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IMPLEMENTACIÓN DE UNA TÉCNICA ALTERNATIVA PARA LA
SINCRONIZACIÓN DE CULTIVOS DE C. ELEGANS
Cisneros-Esparza A1, Camargo G2, Bañuelos-Pineda J3, Huerta M4, Ramírez-Herrera MA5,
Hernández L5 ([email protected])
1Maestría
en Ciencias Médicas de la Universidad de Colima, 2Doctorado en Ciencias Médicas de la
Universidad de Colima, 3Departamento de Medicina Veterinaria, CUCBA-Universidad de
Guadalajara, 4Laboratorio de Fisiología Neuromuscular, CUIB-Universidad de Colima, 5Laboratorio
de Neurofisiología, Departamento de Fisiología, CUCS- Universidad de Guadalajara.
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo simple, el
hermafrodita adulto tiene 959 células somáticas y el macho adulto tiene 1031.
Tanto el número de células como su posición son constantes. Los hermafroditas
producen tanto ovocitos como esperma y pueden reproducirse por
autofecundación, pero no pueden fertilizar a otros hermafroditas. Una vez que el
huevo eclosiona, el C. elegans se desarrolla pasando por cuatro estadios larvarios
(Figura 1), cada uno de ellos interrumpido por un cambio de muda, hasta
convertirse en joven adulto. El adulto maduro es capaz de vivir entre 20 y 30 días.
Aunque simple y económico, el mantenimiento y uso de C elegans requiere de
técnicas estándar para la optima utilización. Uno de los procedimientos más
recurrentemente empleados en los trabajos experimentales que usan este animalmodelo, es la sincronización de las etapas de desarrollo. La técnica estándar para
este fin, demanda del uso de ciertos equipos como el mini-spín, el vórtex además
de diversos medios líquidos. Asimismo el tiempo previo a la incubación de los
nematodos para un resultado óptimo, puede llevar varios días desde la obtención
de un buen numero de especímenes y la preparación de medios líquidos y
soluciones disolventes. Considerando lo anterior, proponemos una técnica
alternativa para la sincronización, derivada de otra que se utiliza para la limpieza
de los nematodos, que resulta ser mucho más sencilla, y que reduce el tiempo y
los costos para su realización.
Objetivo: Implementar una técnica más sencilla en cuanto a su realización, bajo
costo y con resultados similares para la sincronización de nematodos C. elegans
en comparación con el método tradicional.
Métodos: La técnica alternativa de sincronización requirió de la utilización de
mezcla de Hidróxido de Sodio (NaOH) a 1M e hipoclorito de Sodio al 5% (1:1 v/v).
En una caja de Petri de 100 mm con Agar-NMG se agregan de 8 a 10 gotas (c/u
100 µL) de la mezcla distribuida de manera circular y separadas
equidistantemente, dejando libre el centro de la caja. A continuación se colocaron
de 10 a 15 nematodos hermafroditas grávidos en cada gota de solución. Dichas
gotas limpian de contaminantes y disuelven la cutícula de los nematodos, dejando
libres los huevecillos sobre la superficie de Agar-NGM. Posteriormente las cajas
de Petri fueron colocadas en una incubadora a una temperatura de 19°C. Al día
siguiente de su incubación, se tomaron los larvas en etapa L1 en 1 mL de Buffer
de Fosfatos M9 utilizando una pipetor y se transfirieron a cajas de Petri con AgarNGM sembradas con alimento (E. coli OP50).
Resultados y Conclusiones: Esta técnica redujo el tiempo a unas horas para
emplazar los huevos a incubación. Al día siguiente de su incubación, se revisaron
los cultivos y se observaron larvas en etapa L1 en el medio de cultivo dentro de la
caja. El crecimiento de las larvas en la caja con alimento siguió su curso normal,
alcanzándose la adultez en 3 días a 19°C. Así pues, el método aquí propuesto,
reduce en al menos un 30% el tiempo empleado para la sincronización de cultivos,
además redujo la utilización de equipo e insumos de laboratorio, y se obtuvieron
resultados similares a aquellos de la técnica estándar, en lo relativo a la
sincronización de las etapas de desarrollo del C. elegans.