Download Cultivo de hongos.

Nombre: Marcos Vargas Villanueva
microbiología
martes de 2 a 4 pm
Carrera: medicina
Describe dos métodos de obtención de muestras de orina para aislar bacterias que afecten al tracto urinario por
grupos atareos (edades)
1. para mujeres:
Se lavará las manos cuidadosamente con agua y jabón, las enjuagará con agua y las secará
con una toalla limpia.
o Se separarán los labios mayores y menores, y los mantendrá separados en todo momento
hasta que se haya recogido la orina.
o Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasándola de delante hacia atrás, se repetirá
el proceso un total de 4 veces.
o Enjuagar cuidadosamente con agua hervida para eliminar los restos de jabón.
o Se indicará a la paciente que orine desechando los 20-25 primeros mililitros, tras lo cual y sin
interrumpir la micción, se recogerá el resto de la orina en el recipiente.
o El frasco debe sujetarse para que no tome contacto con pierna, vulva o ropa del paciente. Los
dedos no deben tocar el borde del frasco o su superficie interior.
2. para hombres:
o Lavado de las manos con agua y jabón.
o Retraer completamente el prepucio, que se mantendrá así en todo momento, hasta que se
haya recogido la orina.
o Limpiar el glande con jabón neutro.
o Eliminar los restos de jabón enjuagándolo con agua hervida.
o Se pedirá al paciente que orine desechando los primeros 20-25 mililitros para, sin interrumpir la
micción, recogerse el resto de la orina en el recipiente estéril.
3. para niños.
o En niños y niñas mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos.
o En niños y niñas más pequeños, la orina se recogerá en colectores o bolsas estériles
especialmente diseñadas para ellos de la siguiente forma:
 Lavado cuidadoso de los genitales y área perineal igual que en los adultos.
 Colocar la bolsa de plástico o el colector.
 Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el niño haya orinado, deben retirarse
y enviarse al laboratorio para su procesamiento.
 Si la micción no se ha realizado en una hora, se repite la operación colocando una
nueva bolsa.
 Una vez recogida la muestra, lave de nuevo la zona genital, para evitar irritaciones.
o Envíe la muestra al laboratorio junto con la petición escrita.
o Registro en su hoja de evolución de enfermería: técnica, fecha, hora, características de la
orina, incidencias presentadas.
Transporte.
La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible debe refrigerarse a
4ºC durante un tiempo máximo de 24 horas. El laboratorio debe controlar el transporte, garantizándose el que
las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, siendo admisible, si no puede garantizarse
el transporte correcto, la utilización de algún conservante (ácido bórico al 2% o el sistema comercial con
bórico-formiato).
o
Volumen de la muestra
BUSQUEDA
VOLUMEN DE ORINA
(ml)
Bacterias
0,5 – 1
Hongos
>20
Mycobacterias
>20
Anaerobios
1
Virus
10 - 15







CONSIDERACIONES
Primera orina de la mañana
Primera orina de la mañana
Primera orina de la mañana, 3 días consecutivos
Aspirado suprapúbico
Primera orina de la mañana, enviar con hielo al
laboratorio
En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por sí mismos, se realizará sondaje
vesical por personal sanitario experto con las medidas asépticas oportunas.
Para la investigación de anaerobios es necesario que la orina se obtenga por punción suprapúbica.
Para la búsqueda de micobacterias, la orina se recoge de la forma descrita anteriormente durante tres
días consecutivos. En este caso el volumen de orina debe ser 100-150 ml. y se elegirá
preferentemente la primera micción de la mañana. Cuando se sospecha la presencia de hongos y
virus, el volumen de orina será superior a 20 ml. y en el caso de parásitos se recogerá la orina de 24
horas.
Cultivo de Mycobacterium spp. Util en el diagnóstico de tuberculosis pulmonar pausibacilar y
especialmente en las formas extrapulmonares. Actualmente está indicado, además del cultivo en
medio sólido, el cultivo en medios líquidos, disminuyendo así los tiempos de desarrollo. En nuestro
laboratorio utilizamos el sistema MB/Bact semiautomizado para todo tipo de muestras, excepto
sangre.
Cultivo de hongos. La búsqueda puede ser de hongos levaduriformes o miceliados. Es importante
conocer hacia cuál de ellos se inclina la sospecha, dado que los tiempos de incubación son diferentes.
Los hongos levaduriformes se incuban por plazos que oscilan entre 5 y 7 días, en cambio los
filamentos deben ser incubados por plazos más largos, de 20 hasta 30 días.
Cultivo anaerobio. Algunas bacterias de importancia clínica son anaeróbicas, difíciles de cultivar y
oxígeno lábiles, por lo que en su recolección y transporte deben usarse envases especiales que
contengan una atmósfera reducida, es decir, con un bajo potencial de oxidoreducción. Es de
extraordinaria importancia que la muestra sea procesada de inmediato.
La muestra en lo posible debe ser obtenida por aspiración. Deberá evitarse la contaminación con
flora residente, ya que en ella están ampliamente representadas las bacterias anaeróbicas.
Los sitios anatómicos adecuados para la obtención de muestras para estudio de anaerobios son
líquidos orgánicos estériles (Líquido pleural, sangre, bilis, líquido peritoneal, liquido sinovial, (LCR),
muestras quirúrgicas obtenidas de sitios estériles (Contenido de abscesos,
aspirado de heridas
profundas) y muestras de biopsias obtenidas en forma aséptica (Transcutánea pulmonar, aspiración
vesical suprapúbica, líquido de culdocentesis , etcétera).
Es importante tener presente que a toda muestra procesada para la búsqueda de anaerobios, debe
efectuársele una tinción de Gram. Dado que los cultivos tardan un tiempo en dar
resultados, el
Gram puede proporcionar una buena información temprana, útil para iniciar tratamiento y, al mismo
tiempo, verifica la concordancia con los resultados de los cultivos.
Catéteres intravenosos. Los catéteres intravenosos son cultivados cualitativa o semicuantitativamente,
dependiendo de las técnicas usadas en los laboratorios. La técnica de cultivo semicuantitativo (Maki) ,
consiste en hacer rodar el extremo del catéter sobre la superficie de una placa de medio cultivo, e
informar el número de colonias que se desarrollan en ésta. La presencia de 15 o más colonias se
correlaciona con inspección.
TAREA
SEÑALE USTED LOS AMBIENTES TIPO DE UN LABORATORIO DE MICROBIO LOGIA, Y OTRO
PROTOTIPO DE AMBIENTE LABORATORIO DE NIVEL 4 QUE USTED CREA CONVENIENTE EN
NUESTRA FACULTAD. ( CREACIÓN SUYA CON LO APRENDIDO, MEJOR EN ESQUEMA O GRÁFICO,
ENVIAR POR EL FORO O E-MAIL)
DESCRIBEN LAS BARRERAS SECUNDARIAS DE BIOSEGURIDAD ÚTILES EN EL PERSONAL DE
LABORATORIO
Nombre: Marcos Vargas Villanueva
microbiología
martes de 2 a 4 pm
NBS - 2
Se aplican normas similares al NBS - 1 y es adecuado para trabajos que involucren agentes biológicos de riesgo 2 con
potencialmoderado para el personal y el medio ambiente.
7.3.2.1.Agente biológico del grupo 2
Puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer unpeligro para los trabajadores, siendo poco probable que
sepropague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis otratamiento eficaz. Como algunos que, perteneciendo a
la propiaflora habitual del hombre, son capaces de originar patologíainfecciosa humana de gravedad moderada o limitada.
Ejemplo:
Staphylococcusepidermidis, Salmonella sp, entre otros.
Difiere del NBS - 1 en los siguientes aspectos:
- El personal del laboratorio debe contar con una capacitaciónespecífica en la manipulación de agentes patogénicos y
debeestar dirigido por una persona con competencia en microbiologíay bioseguridad.
- El acceso al laboratorio debe ser limitado cuando se estándesarrollando actividades.
- Se deben tomar precauciones extremas con elementos punzo-cortantes contaminados y ciertos procedimientos que
puedengenerar aerosoles o gotitas infecciosas. Estos procedimientos sellevarán a cabo en CSB o en otros equipos de
contención física.
7.3.2.2.Prácticas estándares NBS - 2
Se aplican las normas establecidas para el NBS - 1.
7.3.2.3.Prácticas especiales NBS - 2
- El responsable del laboratorio debe limitar o restringir el acceso al laboratorio cuando se están realizando trabajos con
agentes infecciosos. El responsable de laboratorio evalúa cada circunstancia y determina quién puede ingresar o trabajar
en ellaboratorio o sala de animales.
- Se debe colocar una señal de advertencia de riesgo biológicoen la entrada del laboratorio cuando se están usando
agentesbiológicos del grupo 2. Se debe colocar información sobre elagente o agentes que se están usando, el nivel de
bioseguridad,las inmunizaciones requeridas, el nombre del investigador oresponsable del laboratorio y su número de
teléfono, todo equipo de protección que deba emplearse en el laboratorio y todoslos procedimientos requeridos para
retirarse del laboratorio.
- El personal del laboratorio debe someterse a las inmunizacioneso a los análisis de los agentes manejados o
potencialmentepresentes (ejemplo: vacuna contra la hepatitis B, evaluacióncutánea de tuberculosis).
- Se recogen y almacenan muestras basales de suero del personalde laboratorio y otros miembros del equipo de trabajo en
riesgo.
Se pueden recolectar periódicamente otros especímenes desuero, dependiendo de los agentes manipulados o la funciónde
las instalaciones.
- El responsable del laboratorio debe incorporar a los procedimientos de seguridad aquellos procedimientos
operativosestándares o manual de bioseguridad adoptado o preparadoespecíficamente para las actividades específicas de
laboratorio.
- El personal debe ser advertido sobre los riesgos especiales yse le debe exigir que lea y siga las instrucciones sobre
prácticasy procedimientos.
- El responsable del laboratorio debe garantizar que el personalreciba la capacitación adecuada sobre bioseguridad, que
incluyalos posibles riesgos asociados con el trabajo en cuestión.
- Se debe tener un alto grado de precaución con los artículospunzantes o cortantes contaminados.
- Los cultivos, tejidos, fluidos corporales, o desechos potencialmenteinfecciosos se deben colocar en un recipiente con
tapa herméticaque evite las filtraciones durante la recolección, manejo,procesamiento, almacenamiento, transporte o
envío.
- Se deben descontaminar los equipos y las superficies de trabajo regularmente con un desinfectante efectivo después de
trabajar con el agente infeccioso, y especialmente cuando se producen derrames evidentes, salpicaduras u otra
contaminación pormaterial infeccioso. Los equipos se deben descontaminar conforme a las normas establecidas antes de
enviarlos para sureparación, mantenimiento o ser embalados para su transporte.
- Se deben informar de inmediato al CB y al jefe o director de lainstitución, los derrames y accidentes que deriven
enexposiciones evidentes a los materiales infecciosos. Se ofrecela evaluación, control y tratamiento médico necesario y
seguardan registros escritos.
- No se permite la presencia en el laboratorio de animales queno se están empleando en el trabajo que se está realizando.
7.3.2.4.Equipo de seguridad (contención primaria) NBS - 2
- Se deben usar CSB certificadas de clase II, u otros equipos deprotección personal o dispositivos de contención física
adecuados.
- Se debe emplear una protección facial (anteojos, máscaras,protecciones faciales u otra protección) para las
probablessalpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos u otrosmateriales peligrosos para el rostro cuando se
debenmanipular los microorganismos fuera de la CSB.
- Se deben usar delantales, mandiles de manga larga o uniformes de protección adecuados durante la permanencia en
ellaboratorio. Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en ellaboratorio antes de dirigirse a otras áreas; la institución
seencarga de lavarla o descartarla, según sea el caso; el personal no debe llevarla a su casa por ningún motivo.
- Se deben usar guantes cuando es posible que las manos entrenen contacto con materiales infecciosos, superficies o
equiposcontaminados.
- Puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes. Se descartan los guantes cuando están manifiestamente
contaminados y se retiran cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando esté comprometida la
integridad delguante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven ausar, ni se utilizan para tocar superficies
"limpias" (teclados,teléfonos, entre otras) y no se deben usar fuera del laboratorio.
7.3.2.5. Instalaciones del laboratorio (contención secundaria) NBS - 2
- Las instalaciones que contengan agentes restringidos debende contar con puertas con llave.
- Cada laboratorio debe tener un lavatorio para el lavado de manos. Se recomiendan los lavatorios controlados con los
pies,las rodillas o los que operan automáticamente.
- El laboratorio debe estar diseñado para que pueda limpiarsefácilmente. Es inadecuado el uso de alfombras y felpudos
enlos laboratorios.
- Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y resistentes al calor moderado y a los
solventesorgánicos, ácidos, álcali y sustancias químicas empleadas paradescontaminar las superficies y equipos de trabajo.
- Los muebles del laboratorio pueden soportar las cargas y usosanticipados. Los espacios entre las mesas de trabajo,
cabinasy los equipos son accesibles para su limpieza. Las sillas yotros muebles usados en el trabajo de laboratorio deben
estarcubiertos por material que pueda ser limpiado fácilmente.
- Se deben instalar CSB de tal manera que las fluctuaciones delaire de entrada y escape de la sala no hagan funcionar a
losCSB fuera de sus parámetros para contención. Se debencolocar las CSB lejos de las puertas, ventanas que se
puedenabrir de las áreas del laboratorio de mucho tránsito y de otrosequipos potencialmente interruptores a los fines de
mantenerlos parámetros del flujo de aire para contención de los CSB.
- Se debe disponer de una estación para el lavado de ojos.
- La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades,evitando los reflejos y el brillo que puedan molestar la
visión.
- No existen requisitos de ventilación específicos, sin embargo, la planificación de nuevas instalaciones debe considerar
los sistemas de ventilación mecánica que ofrezcan flujo de aire hacia el interior sin la recirculación a espacios fuera del
laboratorio. si el laboratorio tiene ventanas que se abren al exterior, deben colocarse mosquiteros.
RUEGO ENVIAR POR ESTE MEDIO TRES METODOS DE CULTIVO DE HECES PARA DIAGNOSTICO DE
ENTEROBACTERIAS, DOS PARA BACTERIAS DIVERSAS EJEMPLO TUBERCULOSIS U OTROS.
Escherichia coli
Diagnóstico de laboratorio.
A partir de las heces, Tinción de Gram, bacilos Gram (-), aumento de leucos (cepa enteroinvasiva)
Cultivo en:
Mac Conkey seleccionamos las colonias lactosa (+), sembramos en el Kliger (Slant), medio de color amarillo en
la base y pico. Fermentan la lactosa.
Shigella
A partir de las heces del enfermo (que sean recientes) con hisopo o directamente.
Se seleccionan las zonas con sangre y moco que se procese la muestra rápidamente, sino se lleva en un medio de
transporte.
Frotis Gram bacilos Gram (-), leucocitosis, nos sirven para orientar el diagnóstico.
Disentería bacilar (+).
La Shigella, es más sensible al verde brillante.
La Salmonella, medio de enriquecimiento.
Medios:
Mac Conkey.
EMB.
SS.
Se selccionan colonias lactosa (-) y a partir de aquí se hace un kliger, medio rojo, viraje en el pico fermentación
lactosa, rojo arriba, amarillo abajo. SH2(-).
Determinar la FAD (-) (Fenilalanildesaminasa), no puede quitar el grupo amino.
La galactosidasa con la prueba ONPG, en caso de S. desinteridae puede ser variable.
Tipificación serológica.
Salmonella
Muestras:
Heces.
Alimentos.
Medios de enriquecimiento, que inhiba el resto:
Caldo de tetrationato.
Caldo de selenito.
Siembra en medios diferenciales selectivos:
Mac Conkey.
A continuación se seleccionan las colonias lactosa (-)
Se hace un Kligger (slant):
Rojo abajo.
Amarillo arriba
SH2 (+), precipitado negro (SH2 + sulfato férrico).
ONPG (-)
FAD (-)
Diagnóstico serológico.
Ag flagelar y somático.
DOS PARA BACTERIAS DIVERSAS
Agar chocolate : contiene hematíes lisados a 50 ºC, por ejemplo para Haemophilus influenzae .
Agar con cetrimida : para gram negativas no fermentadoras de glucosa o Pseudomonas aeruginosa
Medio de Lowenstein-Jensen : asparragina, glicerol, huevo, patata y verde malaquita. Es un medio sólido y en
lengüeta, de color verde, utilizado para el crecimiento de micobacterias
INDICA LOS PROCEDIMIENTOS PARA OBTENER LA MUESTRA DE FARINGE
EXUDADO FARÍNGEO RÁPIDO
Para realizar un exudado faríngeo rápido se realiza un frotis rápido de la garganta. En cuestión de minutos, el análisis
puede mostrar la presencia de estreptococos del grupo A, que provoca faringitis estreptocócica y otras infecciones (como
neumonía, tonsilitis, escarlatina y meningitis).
La faringitis estreptocócica es una infección bacteriana que afecta la parte posterior de la garganta y las amígdalas, que se
inflaman e irritan, lo cual suele provocar un fuerte dolor de garganta, particularmente al tragar. Es posible que su hijo
presente manchas amarillas o blancas, o una película delgada sobre las amígdalas y la garganta. Además, los ganglios del
cuello se pueden inflamar y provocar dolor al tacto.
La faringitis estreptocócica es más común entre los niños de 5 y 10 años de edad. Hasta el 20% de los niños en edad
escolar pueden ser portadores de la bacteria sin presentar síntomas, pero los portadores pueden contagiar la infección. En
los niños, la faringitis estreptocócica puede provocar dolor en el cuerpo, dolor de cabeza, dolor de estómago, náuseas,
vómitos o languidez. La infección no suele estar acompañada de otros síntomas de resfrío, como tos, estornudos,
congestión os secreción nasal.
La mayoría de los dolores de garganta en los niños son provocados por infecciones virales que ceden solas sin necesidad
de tratamiento con antibióticos. Si bien la faringitis estreptocócica también desaparece en unos pocos días sin tratamiento
directo, los médicos recetan antibióticos con el fin de evitar complicaciones relacionadas, como la fiebre reumática.
Por qué se realiza
El exudado faríngeo rápido se realiza para ayudar a determinar con celeridad si el dolor de garganta de un niño es
provocado por una infección con estreptococos o por otros gérmenes (por lo general, virus) que no requieren tratamiento
antibiótico.
El médico puede solicitar un exudado faríngeo rápido si un niño:
Presenta síntomas de infección en la garganta por estreptococos y no tiene los síntomas típicos de una infección viral
Presenta dolor de garganta y ha estado en contacto con una persona con faringitis estreptocócica en casa o si hay muchos
casos de esta enfermedad en la comunidad
En algunos casos, los médicos realizan un cultivo en lugar del análisis rápido. El cultivo es más preciso que el análisis
rápido, pero es necesario esperar más tiempo (2 a 3 días) para obtener los resultados.
Cultivodel exudado faríngeo
El cultivo del exudado faríngeo o frotis faríngeo se realiza utilizando un hisopo especial para detectar la presencia de
estreptococo gropo A, que es la causa más común de la faringitis estreptocócicca.
Una muestra tomada de la pared posterior de la garganta se coloca en un plato especial (cultivo) que permite el
crecimiento de las bacterias. El tipo específico de infección se determina utilizando análisis químicos. Si no hay
crecimiento de bacterias, el cultivo es negativo y la persona no tiene una infección estreptocócicca.
La faringitis estreptocóccica es una infección bacteriana que afecta la parte posterior de la garganta y las amígdalas, que se
inflaman e irritan, lo cual provoca dolor de garganta particularmente molesto al tragar. Es posible que la garganta y las
amígdalas presenten manchas o una capa de color amarillo y, quizás, los ganglios linfáticos del cuello estén inflamados.
La faringitis estreptocóccica se presenta comúnmente en niños en edad escolar. La infección puede provocar
dolor de cabeza, dolor de estómago, náuseas, vómitos y languidez. Las infecciones estreptocóciccas de la
garganta no suelen ir acompañadas de síntomas de resfrío, como tos, estornudos, congestión o mucosidad nasal.
Si bien los síntomas de la faringitis estreptocócicca suelen desaparecer en unos pocos días sin tratamiento
directo, los médicos recetan antibióticos con el fin de evitar complicaciones relacionadas, como la fiebre
reumática.
Preparación
Pídale a su hijo que permanezca quieto durante el procedimiento. Asegúrese de informarle al médico si su hijo
ha estado tomando antibióticos recientemente e intente que su hijo no utilice enjuagues antisépticos para la boca
antes de realizarse el estudio ya que estos productos pueden afectar los resultados de la prueba.
El procedimiento
Un profesional de la salud le pedirá a su hijo que tire la cabeza hacia atrás y abra la boca lo más grande posible.
Si el profesional no puede ver con claridad la parte posterior de la garganta, presionará la lengua con un palillo
plano (depresor de lengua) para ver mejor. Se frotará un hisopo limpio de algodón contra la pared posterior de
la garganta, sobre las amígdalas y sobre las áreas enrojecidas o inflamadas con el fin de recolectar una muestra.
Tal vez desee tener a su hijo en sus faldas durante el procedimiento para evitar que se mueva y dificulte la
obtención de la muestra.
Qué esperar
Es posible que su hijo tenga arcadas cuando el hisopo entre en contacto con la pared posterior de la garganta. Si
le duele la garganta, quizás sienta una leve incomodidad cuando le froten el hisopo.
Obtención de los resultados
Los resultados del cultivo del exudado faríngeo suelen estar listos en dos días.
Riesgos
El frotis faríngeo puede resultar incómodo, pero no existe ningún riesgo asociado con este estudio.
Ayudar a su hijo
Si le explica el procedimiento en palabras que su hijo pueda comprender, lo ayudará a aliviar sus miedos.
Durante el análisis, ayude a su hijo a relajarse y quedarse quieto para que el profesional pueda frotar
adecuadamente la garganta y las amígdalas.
Si tiene alguna pregunta
Si tiene preguntas acerca del cultivo del exudado faríngeo, hable con su médico.
DESCRIBA EL TEMA DE PRUEBAS SEROLOGICAS INEXTENSO
Serología
La serología es el estudio que permite comprobar la presencia de anticuerpos en sangre. Es una prueba fundamental a la
hora de realizar donaciones de sangre y transfusiones. Este se basa en un examen serológico, que tiene como fin el
conocer la exposición o presencia previa de un microorganismo patógeno en particular y a partir de ella la capacidad de
respuesta del individuo a tal infección. Para ello se debe tomar una muestra de sangre en volumen apropiado según la
técnica que se emplee (ELISA, IFI, Western blot, IHA, etc). Se puede usar la sangre total o tomar solo el suero, el cual se
obtiene luego de centrifugar la sangre previamente coagulada, para eliminar las células sanguíneas de la reacción.
Este examen se realiza también para descartar sospechas sobre alguna infección, si se encuentran razones para
pronosticar una enfermedad existente, el examen se puede repetir a las dos semanas de la primera toma de muestra
sanguínea. La serología permite detectar infecciones o qué tanto el individuo es inmune a una infección o enfermedad
específica.
Las enfermedades detectables con la serología son las siguientes: sarampión, rubéola, carbunco, SIDA, hepatitis viral,
brucelosis, amebiasis, infección micótica, VSR, tularemia, sífilis, toxoplasmosis y una variedad de enfermedades más
Un serotipo es un tipo de microorganismo infeccioso clasificado según los antígenos que presentan en su superficie
celular. Los serotipos permiten diferenciar organismos a nivel de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología.
Así, un serotipo determinado es una subpoblación de un microorganismo infeccioso que se diferencia de otras
subpoblaciones de la misma especie por medio de pruebas serológicas. Por ello, las respuestas inmunitarias del
organismo frente a un serotipo de un microorganismo (p.e. la gripe) pueden no proteger frente a otro serotipo de la
misma especie.
Los serotipos pueden establecerse según factores de virulencia, lipopolisacáridos en bacterias gram-negativas, presencia
de exotoxinas, plásmidos, bacteriófagos, u otras características que diferencian a dos elementos de la misma especie a
través de varías pruebas.
Los términos serotipo y serogrupo son usados en conjunto con números, letras, o números romanos, con raíz en la
historia precedente.1
Pruebas serologicas
Hay una serie de pruebas que sirven para lograr esta clasificación:
ELISA
Western blot
Complejo mayor de histocompatibilidad
Inmunofluorescencia Directa e Indirecta
Prueba de aglutinación
Fijación del complemento
Precipitado
Neutralización
Reacción en cadena de la polimerasa
Hibridación del ADN
Cepa es, en microbiología, una variante fenotípica de una especie o, incluso, de un taxón inferior, usualmente propagada
clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades definitorias. De una manera más básica puede
definirse como un conjunto de especies bacterianas que comparten, al menos, una característica.
Existen sociedades científicas, las colecciones de cultivos tipo, que almacenan una gran diversidad de microorganismos y
que los difunden a petición de los investigadores; en dichas colecciones, la atribución taxonómica de cada clon está
perfectamente asegurada hasta el nivel de cepa.
Agrupaciones ERAM
Las cepas se pueden agrupar según sus características comunes:
biovar o biotipo, que son aquellas cepas que tienen características bioquímicas y fisiológicas especiales.
morfovar o morfotipo, con morfología especifica.
serovar o serotipo, con características antigénicas específicas.
patovar o patotipo, con propiedades patógenas para ciertos hospedadores.
fagovar o fagotipo, con especificidad para lisar ciertos bacteriófagos
LA TECNICA DE TINCION GRAM
Metodología
Recoger muestras.
Hacer el extendido en espiral.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram positivas se tiñen
de color azul-púrpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos (parte crítica de la coloración).
Enjuagar con agua.
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo
las bacterias Gram negativas.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
Explicación
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro
de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo
I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante
de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de
manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram
negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la
extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un
lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja
durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más
colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck,
pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se
modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos
pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de prosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son
violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto
tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por
consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la
tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número
de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis
grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en
absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera
coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La
reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras
causas.
Teorías
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la
pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape
del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona
empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma
una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en
las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con
yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una
combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos
anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en
soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera,
comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos
microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con
los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”.
Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que
constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los
microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos;
y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la
alcalinidad.
Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la
acidez.
En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de
sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos
gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran
afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes;
su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un
microorganismo por los colorantes básicos.
El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos
débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se
vuelve ácida en el curso del desarrollo.
Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivosBacillussubtilis y B. anthracis tomaban negativamente el
Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared
celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa
exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva
depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la
pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese
tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes
grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la
de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales
obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en
alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación,
dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La
pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sería prácticamente
impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser
absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo
formado después del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram.
Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del
complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los
principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.
Técnica de la coloración gram
Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina
portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el
portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la
extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el
calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de
las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano..
Tinción
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de
dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta
tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.
Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se
debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte
superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un
milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia
abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1% .
Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto más. El mordiente es
cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias.
Decoloración (paso critico)
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o
alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van
añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que
ya no escurra más líquido azul.
Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la
llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
Tinción de contraste
Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste
como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.
Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la
forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.
Bacterias resistentes a la tinción Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas:
Mycobacterias (están encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (pérdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).
Utilidades
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de
Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de
formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de
incubación.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden
aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas
(Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son
blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.
Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y
Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos
teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido
como mureína)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada
de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína,
fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La
clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas
lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas
es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee
es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo
tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer
una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente
orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
Causas que alteran la tinción de Gram
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede
variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y
teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo
que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse
controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).