Download protocolo de las pruebas bioquicas-1

UNIVERSIDAD DEL MAR
REPORTE DE PRÁCTICA
“PRUEBAS BIOQUÍMICAS”
Biología de procariotas
TITULAR: M.C. Francisco Ruiz Ruiz
Equipo 2: Karen Monterola Noyola
Jennifer Abascal Vásquez
Fecha: Junio del 2010
INTRODUCCIÓN
El tratamiento eficaz de las aguas ha sido el factor más importante que ha
determinado los avances realizados en la salud pública en el último siglo. La
potabilización de las aguas permite el consumo general de agua libre de
microorganismos patógenos y de muchos compuestos químicos indeseables.
El agua limpia y potable es absolutamente esencial para la salud pública,
debemos por tanto disponer de métodos para conseguir agua de calidad, así
como protocolos para valorar la efectividad de los métodos químicos y biológicos
empleados para tratar el agua. Lamentablemente la calidad del agua puede
fácilmente verse alterada, lo que produce la transmisión de enfermedades
infecciosas muy graves que incluso pueden comprometer la vida del ser humano.
Mientras que la presencia de unos pocos microorganismos no patógenos en el
agua puede ser tolerable, la presencia de organismos indicadores específicos
puede indicar que esa agua puede estar contaminada con patógenos. Estos
organismos indicadores que generalmente están asociados con el tracto intestinal;
su presencia indica contaminación fecal en la fuente de esa agua. Los
microorganismos indicadores mas ampliamente empleados como indicadores son
los coliformes.
Los coliformes se usan como indicadores de contaminación en el agua por que se
encuentran en gran número en el tracto intestinal de humanos y animales. Los
coliformes se definen en la bacteriología del agua como bacterias en forma de
varilla, no esporuladas, Gram negativas, aeróbicas o aeróbicas facultativas que
fermentan la lactosa con producción de gas cuando se encuban a 35° C durante
48 hrs. Sin embrago esta clasificación no tiene carácter taxonómico y por ello
dentro de los coliformes se incluyen una gran variedad de microorganismos,
siendo la mayoría pertenecientes al grupo de las bacterias esféricas; por ejemplo,
el grupo de los coliformes como el organismo Escherichia coli, un microorganismo
intestinal muy común, Klebsiella pneumonia, un patógeno intestinal menos
habitual. Sin embargo, Enterobacter aerogenes, un organismo generalmente no
asociado con el intestino, también es clasificado dentro de los coliformes debido a
sus características fermentadoras. En general podemos decir que la presencia de
coliformes en una muestra de agua indica contaminación fecal y hace que dicha
agua no sea apta para el consumo humano.
El abastecimiento de agua para uso y consumo humano con calidad adecuada es
fundamental para prevenir y evitar la transmisión de enfermedades
gastrointestinales y otras, para lo cual se requiere establecer límites permisibles
en cuanto a sus características microbiológicas, físicas, organolép-ticas, químicas
y radiactivas. Con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua en los
sistemas se somete a efectos de potabilización en donde se tienen que seguir las
normas mexicanas que avalen que el agua puede ser consumida sin problema
alguno de sufrir alguna enfermedad.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-179-SSA1-1998, VIGILANCIA Y EVALUACION DEL
CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO, DISTRIBUIDA POR
SISTEMAS DE ABASTECIMIENTO PÚBLICO
Programa de Análisis de Calidad del Agua. Debe incluir como mínimo lo especificado en la
Tabla 1 de esta Norma.
DETERMINACION DE CLORO RESIDUAL LIBRE EN RED DE DISTRIBUCION
POBLACION ABASTECIDA No. MUESTRAS POR NUMERO FRECUENCIA
DE HABITANTES
DE HABITANTES
<2 500
1/<2 500
semanal
2 501-50 000
1/5 000
semanal
50 001-500 000
5/50 000
semanal
>500 000
1/50 000
diaria
EXAMEN MICROBIOLOGICO EN RED DE DISTRIBUCION
POBLACION ABASTECIDA No. MUESTRAS POR NUMERO FRECUENCIA
DE HABITANTES
DE HABITANTES
<50 000
1/<50 000
semanal
50 001-500 000
1/50 000
semanal
>500 000
1/250 000
diaria
ANALISIS FISICOQUIMICO Y EXAMEN MICROBIOLOGICO
SITIO DE MUESTREO
NUM. DE FRECUENCIA
MUESTRAS
PARAMETROS
DETERMINAR
A
En la entrada a red de
distribución proveniente de:
Fuente de
superficial
abastecimiento 1
Trimestral
Ver
Apéndice
Normativo 1
Fuente de
subterránea
abastecimiento 1
Semestral
Ver
Apéndice
Normativo 1
Mezcla de dos o más tipos de 1
fuentes
y/o
tanque
de
almacenamiento y regulación
Semestral
Ver
Apéndice
(Trimestral
si Normativo 1
incluye fuentes
superficiales)
Planta potabilizadora
Trimestral
1
Ver Apéndice
Nota 1.- El agua en la red de distribución, incluyendo los puntos más alejados, debe
contener cloro residual libre entre los límites de 0,2 a 1,5 mg/l (de conformidad con la
NOM-127-SSA1-1994).
Nota 2.- Cuando se especifica frecuencia diaria, se debe entender que incluye los siete
días de la semana.
Nota 3.- El examen microbiológico debe incluir la determinación de organismos coliformes
totales1 y E. coli o coliformes fecales u organismos termotolerantes2 (de conformidad con
la NOM-127-SSA1-1994).
1
Los organismos coliformes totales no deben ser detectables en ninguna muestra de 100
ml; en sistemas de abastecimiento de localidades con una población mayor de 50 000
habitantes; estos organismos, deberán estar ausentes en el 95% de las muestras tomadas
en un mismo sitio de la red de distribución, durante un periodo de doce meses de un
mismo año.
2
El agua abastecida por el sistema de distribución no debe contener E. coli o coliformes
fecales u organismos termotolerantes en ninguna muestra de 100 ml.
ESTANDARES DE AGUA POTABLE EN MEXICO
CARACTERISTICA
LIMITE
PERMISIBLE
Organismos coliformes totales
Ausencia o no
detectables
E. coli o coliformes fecales u organismos
termotolerantes
Ausencia o no
detectables
El agua abastecida por el sistema de distribución no debe contener E. coli en
ninguna muestra de 100 ml. Los organismos coliformes totales no deben ser
detectables en ninguna muestra de 100 ml; en sistemas de abastecimiento de
localidades con una población mayor de 50 000 habitantes, estos organismos,
deberá estar ausentes en el 95% de las muestras tomadas durante cualquier
período de doce meses (http://www.bvsde.paho.org/legislacion/mexico/nom-127ssai.pdf).
En el caso de llegar a encontrar coliformes en el agua para consumo humano se
realizan pruebas bioquímicas son un útil instrumento para el investigador, ya que
mediante diferentes procedimientos de detección de metabolitos o productos de
excreción bacteriana, puede haber una identificación bacteriana que se
encuentre presente. Existen diversos tipos de pruebas y se pueden utilizar según
el criterio propio del investigador:




Fermentación de carbohidratos: Esta prueba determina la capacidad que
tiene un microorganismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un
medio básico o ácido, lo que indica el resultado de la prueba será el color
que se observe en las colonias bacterianas ya que hayan sido sembradas,
un color amarillo significara positivo, un color naranja indica retardamiento
en la prueba y un color rosa-rojizo indicara que la pruebas es negativa. El
medio que se utiliza es líquido, la forma de inocular es con un hisopo estéril
y por supuesto no debemos olvidar que las colonias que se vayan a
sembrar deben ser colonias de cultivos puros.
Catalasa: Esta prueba de lo que se trata es de verificar si existe o no la
enzima catalasa en la bacteria que esta siendo investigada, esta enzima lo
que hace dentro de la bacteria es descomponer el peróxido de hidrogeno
en oxigeno y agua. La prueba se puede realizar de dos maneras, en un
tubo de ensaye con medio.
Licuefacción de la gelatina: determinar la capacidad de un organismo de
producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasa) que licue la gelatina.
Pruebas de motilidad: Las bacterias tienen motilidad por medio de sus
flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo
algunas formas de cocos son móviles, la prueba quiere dar a conocer si el
tipo de organismo del que hablamos es móvil.
Metodología
Pruebas bioquímicas, las cuales permiten identificar con alto grado de precisión la
mayoría de las cepas, clínicamente alto grado de precisión. Además este método
se han empleado para subdividirse los grupos de microorganismos mas allá del
nivel de especie, principalmente con fines epidemiológicos p. ej., para determinar
si un grupo de microorganismos pertenecientes al mismo genero y especie
comparten un origen común o bien proceden de fuentes distintas). Estas técnicas
son conocidas como determinación biotipo o biotipado. (Microbiología- medicamurray)
Estos métodos son utilizados frecuentemente ya que permiten identificar la
ausencia de unos marcadores bioquímicos específicos (p. ej., capacidad de la
fermentación de hidratos de carbono específicos a la utilización de diferentes
compuestos como fuente de carbono para poder proliferar; presencia de
proteasas, lipasas o nucleasas específicas: o presencia de enzimas hidróliticas
específicas como lipasas y nucleasas. (Microbiología- medica-Murray)
Con frecuencia en las especies se necesita saber su actividad química
(http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas)
en un medio de cultivo previamente preparado para definir los diferentes tipos de
reacciones que la cepa tendrá.
Algunos ejemplos de pruebas bioquímicas realizados en el laboratorio de
procariotas:
Pruebas de motilidad
Principios:
a) Determina si un organismo es móvil o inmóvil.
b) Las bacterias tienen motilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran
principalmente entre los bacilos (bacterias en forma de bastones) sin embargo
algunas formas de cocos son móviles pueden concentrarse un solo flagelo o
muchos ; además de localización varia con la especie bacteriana con motilidad
producen variantes móviles, los organismos no son móviles carecen de flagelos.
(Faddlin Jean).
Forma de preparar:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Pesar las cantidades exactas, Nacl 0.5g, agar 2.3, extracto y levadura 0.3
Rehidratar con aguas destilada.
Calentar suavemente hasta su disolución.
Distribuir en tubos 5ml aproximadamente.
Esterilizar en la autoclave a 121o, 15 libras, 15 min.
Dejar enfriar el medio en posición vertical.
Inoculación.
Crecimiento
Observación de pruebas
Pruebas de catalasa
Principio: Comprobar la presencia de la enzima catalasa.
Bases químicas:
La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas que contienen citocromo; la excepción principal es
Streptococcus. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema citocromo
carecen también de la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el
peróxido de hidrogeno. La mayoría de las bacterias anaerobias (por ejemplo;
especies de clostridium) poseen la enzima peroxidasa en lugar de la catalasa.
Forma de preparar:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Pesar las cantidades exactas,
Rehidratar con aguas destilada.
Calentar suavemente hasta su disolución.
Distribuir en tubos 5ml aproximadamente.
Esterilizar en la autoclave a 121o, 15 libras, 15 min.
Dejar enfriar el medio en posición vertical.
7. Inoculación.
8. Crecimiento
9. Observación de pruebas
Fermentación de carbohidratos
Principio:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar (degradar) un hidrato
de carbono especifico incorporado a un medio básico, produciendo acido, o
acido con gas visible.
Bases químicas:
Fermentación en el grupo coliforme
A menudo se hace referencia al grupo coliforme como fermentados de ácidos
mixtos, fermentados del acido fórmico o bacterias colon-disentería-tifoidea. La
fermentación acido mixta es característica de los miembros enterobacteceae y
estos organismos degradan la glucosa con la variedad de productos finales. el
grupo coliforme puede ser subdividido en dos categorías: 1) las que producen
diversos productos ácidos mixtos y 2) las que producen butilenglicol como
principal producto final. El tipo o las combinaciones de cantidades de producto
final producidos depende del género o la especie en estudio.
Forma de preparar:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Pesar las cantidades exactas, caldo rojo de fenol 8g, agar 1.5g
Rehidratar con aguas destilada.
Calentar suavemente hasta su disolución.
Distribuir en tubos 5ml aproximadamente.
Esterilizar en la autoclave a 121o, 15 libras, 15 min.
Inoculación.
Crecimiento
Observación de pruebas.
Materiales necesarios para la realización de pruebas biquimicas y análisis de
muestras de agua del bebedero de centro de idiomas
:
Sesión 1: preparación de medios de cultivo para
coliformes.
Cantidad
5
2
1
2
1
1
3
Material
Cajas petri
Matraz Erlen-Meyer 150 ml
Balanza analítica
Espátulas acanaladas
Varilla de vidrio
Mechero Bunsen
Platitos para pesar
Sesión 3: Frotis, observación microscópica de
muestras de bebederos
Cantidad
1
5
5
1
2
5
5
Sesión 2: siembra de coliformes y preparación
de medios de cultivo
Cantidad
4
4
2
1
1
5
6
1
1
1
1
Material
Cajas petri de plástico estériles
Matraz de 150 ml
Mecheros bunsen
Hisopo estéril
espátula
Tubos con tapa
Tubos sin tapa
Tela
Cerillos
Gradilla
Caldo de fenol con manitol
Agar nutritivo
Extracto de carne, peptona,
gelatina
Agar con sulfito de bismuto
Agua destilada
Asa bacteriológica
Asa bacteriológica de punta
Probeta graduada
Material
Microscopio óptico
Porta objetos
Cubre objetos
Asa bacteriológica
Mecheros bunsen
Vasos de precipitados de 150
ml
Pipetas Pasteur
Lugol
Safranina
Cristal violeta
Cristal violeta
Etanol
Agua destilada
Actividades realizadas:
Fecha y Actividades
Observaciones
hora
27/05/10
Preparación de los medios
Este día no se termino de
de cultivo para coliformes.
vaciar las cajas petri, por
8:15-11:00
Esterilización de materiales
la tarde se procedió a
necesarios.
vaciar y a marcarlas
Vaciado de cajas petri.
03/06/10
8:10-11:05
10/06/10
8:06-11:00
17/06/10
8:20-1:00
Se tomo la muestra de los
bebederos de la biblioteca.
Se sembró.
Realización de medios de
cultivo para las pruebas
bioquímicas.
Observación macroscópica y
microscópica del resultado de
coliformes en el agua.
Tinciones.
Pruebas bioquímicas.
Resiembra de la cepa X y
coliformes en el agua.
Realizar medio de cultivo
para catalasa.
Se
realizaron
pruebas
bioquímicas de cada uno de
las cepas.
Frotis.
Se realizaron 2 tipos de
tinciones.
Esterilización de materiales
sucios e inservibles.
Tomar fotos de las muestras
microscópicas.
Cada una de las copias fue
observada
microscópicamente.
Lavado del material
En medios de cultivo no
creció nada por lo tanto
Joel nos daño una muestra
del bebedero del centro de
idiomas
del
cual
se
realizaron las muestras
respectivas.
El medio de cultivo para la
catasa no sirvió por lo tanto
se preparo medio nuevo.
La resiembra se realizo por
la tarde.
Se tomaron las fotos en el
laboratorio de biología, pero
hubo fallas técnicas por lo
que las fotos no salierón
bien del todo.
Se realizaron 2 tipos de
tinciones diferentes en las
cepas.
Se hiso una lista del todo el
material que se recopilo,
este día.
Lavado de autoclave.
RESULTADOS
Bacteria
Cepa H2O
Pruebas bioquímicas
Producción de
Catalasa Licuefacción
H2S
de la gelatina
-
+
+
Motilidad
-
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:
 PRODUCCION DE H2S: Los aminoácidos que
contienen azufre producen una reacción visible de
color negro.
Figura 1: Muestra de prueba catalasa, las
cuales, nos mostraron un resultado
positivo resultado negativo.
 POSITIVO PARA LA PRUEBA DE LA CATALASA: El
organismo cuenta con actividad de la enzima catalasa,
excluyendo al género Streptococcus y algunos otros la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas tienen catalasa. Ejemplos: Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp.
Figura 2: Muestra de prueba catalasa, las
cuales, nos mostraron un resultado
positivo resultado positivos al agregar el
peróxido de hidrogeno inmediatamente
reacciono al formar burbujas. .
 POSITIVO PARA LICUEFACCIÓN DE LA
GELATINA: Organismos capaces de producir
enzimas de tipo proteolítico, las enzimas que
son capaces de realizar la gelatinósis se
denominan gelatinasas. Los organismos que
tengan la presencia de estas enzimas
pretenden degradar a componentes más
pequeños sus proteínas, esto con el fin de
utilizarlas en sus procesos metabólicos.
Ejemplos:
Serratia,
Pseudomonas,
Flavobacterium, Clostridium.
Figura 3: licuefacción de la gelatina, los
resultados se muestran positivos al estar el
medio líquido.
 POSITIVO PARA MOTILIDAD: Algunas
bacterias son móviles por presentar
flagelo, los flagelos son encontrados
principalmente en las formas bacilares.
Ejemplo: Pseudomonas auruginosa (gram
negativa aeróbica).
Figura4: Los resultados se muestran,
negativos el crecimiento microbiano
acentuado sigue la línea de siembra.
DISCUSIÓN
Las pruebas bioquímicas no determinan cultivos mixtos, son única y exclusivamente para
cultivos puros, en consecuencia al realizarlas debemos de tener mucho cuidado al
manipular nuestro cultivo ya que por un error podríamos estar sembrando mas de un tipo
de bacteria además de que no necesariamente aquellas que estamos estudiando y por lo
tanto los resultados serian erróneos sin que siquiera nos demos cuenta. La preparación de
los medios en los que realizamos nuestras pruebas es otro paso realmente importante ya
que por alguna pequeña falla en la pesada, la esterilización o cualquier otro tipo de falla
darían resultados un tanto desviados.
Las pruebas realizadas en esta práctica se hicieron lo más apegado posible al protocolo, sin
embargo no debemos olvidar la posible existencia de algún porcentaje de error, ya que no
todos los medios funcionaron como se esperaba, cabe resaltar que aun así nunca se
perdió el objetivo planteado en dicha práctica.
Conclusiones
La identificación de cepas bacterianas en microbiología incluye muchos pasos en los que si
no se realiza un trabajo preciso los resultados no serán los correctos y esperados. Primero
que nada sabemos que para cualquier identificación debemos de tener a la cepa
totalmente aislada de cualquier otra esto con el fin de realizar las pruebas bioquímicas
correspondientes, la observación de lo que se investiga es también fundamental en este
tipo de trabajo por lo cual el manejo del microscopio y las diversas técnicas de tinción es
básico.
Todas las prácticas aquí presentadas cumplen con su objetivo, brindar al alumno la
destreza del manejo de materiales de laboratorio, llevar a la práctica lo que previamente a
estudiado en lo referente al cultivo, nutrición, desarrollo, etc. de microorganismos
bacterianos.
BIBLIOGRAFÍA:
Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica,
Jean Faddlin, medica panamericana.
http://www.bvsde.paho.org/legislacion/mexico/nom-127-ssai.pdf
consultado 22 de junio del 2010.
http://www.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-PruebasBioquimicas
Microbiología medica, Patrick Murray al et... 5ª edición