del campo eléctrico, se puede acelerar
la migración sin variar la difusión del frente, provocando que este
sea más compacto, esto mejora la definición del mismo. Esto está
limitado por la capacidad de la solución para disipar el calor
generado por paso de la corriente eléctrica.
La presencia del gel hace que las moléculas de mayor tamaño
sufran mayor resistencia al avanzar por los poros del gel que las
moléculas más pequeñas.
El solvente puede producir una fricción diferente sobre distintas
moléculas, pero este efecto es despreciable cuando no existe el
entramado del gel.
Factores que influyen en la electroforesis
3- Medios de soporte para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte,
principalmente para evitar perturbaciones mecánicas y corrientes de
convección durante la separación. En algunos soportes (papel o
similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo
de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de
separación es la magnitud de la carga de cada componente de la
muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o
gelatinosos) están formados por polímeros que forman una malla,
matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las
moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de
soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y
los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la
separación.
Medios de baja fricción
papel
acetato de celulosa
separación principalmente
por carga
Medios de elevada fricción
gel de
almidón
gel de
agarosa
gel de poliacrilamida
gel de
agarosa+poliacrilamida
separación por carga, tamaño y forma
Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos
hidroxilo de la celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce
la adsorción; baja tinción de fondo; es posible transparentarla o
disolverla para detectar y recuperar los componentes separados.
Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un
tampón caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido
sustituido por la poliacrilamida.
Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición
similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar
solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de
una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la
concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas
porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.
Disposición del soporte
En papel, para aminoácidos u otras moléculas pequeñas, y en
soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para
proteínas.
En gel de almidón o de agarosa, para proteínas y especialmente
para ácidos nucleicos. Casi siempre el tampón cubre el gel (para
evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la
corriente).
Soporte impregnado de disolución tampón por capilaridad, disuelve
la muestra y mantiene el contacto eléctrico.
Se aplica la muestra depositándola (pipeta o aplicador específico)
como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa)
o dentro de un “pocillo” creado en el gel.
FUENTE DE PODER:
La corriente eléctrica es suministrada por una fuente rectificadora
de onda completa que transforma la corriente alternada de 220 V y
50 ciclos por segundo en corriente continua purificada.
CÁMARA DE SEPARACIÓN:
Las cubas electroforéticas consisten en cubetas de poliestireno
tabicadas con planchas de poliestireno de alto impacto y electrodos
de platino.
PROTEÍNOGRAMA
Análisis de proteínas plasmáticas en suero humano utilizando
electroforesis en papel de celulosa.
El objetivo de esta técnica es poder analizar de forma rápida la
presencia de proteínas plasmáticas que podemos encontrar en
una muestra de suero sanguíneo
Protocolo de laboratorio:
Reactivos:
Solución buffer: Buffer Borato-Acetato
pH= 8.6
Solución colorante:
Negro Amido:
Amidoschwartz 0.5 g.
Alcohol metílico 45 ml
Agua destilada 45 ml
Ácido acético 10 ml
Líquido Lavado
Alcohol metílico 250ml….62.5 ml
Agua destilada 225ml…56.25 ml
Ácido acético 25ml…..6.25 ml
Líquido de Elución:
Alcohol metílico 50%
Agua destilada 50%
Líquido de transparentización:
Alcohol metílico 16ml
Ácido acético 4ml
Revelado o detección
Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se
unan a las proteínas.
Suelen ser colorantes orgánicos que interaccionan con las proteínas
de forma poco selectiva, principalmente electrostática. Ejemplos:
azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau.
Preparación
La sangre entera, está compuesta de agua, proteínas, electrolitos y
células o elementos formes como las células blancas que son los
encargados de la defensa, las plaquetas encargadas de la
coagulación, y los hematíes o eritrocitos (células rojas), encargados
de transportar el O2 a los tejidos.
El suero (porción líquida de la sangre que contiene a los electrolitos,
agua y proteínas) se obtiene dejando coagular la sangre entera,
unos minutos en un tubo de ensayo. Luego se divisaran dos fases,
un decantado (coágulo) que corresponde a la fase semisólida
celular. El sobrenadante (suero) se extrae con una pipeta Pasteur.
Descripción de las proteínas plasmáticas:
Albúmina
Globulina Alfa 1
Globulina alfa 2
Globulina Beta
Globulina gamma
Técnica:
1. Unos 10 o 15 minutos antes de utilizar las tiras de cellogel se las
suspenden en un recipiente que contenga la solucion buffer.
La tira de cellogel presenta un lado con la superficie más opaca
que es el de la parte superior y es en el que se realiza la siembra
de la muestra, y otro más brillante que se sitúa en el lado inferior
2. Se remueve el exceso de líquido entre dos hojas de papel
absorbente.
3. Se procede a la siembra del suero, colocándolo de una manera
que quede a dos cm. del cátodo. Y de tal modo que la cara mate
quede hacia arriba Cuando se realiza la siembra, con el hansa
de 3 micro litros, se debe tener la consideración de que esta no
tiene que estar sobre cargada y además no debe efectuarse
mucha presión sobre el cellogel.
4. Se extiende sobre el soporte de la cuba electroforética, la misma
debe quedar tensa y plana.
5. Se lleva el soporte a la cubeta teniendo en cuenta que los
extremos de las tiras deben tener contacto con el buffer de la
cuba. Se conecta el aparato con un voltaje fijo de 200 V por
aproximadamente 30 minutos.
6. Una vez finalizada la electroforesis, se deja escurrir la tira sin
secar y se sumerge en la solución colorante durante 5 minutos.
Seguidamente se lava 3 a 4 veces con el líquido de lavado.
7. Una vez que el lavado se terminó, se procede a colocar el
eluyente, y por último se procede al transparentado, el cual
permite otorgar a el cellogel un aspecto transparente. Para
posterior secado en estufa a 60ºC por 3 minutos.
8. Después se procede a la determinación cuantitativa cortando las
fracciones coloreadas e introduciéndolas en tubos de ensayos
preparados en serie de 5. se coloca a cada tubo 3 ml del
eluyente.
9. Se lee en fotocolorimetro a 620nm. O bien por medio de un
densímetro que permite cuantificar las proteínas además de
graficarlas en función de su concentración en suero.
Bibliografía
Maidana, J. Armando, Zarza, Juan Luis y col. (Compiladores). Práctico de
Electroforesis. Guías Unificadas del Departamento de Física Ed. Universitaria
2008
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003540.htm
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/6798/mod_resource/content/0
/Electroforesis.pdf
Raymond A. Serway, John W. Jewett Jr, Física para Ciencias e Ingenierías, Vol. II, Sexta
Edición 2004 Ed. Thomson