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Universidad de Costa Rica
Facultad de Ciencias Agroalimentarias
Escuela de Agronomía
Reguladores de Crecimiento Vegetal AF-5408
Catalina Acuña Gutiérrez
A70049
Control hormonal de la síntesis de α- amilasa
Resumen
Con el objetivo de demostrar el efecto de las giberelinas sobre la síntesis de la alfa
amilasa, se realizó un ensayo utilizando dos concentraciones de éste regulador de
crecimiento; 0.1 ppm y 0.01 ppm de GA3. Se utilizó un medio agar agua al 2% al cual se le
añadió las distintas concentraciones de regulador y almidón. Se colocaron semillas de
avena en los platos petri, a las cuales se les había removido el embrión previamente, y se
evaluaron a las 24 y 48 horas con la ayuda de lugol al 4%. Luego se procedió a evaluar el
diámetro de la aureola formada alrededor de la semilla con una regla. El tratamiento con
0.1 ppm de GA3 fue el que consumió más almidón del medio en comparación con el de
0.01 ppm; por ende el primero presentó una aureola más marcada que el segundo.
Además, las evaluaciones realizadas a las 48 horas presentaron mayores diferencias entre
sí que los evaluados a las 24 horas.
Introducción
La germinación de las semillas está mediado por varios factores como los son la
temperatura, la cantidad de agua, la luz, la cantidad de oxígeno presente en el medio
donde germinará y los niveles hormonales adecuados (García et al. s.f.; Simón y Moysset
2006). Una vez que las semillas cumplen con los factores necesarios para la germinación,
se desencadenan procesos metabólicos, como lo son la síntesis de enzimas, las cuales
ayudan a acelerar el proceso de hidrólisis (Koolman 2004) del almidón para utilizar los
productos como energía, para seguir con el proceso de germinación.
Uno de los pasos de la germinación es el aumento en la producción de giberelinas
por parte del embrión. Ésta hormona se encarga de codificar los genes encargados de la
producción de la alfa amilasa, enzima que se encarga de desdoblar los almidones que se
encuentran almacenados en el endospermo, para ser utilizados por el embrión como
energía (Jordán y Casaretto 2006; Herrera et al. 2006).
La importancia de las giberelinas sobre la germinación de las semillas ha sido
aprovechada por la industria cervecera, y para uniformizar la germinación de las semillas
en los cultivos (Taiz y Zeiger 2006).
El objetivo de esta práctica es demostrar el efecto de diferentes concentraciones
de giberelinas sobre la síntesis de la alfa amilasa.
Materiales y métodos
Se preparó un medio agar agua al 2% con 200 mg de almidón por cada 100 ml de
medio. El medio fue dividido en tres grupos a los cuales se les debía adicionar diferentes
concentraciones de giberelinas. El primer tratamiento consistía en adicionar una
concentración de 0.1 ppm GA3, el segundo a una concentración de 0.01 ppm, y al tercero
no se le adicionaba GA3 ya que era el control (anexo 1). Posteriormente se calentó el
medio hasta lograr que se viera traslucido y se autoclavó por 20 minutos. Luego en
condiciones estériles fue dispensado en cajas petri.
Se utilizaron 120 semillas de avena, las cuales fueron desinfectadas con hipoclorito
de sodio al 2% en agitación por 20 min. Luego se llevaron a una cámara estéril donde se
realizaron tres enjuagues con agua desionizada autoclavada. Posteriormente se procedió a
cortar un tercio de la semilla para eliminar el embrión de ésta (Figura 1).
Embrión
Descartar
Fig.1. Sitio donde se debe de realizar el corte de
la semilla de avena.
Luego de cortadas las semillas, se procedió a poner 4 semillas por plato petri
(Figura 2), cada tratamiento contó con un total de 10 platos petri por tratamiento para un
total 40 semillas por tratamiento y 30 platos en total.
Fig. 2. Arreglo de las semillas en el plato petri
Se realizaron dos evaluaciones, una a las 24 horas y otra a las 48 horas. Para
analizar los resultados se preparó una solución de lugol al 4%, la cual fue vertida sobre
cada plato petri, luego se enjuagó con agua desionizada y posteriormente se procedió a
analizar el diámetro de la aureola formada alrededor de la semilla con una regla.
Resultados y discusión
La Figura 2 muestra que sí existen diferencias significativas entre el tratamiento de
0.1 ppm y el control, de igual forma el de 0.1 ppm y el de 0.01 ppm; sin embargo no se
encontraron diferencias significativas entre el control y el tratamiento 0.01 ppm (anexo 2).
El mayor diámetro de aureola fue formado por el tratamiento de 0.1 ppm GA 3, alcanzando
0.4 cm, seguido por el tratamiento de 0.01 ppm con 0.3 cm y por último el control con
0.16 cm.
0,6
*
Diámetro (cm)
0,5
0,4
0,3
Control
0,2
0.01 ppm
0.1 ppm
0,1
0
Tratamientos
Fig.3. Diámetro de la aureola formada alrededor de las semillas de avena para tres
diferentes tratamientos evaluado a las 24 horas. Las barras verticales
corresponden al error estándar. (*p<0.02)
El control presentó crecimiento de un halo a pesar de que no se le añadió GA3 al
medio. Este resultado resalta la importancia de remover por completo el embrión de la
semilla, ya que éste pudo haber sido el responsable de crear ese halo (Figura 4). Esto se
podría mejorar haciendo un corte a la mitad de la semilla en vez de un tercio de ésta, para
asegurarse de remover por completo el embrión; por esa razón es que no hay diferencias
significativas con el tratamiento de 0.01 ppm.
Fig.4. Ejemplo de semilla a la que no se le removió el embrión por completo
A las 48 horas todos los tratamientos presentaron diferencias significativas entre sí
(anexo2). La Figura 5, en comparación a la Figura 4, muestra una diferencia en el
crecimiento del halo al dejarlo 24 horas más, para un total de 48 horas. En el caso del
tratamiento con 0.1 ppm de GA3 se puede apreciar que el diámetro pasa de tener un halo
de 0.4 cm a las 24 horas, a uno de 1.2 cm a las 48 horas; el tratamiento de 0.01 ppm pasó
de tener una aureola de 0.3 cm a 0.8 cm a las 48 horas. El control disminuyó su halo ya
que pasó de un diámetro de 0.16 cm a 0.04.
1,4
*
Diámetro (cm)
1,2
1
*
0,8
Control
0,6
0,01 ppm
0,4
0.1 ppm
0,2
0
Tratamientos
Fig.5. Diámetro de la aureola formada alrededor de las semillas de avena para tres
diferentes tratamientos, evaluado a las 48 horas. Las barras verticales
corresponden al error estándar. (*p<0.02).
El cambio en el diámetro de la aureola en el control se atribuye al corte realizado
sobre la semilla ya que como se explicó anteriormente, pudo haber sido causa de partes
restantes del embrión.
Como se pudo apreciar comparando ambas figuras, el tiempo tiene un efecto
sobre la degradación del almidón en el medio. Esto se debe a que la actividad enzimática
cambia conforme transcurre el tiempo, ya que se va consumiendo el sustrato, hasta que
se agota y la reacción enzimática eventualmente comienza a disminuir (Primo 1995). Es
muy probable que a las 24 horas se estuviera iniciando actividad enzimática, que fue
desencadenada por la señalización por parte de las giberelinas, para comenzar la
producción de la alfa amilasa, por lo que ésta enzima estaba comenzando a consumir el
almidón al momento de la evaluación. A las 48 horas de tratamiento es muy probable que
la enzima haya digerido aún más almidón del medio, lográndose así un halo de mayor
tamaño de aureola en los tratamientos con giberelinas (Figura 6).
Las giberelinas cumplen una función muy importante durante la germinación de la
plántula ya que ésta hormona se encarga de ingresar al endospermo y llegar a las células
de la aleurona, promoviendo así la síntesis de alfa amilasa (Taiz y Zeiger 2006;
Santamarina et al. s.f.). La transcripción del gen que codifica a la alfa amilasa se
incrementa en presencia de las giberelinas (Curtis et al. 2006). En la Figura 4 y 5 se
muestra que existe una diferencia significativa entre las concentraciones de GA 3. Al haber
una mayor concentración de ésta hormona en el medio, en el caso de 0.1 ppm, genera
que se codifique más alfa amilasa que si hubieran concentraciones menores, como es el
caso de 0.01 ppm. Esto demuestra lo dependiente que es la generación de la alfa amilasa
a las concentraciones de giberelinas presentes en el medio.
Conclusiones y recomendaciones
La concentración de las giberelinas en el medio tienen un efecto directo sobre la
síntesis de la alfa amilasa, ya que se demostró que a dosis crecientes de éste regulador se
genera una mayor degradación de almidón en el medio.
Además, el tiempo influye sobre la velocidad en que la enzima va a hidrolizar el
almidón ya que se observó en la evaluación final, a las 48 horas de iniciado el
experimento, que se presentaba un halo mayor que a las 24 horas.
Se podría realizar futuros tratamientos con más concentraciones de giberelinas,
concentraciones de manera creciente, y relacionarlas con la velocidad de consumo del
almidón en el medio. Basándose en los resultados de tiempo del experimento, se podría
evaluar por más días para ver cuánto tarda en consumirse todo el sustrato.
A
B
C
D
E
F
Fig. 6. Tratamiento de 0.1 ppm de GA3. (A) evaluado a las 24 horas, (B) evaluado a las 48
horas; tratamiento 0.01 ppm de GA3 (C) evaluado a las 24 horas, (D) evaluado a las
48 horas; control (E) evaluado a las 24 horas, (F) evaluado a las 48 horas.
Literatura citada
Curtis, Barnes, Schneck, Flores. 2006. Invitación a la Biología, 6ª edición en Español.
Editorial Médica Panamericana. España. 768 pp.
García, F., Roselló, J., Santamarina, M. Introducción al funcionamiento de las plantas.
Editorial Universidad Politécnica de Valencia. Valencia, España. 163 pp.
Herrera, J.; Alizaga, R.; Guevara, E.; Jiménez, V. 2006. Germinación y Crecimiento de la
Planta. Editorial Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica. 29 p.
Jordán, M.; Casaretto, J. 2006. Hormonas y Reguladores del Crecimiento: Auxinas,
Giberelinas y Citocininas. Fisiología Vegetal. Ediciones Universidad La Serena. La
Serena, Chile. 28 pp.
Koolman, J., Rohm, K. 2004. Bioquímica: texto y atlas. Editorial Médica Panamericana.
Madrid, España. 88p.
Primo, E. 1995. Química orgánica básica aplicada: De la molécula a la industria. Tomo II.
Editorial Reverté. España. 1119 pp.
Santamarina, M., Roselló, J., García, F. s.f. Prácticas de biología y botánica. Editorial
Universidad politécnica de Valencia. 261 p.
Simón, E., Moysset, L. 2006. Prácticas de crecimiento y desarrollo de los vegetales.
Edisions de la Universitat de Barcelona. Barcelona, España. 83 pp.
Taiz, L. Zeiger, E. 2006. Fisiología vegetal Vol. 2. Publicacions de la Universitat Jaume I.
Castelló de la Plana, España. 888 pp.
Anexo 1. Cálculos realizados para las concentraciones de GA3 utilizadas en el experimento.
La concentración inicial de GA3 que se utilizó para la elaboración del ensayo fue de 500
ppm.
Para 0.1 ppm:
Cn1 * V1 = Cn2 * V2
500 ppm * V1 = 0.1 ppm * 300 ml
V1 = (0.1 ppm * 300 ml)/ 500 ppm
V1 = 0.06 ml = 60 µl
Se tomaron 60 µl de GA3 que se encontraba a 500 ppm y se disolvieron en 300 ml que era la
cantidad que se estaba preparando de medio, para llegar a una concentración de 0.1 ppm.
Para 0.01 ppm:
Cn1 * V1 = Cn2 * V2
500 ppm * V1 = 0.01 ppm * 300 ml
V1 = (0.01 ppm * 300 ml)/ 500 ppm
V1 = 0.006 ml = 6 µl
Se tomaron 6 µl de GA3 que se encontraba a 500 ppm y se disolvieron en 300 ml que era la
cantidad que se estaba preparando de medio, para llegar a una concentración de 0.01 ppm.
Anexo 2. Prueba t student de los datos analizados en el ensayo.
Tiempo
24
48
Relación
Varianza
T
Grados libertad
t0,02
p<0,02
control/0,01
0,03984
-1,66345
18
2,552
No significativo
control/0,1
0,04042
-4,32566
18
2,552
Significativo
0,01/0,1
0,04313
-2,58872
18
2,552
Significativo
control/0,01
0,04279
-11,92453
18
2,552
Significativo
control/0,1
0,03633
-20,32425
18
2,552
Significativo
0,01/0,1
0,05245
-6,14463
18
2,552
Significativo