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14/ 8/2015
GE-03 Variación Genética, polimorfismos y mutaciones
Dra. Mildred Jiménez
Técnicas de Biología Molecular
PCR: Reacción en cadena de polimerasa.
Hay 2 tipos de PCR:
1. De punto final: es hasta el final que vemos la amplificación.
2. Tiempo Real: que es cuantitativa.
Algunas aplicaciones de la PCR real time son, para cuantificar viremias (VIH, VHB), para un análisis genético
en que queramos cuantificar alguna expresión (casi siempre lo que queremos ver es cualitativo, si hay o no
mutación), para leucemias, se cuantifica el efecto del tratamiento al cuantificar la expresión del oncogén.
Es diferente observar la presencia del cromosoma filadelfia en el cariotipo, a ver la expresión de ese ARNm,
es más sensible, son estudios de enfermedad mínima residual y se puede cuantificar. Se ve la expresión de
ese encogen en el tempo. En el caso del cromosoma filadelfia se da por la translocación de esos 2 genes.
ALTERACIONES EN EL ADN
¿Qué es una mutación?
Es un cambio en una base nitrogenada en secuencia del ADN, también son mutaciones la pérdida de una
sección, deleciones, inserciones, translocaciones, entre uno o más genes, otros cromosomas que compartan regiones por una translocación, o la ganancia de cromosomas completos, como la Trisomía 21.
Una mutación va más allá de un cambio puntual, son modificaciones o re-arreglos en el ADN, diferentes a lo
que conocemos como ¨normal¨ (lo que está en la mayoría de la población) la secuencia de referencia se
utiliza para determinar las ¨variaciones¨ y se toma como base de comparación la secuencia del proyecto
genoma humano, publicado en el 2005.
Reporte de laboratorio
Es importante, al recibir un reporte de laboratorio de secuenciación de un gen, indicar contra que secuencia de referencia se comparó. No hay una única secuencia del genoma, ya hay como 39 versiones, no es
que ha cambiado la secuencia en el tiempo, sino que han variado las técnicas de obtención y como se genera la secuencia, son modificaciones.
Todos los genes una vez que se han secuenciado y se conocen como la secuencia de referencia, luego tienen modificaciones, porque luego basándose en estudios funcionales pueden ver que ese exón, no era un
exón, sino un intrón o que algunas bases son distintas, entonces la secuencia de referencia puede cambiar
en el tiempo.
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El proyecto genoma humano permitió generar una base de datos de secuencias de referencia. Donde yo
puedo saber que en X tiene que encontrarse esta secuencia, y puedo comparar a los pacientes con la secuencia de referencia. Si solo realizo la secuencia y no tengo una de referencia, no puedo saber si es normal
o no.
Una mutación como tal, no es sólo el cambio en el ADN, o un re-arreglo en el material el concepto de mutación lleva dos cosas más, la generación de una enfermedad o un fenotipo alterado, y una frecuencia, de
expresión, en un porcentaje generalmente bajo de la población.
Las mutaciones en general, son eventos raros, <1%, si tomo la población de costarricenses, que son 4,5
millones, se esperaría que las mutaciones se encuentren en menos de un 1% de la población. Y recuerdo
que el concepto de mutación a nivel clínico asocia, un genotipo alterado. Una enfermedad, un síndrome,
un hallazgo anormal que le causa una sintomatología al paciente.
DIFERENCIAS ENTRE MUTACION Y POLIMORFISMO
Un polimorfismo es exactamente lo mismo en cuanto a que hay un cambio en el ADN. Podría ser puntual,
un re-arreglo complejo, una deleción, una inserción (una translocación ya no), sin embargo un polimorfismo no conlleva a una modificación del fenotipo, al menos no clínicamente importante. Podría llevar a una
modificación por ejemplo, de susceptibilidad, a ciertas patologías, o de modificación de respuesta a medicamentos, podría ser un factor de riesgo, por ejemplo, a desarrollar eventos trombóticos, como los polimorfismos en el Factor V de coagulación. Hay varios en estudio, son muy comunes y se hacen de rutina,
para ver si esa persona tiene mayor o menor susceptibilidad.
LOS POLIMORFISMOS NO VAN A ASOCIAR UNA ENFERMEDAD COMO TAL.
La otra diferencia es el porcentaje, yo esperaría una mutación en la población general en <1% de los casos,
mientras que esperaría un polimorfismos >1% de los casos, algunos textos indican un valor de al menos 3%,
pero manejemos el 1%.
Entonces si tomo el análisis de 100 personas SANAS, y encuentro un polimorfismo, espero tenerlo al menos
en 1 persona de las 100, que no es lo mismo que con las mutaciones que suelen ser raras.
Se hacen estudios de polimorfismos en enzimas, como la metiltetrahidrofolato reductasa MTHFR, que está
de moda el polimorfismo C179T, en estado homocigoto (que los dos ale lo tengan). Se considera un factor
de riesgo para patologías cardiovasculares. Pero si este polimorfismo está en estado heterocigoto, no se
asocia, no hay un efecto de asociación al riesgo de patologías cardiovasculares. Este es sólo un factor de
riesgo, hay otros factores de riesgo cardiovascular: sobrepeso, HTA, sedentarismo, alimentación, fumado,
herencia, edad, sexo. El polimorfismo es sólo uno más.
Esto es importante, ya que el médico le dice al paciente que esto es un factor heredado, que el evento
trombocito que sufrió el paciente, es consecuencia de esto. Y en realidad del paciente es heterocigoto, se
ha interpretado mal el resultado del examen. Ya que tendría que ser homocigoto, este polimorfismo es el
que se asocia a niveles elevados de homocisteína. Es más acertado entonces cuantificar la homocisteína en
cuanto a la patología que presenta el paciente. Es importante que nosotros sepamos interpretar si estamos
leyendo un polimorfismo o una mutación.
MUTACIONES: Obtención de la muestra
Entonces si tengo un cambio en la secuencia de un paciente y no sé si es un polimorfismo o una mutación.
Lo correcto sería secuenciar 100 personas de la población y buscar si el cambio está o no está presente en
esa población, para ver si es un polimorfismo o una mutación.
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Si es una mutación y el cambio ocurre a nivel del ADN genómico (está en el núcleo, xq también hay ADN en
la mitocondria).
En el laboratorio de Tamizaje, hay una división de Genética Molecular, dónde se hacen estudios de mutaciones asociadas a diferentes patologías.
Por ejemplo: se detecta un caso positivo de Fenilcetonuria en tamizaje,
luego es estudiado el gen de PH de la Fenil hidroxilasa del paciente, a
ver dónde está la mutación que causa Fenilcetonuria. Y si es necesario
se estudian los padres, para poder hacer el asesoramiento en conjunto.
Para hacer el estudio:
1. Se toma una muestra representativa del ADN de este paciente.
A. Debemos saber primero, si este gen está en el ADN genómico o
en el ADN mitocondrial, que también tiene mutaciones asociadas a enfermedad.
ADN mitocondrial: es de herencia materna, circular, doble banda y tiene16000 pB (pares de bases),
contiene genes, ARNt, ARNr de importancia. Si ocurren mutaciones, puede haber patología.
El gen de la fenilcetonuria, está en un cromosoma del ADN genómico.
B. Elegir ¿Qué célula puedo utilizar para extraer el ADN genómico?
Se podría elegir cualquier célula que tenga núcleo. Células sexuales, por ejemplo el esperma, pero no es la
mejor muestra en un paciente pediátrico. Si tomamos leucocitos la muestra es de sangre periférica.
C.
¿Qué requisitos implicaría esta muestra, para su extracción?
**Que no coagule: La parte de la sangre que vamos a tomar para liberar el ADN, son los Leucocitos, y si se
forma el coagulo, se forma una malla de fibrina y ahí quedan atrapados los leucocitos. Entonces debo hacer
algo más para romper esta malla, y esto es un efecto mecánico que destruye las células y por ende, destruye el ADN.
Lo mejor sería tomar la muestra en brazo, en un tubo que tenga algún anticoagulante.
Hay diferentes anticoagulantes para tomar las muestras, cada uno se asocia por convención al color de la
tapa del tubo.
1. Tapa morada o lila: EDTA, que quela iones de Ca, no sirve para pruebas de coagulación, porque TP
y TPT requieren Calcio. Lo puedo usar para hemogramas, para el banco de sangre. Para genética, es
el ideal, porque no afecta a las células como tales. NO sirve para cultivo de las células para un crecimiento celular porque al quelar el Ca, altera la viabilidad de las células.
2. Tapa celeste: Citrato, se usa para pruebas de coagulación, también sirve para genética.
3. Tapa verde: heparina, que no sirve para genética, porque la hiparina interfiere con la PCR.
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Debemos saber que anticoagulante usar, pero para genética. Si no saben cuál usar, el clásico es el de tubo
de tapa lila para EDTA, es el que se usa para el hemograma.
Entonces, para el paciente detectado en tamizaje, por sospecha de Fenilcetonuria. Se toma una muestra en
un tubito con EDTA.
CASOS ESPECIALES
¿Qué pasa si el paciente fue transfundido un día antes de que uds tomaran la muestra?
En el banco de sangre, la sangre se leuco reduce con un filtro y se irradia, para evitar que haya enfermedad
injerto vs. Huésped, porque en la transfusión, si se pasan algunos linfocitos, pero al hacer esto se eliminan.
Sin embargo, en algunos lugares, no leuco reducen y no sabemos cuántos leucocitos vienen. La vida media
de un leucocito es de <1mes.
Transfusión sólo con glóbulos rojos empacados:
Se transfunden eritrocitos. La vida media de un eritrocito, es de 120 días, si se hubiese transfundido sólo
con glóbulos rojos empacados, no debemos esperar para tomar la muestra. Porque no tienen núcleo, es
decir, no tienen ADN genómico, ni mitocondrial, no tiene mitocondrias, son dependientes de glucosa, no
hacen fosforilación oxidativa. Entonces el eritrocito como muestra para genética no nos sirve.
Transfusión de sangre
En el laboratorio hicieron una prueba de cuantos días podrían aproximarse al día de la transfusión, sin tener interferencia del ADN del donador. En esa unidad de transfusión, lo que se va es ADN libre que queda
en el plasma y puede interferir, no el ADN que va en los leucocitos como tal, sino ADN libre. El resultado
que obtuvieron, es que deben esperar al menos 3-4 días.
Otra estrategia, si fue transfundido: Tomar otra muestra.
Otra célula con núcleo que no sea sangre. Puede ser una célula epitelial, tomada con un hisopo estéril de la
mucosa. Hay unos hisopos especiales sin ADN. Podrían utilizar una muestra de saliva, que lleva células epiteliales, hay que tomar en cuenta si la carga bacteriana va a interferir, según el análisis que vaya a hacer.
También podría tomar una muestra de células epiteliales del sedimento de la orina. De la punta del cabello
no funciona porque hay sólo una célula y no amplifica por nuestros métodos. Pero en general, donde hay
una célula, podríamos tomar la muestra. La segunda opción es una muestra hisopado de cavidad oral, ese
nunca falla.
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¿Si tuviera solamente plaquetas en la muestra, serviría?
Por ejemplo cuando se hace una plaquetaféresis. Las plaquetas, que son fragmentos de citoplasma de megacariocitos. Como muestra de genética, sólo podría extraer ADN mitocondrial porque si hace Fosforilación oxidativa. Pero NO puedo obtener de ADN genómico. Para hacer un estudio mitocondrial, puedo usar
un paquete solamente plaquetario.
Si el paciente NO fue transfundido.
Se toma la muestra en el tubito con EDTA. Se hace la extracción de ADN de los leucocitos.
EXTRACCION DE ADN
1. Debemos romper la membrana celular: se lisa la célula rompiendo la capa de fosfolípidos, con un detergente, con un agente mecánico, con un diluente orgánico, con un agente químico.
2. También hay que romper la membrana nuclear. Y obtenemos el ADN que está empaquetado unido a
proteínas histonas y no histonas.
3. Separar al ADN de las proteínas: para separarlo debo destruir las proteínas con una enzima proteasa, o
una proteinasa general, también puedo utilizar algunos tipos de diluentes para alterar las funciones de las
proteínas y liberarlas.
4. Luego ese ADN, lo puedo re-suspender.
Normalmente el ADN con que se trabaja en el laboratorio, es distinto al ADN nuclear, no está unido
a proteínas. En este ADN hay que cuantificar su calidad con respecto a cantidades de sales, proteínas, y ADN. Ya que podría ser no funcional, estar degradado, muy contaminado en sales, o proteínas, ya que la extracción no estuvo bien hecha o la muestra está muy contaminada.
ENTONCES HAY UNA DIFERENCIA IMPROTANTE, EL AND EN EL LABORATORIO A DIFERENCIA DEL
ADN EN EL NUCLEO, NO ESTA UNIDO A PROTEINAS.
Debemos pensar que el ADN en el laboratorio difiere mucho del ADN en la célula unido a proteínas, formando nucleosomas. Un ensayo en el ADN de laboratorio, difiere mucho a lo que pasa en la realidad.
5. Quito TODAS las proteínas, histonas y No histonas.
En una célula, cuando se requiere una amplificación, la maquinaria de replicación, para ARN-ADN y
la maquinaria de transcripción para ARN, quitan las proteínas y liberan el ADN en una banda simple.
Hay un montón de enzimas que colaboran con esa división. En la célula si no se pueden separar las
proteínas y se separa la doble banda, no puede haber replicación, ni transcripción. En el laboratorio,
yo tengo más facilidades porque le quito las proteínas.
6. Utilizo la PCR. En el caso de Fenilcetonuria, es una enfermedad monogénica, autosómica recesiva. IMPORTANTE: tengo que saber el TIPO DE HERENCIA, de esta enfermedad. Es distinta la interpretación de un
gen que está en un autosoma, que de un gen en un cromosoma sexual. Por ejemplo yo tendría que pensar
en hombres y en mujeres en un cromosoma X hay una interpretación distinta. Este gen está en un autosoma.
7. Se amplifica el gen: hay que tomar en cuenta que es ADN genómico, donde amplificamos intrones y
exones.
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Metodología de laboratorio
Hay que saber qué metodología se utilizó, si se secuenció intrones y exones o solo exones.
Lo recomendado es secuenciar todos los exones que son los codificantes, pero también necesitamos algunas regiones de los intrones, de estos se secuencia al menos 20pb del inicio y del final de cada intrón,
porque son zonas flaqueantes, donde están los sitios de reconocimiento de splicing.
El splicing alternativo es también un tipo de mutación, entonces si yo no sé, si hay mutaciones ahí, tampoco
puedo garantizar que la secuenciación de ese paciente esté normal.
Preguntar al laboratorio si hace al menos los límites de los intrones.
No podemos exigir todos los intrones, porque hay intrones de millones de pares de bases, que no se conoce inclusive toda la secuencia bien, pero mínimo 20pB a cada lado. La media del tamaño de los exones en
humanos es de 200-250pB, es bastante pequeño, pero un intrón puede ser de 1000 a 10.000pB, esto en
costo económico es muy grande.
El análisis de exomas, es la secuenciación de sólo lo exones, solo lo que se expresa.
Además debemos secuenciar el promotor, que está entre 80-120pB corriente arriba del Exón 1, incluso en
algunos casos a 160pB. No está tan lejos, entonces, el promotor debería secuenciarse, el problema es que
en muchos genes no se conoce aún donde está el promotor, y por esto no se secuencia, pero parece algo
importante, porque podemos tener un gen completamente intacto sin mutaciones y que las mutaciones
estén en el promotor. Esto significa que igual no se va a expresar este gen, pero no sabíamos que era por el
promotor. Si uno se limita a los exones, puede estar cayendo en un error de interpretación.
TASA DE MUTACION Y MECANISMOS DE REPARACION

Si una mutación ocurre en la línea germinal, en las gónadas, esta se hereda a las siguientes generaciones.
Si la mutación ocurre en línea somática, no se heredan a las otras generaciones.


Ej.: cáncer, ahora, hay CA que son hereditarios, pero esto es otra cosa. Tenemos una serie de cambios o
mutaciones en línea somática que no tendrían que ser heredados.
Toda enzima tiene una taza de error
Cuando se produce la replicación y transcripción, la ADN o la ARN polimerasa, se puede equivocar y tiene
una taza de mutación normal, nosotros tenemos mecanismos de reparación de esos errores.
Si el error ocurre cuando la ADN polimerasa está produciendo la otra copia en replicación: esa mutación
se va a heredar a las células a partir de esa.
Si la mutación ocurre en la transcripción no, porque es hacia el ARN. En este caso, ese ARN, puede no ser
funcional, no llegue a ser ARNm y luego no se exprese la proteína, pero no tendríamos por qué heredarlo a
las otras células.
SIEMPRE hay una Taza de Error, NORMAL
Fisiológicamente las enzimas se equivocan y puede haber una taza de error normal. El problema es cuando
los mecanismos de reparación no corrigen esos errores o cuando la taza de mutación se aumenta, por efectos internos, o externos.
El ADN mitocondrial, tiene una región hipervariable, y la ADN polimerasa que sintetiza esa copia del ADN
mitocondrial, no es la misma de la ADN polimerasa del ADN genómico.
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La ADN polimerasa tipo Épsilon: tiene una taza de mutación mayor, y es también la encargada de hacer la
replicación en sitios hipervariables del genoma nuclear, como son la parte de las inmunoglobulinas.
Esto se explica ya que en la expresión de las inmunoglobulinas requerimos una alta variabilidad, hay una
serie de haplotipos y recombinaciones, ya que se requieren muchos tipos de anticuerpos, clones de linfocitos activados debemos producir para generar una respuesta, para la cantidad de epitopos que encuentre
nuestro cuerpo. Resulta entonces, que esta tasa de mutación aquí, nos favorece para tener una gran cantidad de expresión clonar a nivel celular.
En el ADN mitocondrial, todavía no se sabe porque tiene esa alta variabilidad, pero se ha utilizado para
identificación humana en estudios migratorios o forenses, porque es hipervariable entre individuos, pero
dentro del mismo individuo es igual. Entonces se podría identificar por esa región hipervariable, a diferencia de las pruebas de paternidad normales, y puede ir siguiendo la línea familiar de esa persona.
TIPOS DE MUTACIONES:
1. Inducidas: requieren algún agente externo, hay muchos agentes físicos, químicos, radiaciones, agentes
mutagénicos, que de hecho tienen un potencial carcinogénico.
2. Espontaneas o endógenas: son las que se producen normalmente en una célula, son las de la tasa de
mutación normal que tiene la enzima como tal, pueden darse en la replicaron o en la transcripción y no
serán heredados. Este es un proceso normal a nivel celular.
AGENTES MUTAGENICOS:
•
•
•
•
Radiaciones ionizantes
Radiaciones no ionizantes
Sustancias químicas
Luz UV: se usa para esterilizar una región en el laboratorio, en una cámara, porque produce dineros de
tiaminas que estén continuas y esto produce durante la división celular una alteración y la secuencia va
sumando mutaciones. Por ejemplo en bacterias, la siguiente generación, no va a ser viable, porque tal alteración en el ADN no es reparable y la próxima célula que se genera ya no es viable y tenemos una desinfección.
Estos agentes, generan mutaciones y estas se van acumulando, y hay varias teorías del envejecimiento y la
acumulación de mutaciones.
Determinación del origen de la mutación
En el caso del niño con Fenilcetonuria:
1. Realizar el estudio para saber si los padres son portadores:
Caso 1: Ambos padres son portadores.
Caso 2: un padre es portador, y el otro no. Hay que buscar si en otra generación, donde apareció la primer
mutación y porque apareció en él.
Pasa mucho con los enfermos de Distrofia muscular de Ducchenne, es una enfermedad ligada al X, es una
enfermedad degenerativa a nivel muscular, que causa en los pacientes una esperanza de vida muy corta,
de 10-15 años, son niños que mueren. Es una enfermedad ligada al X entonces tenemos, mamás portadoras con varoncitos enfermos y podemos revisar a la abuelita, y a veces nos damos cuenta de que no es portadora. Entonces la mutación se generó en esta mamá y ella va a preguntar ¿Porque? Lo primero que pienPágina 7 de 9
san es en algo teratogénico, y siempre piensan en una exposición durante el embarazo. Pero, por teratógenos obtenemos efectos morfológicos diferentes.
¿Cómo podemos explicar mutaciones que ocurren que no necesariamente se relacionan con exposición a
agentes teratogénicos?
Algunas de las razones, son porque algunas mutaciones se acumulan.
Ejemplo: Leucemias en niños
Es el CA más frecuente en niños, a diferencia de tumores sólidos. Porque necesitamos acumular muchas
menos mutaciones para las leucemias. Muchos menos que las que requerimos para un tumor sólido. Por la
tasa de recambio del sistema hematopoyético. Estas células tienen una esperanza de vida menor y el recambio es mucho mayor. El neutrófilo desde que sale de la médula ósea, ya inicia apoptosis, ya va para
atrás en su vida media, y el linfocito, depende si se activa y cloniza para producir anticuerpos que se convierten en células de memoria, y podrían durar más, pero no esperamos que un linfocito o un neutrófilo
activado duren un mes, llega a degradarse antes.
Entonces esta serie de agentes que nos van a causar mutaciones, las podemos asociar a polimorfismos,
entendiendo que el mecanismo no es el mismo, pero el efecto es distinto. También esos cambios nos dan
diversidad, por eso las personas son distintas, por eso aunque mama y papá son los mismos lo hermanos
son distintos.
CLASIFICACION DE LAS MUTACIONES
SEGUN SU LOCALIZACION:
•
•
•
•
Somáticas
Germinales
Autosómicas
Ligadas al X
Generalmente no hablamos de mutaciones ligadas al Y porque no hay patologías con mutaciones como en
los otros cromosomas. Podríamos tener afectación de toda una región que no da una consecuencia. Por
ejemplo la pérdida de la región SRY y yo lo veo como un pacientito con una ambigüedad o un desarrollo
pobre a nivel de gónadas, pero en general, como el cromosoma Y es más pequeño, no hablamos de mutaciones asociadas al cromosoma Y.
SEGUN SUS CONSECUENCIAS
1. Mutaciones morfológicas: hay una característica en el paciente, en Sn de Down, esa trisomía da una
morfología distinta en los tejidos o en sus órganos.
2. Mutaciones letales o deletéreas: deletérea, no son sólo incompatibles con la vida, también se expresa
cuando genera un individuo es incapaz de dar descendencia, no da permanencia de ese alelo en la población.
3. Mutaciones condicionales: se van a expresar solamente si tenemos un efecto o condición ambiental
que genere los cambios. Esto lo vemos en Drosophila melanogaster, la mosca de las frutas, donde dependiendo de las condiciones se puede generar que los ojos sean rojos, o negros, que las alas sean cortas o largas.
4. Mutaciones nutricionales o bioquímicas: se da una pérdida. Ejemplo: Fenilcetonuria, generada por
mutaciones a nivel bioquímico, deficiencias de enzimas bioquímicas.
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5. Mutaciones de pérdida o ganancia de función: de ganancia de función. Ej.: cáncer, dónde esa célula
no tenían capacidad de evadir apoptosis y ahora sí o de estimular angiogénesis y ahora si. Y pérdida de
función son las clásicas, donde las enzimas ya no tienen función, o no tiene expresión de un receptor,
por la pérdida de la función.
• No son excluyentes entre sí, puedo tener al mismo tiempo una mutación de ganancia y una bioquímica.
Mutación genómica.
Que afecta TODO el genoma, tenemos 3 copias de cada cromosoma (69XXX) es una célula triploide. Esto se
puede ver en células tumores.
En un estudio de una célula cancerígena, se puede encontrar de todo, cromosomas traslocados, lagunas,
anillos, triploidías, porque ellos tienen un desorden cromosómico bastante importante.
Mutaciones génicas
Son alteraciones en la secuencia de nucleótidos. Las mutaciones del gen como tal, en exones o intrones,
podemos dividirlas en:
1. Cambio puntual: hay dos tipos, transición y transversión, donde hay cambios más pequeños.
2. Cambio molecular: inserciones y deleciones.
3. Cambio en el producto génico: ARNm y proteínas.
Hay otros productos del gen: ARN mensajero, transferencia, interferencia, ribosomal, microARN, que vamos a ver en Epigenética.
Nota importante: Leer los artículos de bioinformática.
Transcripción: Natalia Salazar Campos
Correo: [email protected]
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