Download Taller_integrador-2016

Cátedra de Cátedra de Biología Molecular y Genética – 2016
Nombre de los alumnos integrantes del grupo:
Taller integrador 2° Parcial:
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA.
a- Un virus contiene 256 proteínas, de las cuales 64 tienen una masa molecular de 1800 y las 192
restantes de 26000. Se disocia por completo el virus y se analizan sus componentes por electroforesis
SDS-PAGE. Dibuje un esquema del resultado esperado, indicando la posición e identidad de las bandas
proteicas y su intensidad relativa.
b- Se ha determinado la movilidad relativa de la lactato deshidrogenasa y de varias proteínas patrón en
electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5% en presencia de SDS, obteniéndose los valores de la
tabla. Calcule la masa molecular estimada de la LDH.
c- Se quiere separar una mezcla de las hemoglobinas HbA, HbS y HbC. Sabiendo que donde la
hemoglobina normal adulta, HbA, tiene un residuo de Glu la HbS tiene Val y la HbC tiene Lys, razone
qué medio utilizaría para realizar la electroforesis en gel: un tampón borato de pH=3.5 o un tampón
carbonato de pH=8.5. Dibuje un esquema con la posición de las bandas resultantes.
d- Una proteína en su estado nativo tiene un peso molecular de 115.000. i- Deduzca su estructura
cuaternaria (número de subunidades, PM de cada una de ellas, uniones que las estabilizan y
glicosilación de subunidades) a partir de los resultados de los siguientes geles de poliacrilamida en los
que se sembró la proteína pura, la cual fue previamente sometida a tres tratamientos (por separado) que
se indican abajo. Al final de la corrida electroforética, los geles fueron teñidos con Coomassie Blue, que
es un colorante azul que tiene afinidad por las estructuras peptídicas.
ii- La sensibilidad del Coomassie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aproximadamente 0,2
µg de proteína/banda. ¿Cree Ud. que es correcto afirmar que una proteína está pura si da una sola
banda en un gel teñido con ese colorante?
Resuelva el siguiente cuestionario:
1) ¿Cuáles son los objetivos y las utilidades de realizar la técnica western blot? Comente ejemplos.
2) ¿Cómo se realiza un sándwich y en que posición debe quedar el gel con respecto a la membrana? ¿Por
qué las proteínas se unen a la membrana? ¿Qué tipo de membranas conoce? ¿Cuáles son las
características principales que deben poseer?
3) ¿Cuáles son los controles que puede utilizar para saber que la transferencia se realizó correctamente?
4) ¿Por qué se bloquea la membrana? ¿Por qué se utiliza leche descremada al 5%? ¿Para qué es
importante lavar la membrana luego de bloquearla?
5) En una tinción indirecta ¿Qué reconoce el anticuerpo primario y qué el secundario?
6) ¿Por qué es importante lavar la membrana luego del reconocimiento del anticuerpo primario y
secundario?
7) ¿Cuáles son los métodos de detección y revelado que conoce?
Resuelva las siguientes situaciones problemáticas:
1) Teniendo en cuenta que en distintas investigaciones se ha encontrado que la SHP-1 asociada con el
SSTR2 depende de él para su activación. En la figura se observa la expresión de SHP – 1 (fosfotirosina
fosfatasa) y de SSTR2 (Receptor de somatostatina subtipo 2) en una línea celular de cáncer de tiroides
medular. Las células han sido tratadas con un medio control el cual poseía una concentración de
somatostatina (SRIF) a la cual se inhibe marcadamente la proliferación de esta línea celular o con un
inhibidor de PTP (fosfotirosinas fosfatasas). Observar el tamaño de la banda en cada caso, recordar
que esta técnica es cuantitativa. Indique la cantidad de las proteínas en cada carril, ¿esto dependerá
de lo que contenga el medio?
Figura 1: SHP-1 asociada con el SSTR2. Análisis de Western blot para SSTR2 y SHP-1 sobre extractos de
proteínas derivado desde células TT incubadas con o sin 10_8 M SRIF (somatostatina), 10_5 M V (inhibidor de
PTP), o ambos. (Starved, se refiere a las células que no fueron incubadas con un medio control)
(Endocrinology 146: 2692–2698, 2005).
2) Interpretación de Western Blot: recordar que esta técnica es cuantitativa.
Para interpretar la siguiente figura tienen que tener en cuenta que:



Varios factores de crecimiento son conocidos por inducir la fosforilación de tirosina en la fosfatasa
SHP-1, y la insulina se ha demostrado que interviene en la fosforilación de la Tyr536 en SHP-1 en una
línea de células de linfoma.
La somatostaina (un análogo es RC 160) es el ligando de SSTR2 y activa (estimula) a SHP-1.
Para determinar el efecto de la insulina y la somatostatina en el nivel de la fosforilación de la tirosina
en la SHP-1, se realizó Western blot de SHP-1 inmunoprecipitado con anticuerpos anti-fosfotirosina o
anti-SHP-1.
.
FIG: Efecto de la insulina y RC160 (un análogo de somatostatina) en la fosforilación de la tirosina
de SHP-1 en células CHO/sst2. A, Suero – hambreado de las células CHO/sst2 se incubaron a 37 ° C
durante horas con 100 nM de insulina (I), y se las separó en:
I+R: con 1 nM de RC160 nm.
I: sin 1 nM de RC160 nm.
El control (Cont) no fue tratado antes de la solubilización.
Los lisados celulares se inmunoprecipitadas con anticuerpos anti - SHP-1 (IP: SHP-1), sometidas a SDSPAGE, y analizados por inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina (Línea indicada por: blot
P-Tyr). En la figura de abajo la misma membrana fue tratada con los anticuerpos anti-SHP-1 (la línea
indicada por: blot SHP-1). Las flechas indican la posición de la SHP-1.(Bousquet et al., 1998, sst2
Somatostatin Receptor Mediates Negative Regulation of Insulin Receptor Signaling through the Tyrosine
Phosphatase SHP-1, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)
Conclusiones:
Observemos las bandas indicadas por I:
Las inmunoelectrotransferencias revelaron que SHP-1 fue rápidamente fosforilada en tirosinas en
respuesta a la insulina (Fig).
a- ¿Cuál fue la estimulación máxima de la fosforilación de la tirosina en SHP-1 por la insulina?
A los 10 minutos en nuestro curso del tiempo ¿qué se observa?
Observemos las bandas indicadas por I+R:
Además RC160, aplicado a las células estimuladas con insulina, suprime completamente el efecto
estimulante de la insulina sobre la fosforilación de la tirosina en SHP-1.
b- ¿Qué se observa a los 3 min?
Estos resultados indican que la tirosina SHP-1 es fosforilada seguida de la activación de los receptores
de insulina y que este efecto es suprimido por RC160.
3) Las mutaciones de la proteína G pueden causar muchas enfermedades. En el cáncer de próstata juegan
un rol muy importante. Por esto un grupo de cuatro científicos se interesó en comprender el papel que
desempeñan las subunidades αs y αi de las proteínas G en el cáncer prostático humano analizando su
expresión (cuantificación de mRNA y proteína), funcionalidad (cuantificación de la actividad
adenilatociclasa) y presencia de mutaciones.
Para esto se estudió el tejido proveniente de pacientes con y sin cáncer de próstata. Se aislaron
membranas de estas células y se midió la actividad adenilatociclasa mediante valoración de AMPc por
radioinmunoanálisis. También se cuantificó la cantidad de mensajeros de Gs, Gi y las subunidades α y
β fueron detectadas por western blot. Para analizar la presencia de mutaciones en la subunidad de la
proteína G se realizaron cortes con enzimas de restricción tanto de la subunidad αs como αi.
Los resultados obtenidos por estos científicos se muestran a continuación. En el cuadro a la derecha
de cada figura escriba la conclusión que merece cada resultado.
Conclusión 1:
Conclusión 2:
Conclusión 3:
Conclusión 4:
Conclusión 5:
Interpretación de marcadores moleculares de ADN
1- Utilizando la siguiente secuencia nucleotídica del gen del receptor 2 de somatostatina, involucrado en
cáncer, realice las siguientes consignas:
GTCAACTTCTTAGGGGTCAAAGTATGTGCTTTTTGAAGCCACAGCCCTCCCCGACATGTGCGTCAGCAGATGATGGCTGAACCC
AAACCCTTCCCTACTATTGGAAAAACAACTCAAAAAGTCTGCACACTGATGAGGAACTCTAGAGCTTAATGTTGATGTGGAAAGA
TAATACATTTTTCAATTTAAGAGTATGTCTGAGAGGCTAAACCAGAAATGTGTAAATTTGGTGAGACTTTAAACAGCCTGTGACC
GACGGGCCAATCTTCCTCTTTTCCTTCCAGATGTCACACTG
a- Escriba los cebadores, sentido y antisentido subrayados en la secuencia en sentido 5’3’,¿Qué
programa podría utilizarse para corroborar que los cebadores hibriden con la secuencia? Nombre tres
características que se tengan en cuenta para el diseño de los mismos.
b- Esta secuencia podría ser digerida con la Enzima de Restricción tipo II: Bpu1102I: G-CTNAGC (la
secuencia diana probable de la enzima, se encuentra resaltada con negrita en la secuencia). ¿Podría actuar
la enzima en la secuencia resaltada? ¿Por qué? Se encuentra marcada en negrita la secuencia diana en el
fragmento a amplificar, indique cual es el nucleótido polimórfico ¿Cuál es el nucleótido variable en la diana
de la enzima? En caso de que consideres que la Enzima reconocerá el sitio de restricción. ¿Qué tamaño
tendrán los fragmentos obtenidos?
c- Las muestras de varios pacientes fueron digeridas con la enzima Bpu1102I. Los resultados de la digestión
fueron verificadas mediante electroforesis en gel de agarosa. Esquematice el gel de agarosa incluyendo un
marcador de peso molecular que represente una escalera de 100pb, un fragmento amplificado sin digerir,
y los fragmentos digeridos de un individuo homocigota para el alelo A, otro para el alelo G y uno
heterocigota A/G.
2- Nosotros deseamos estudiar la frecuencia del polimorfismo T80C del gen SSTR2 en una población de pacientes
diagnosticados con cáncer de mama. En la siguiente figura se muestra la secuencia (5´--3´) que queremos
amplificar del exón 2 de dicho gen:
GCTGGCTGGAACTAGCCTAAGACTGAAAAGCAGCCATGGACATGGCGGATGAGCCACTCA
ATGGAAGTCAACCATGGCTATCCATTCCATTTGACCTCAATGGCTCTGTGGTGTCAACCAA
CACCTCAAACCAGACAGAGCCGTACTATGACCTGACAAGCAATGCAGTCCTCACATTCATC
TATTTTGTGGTCTGCATCATTGGGTTGTG
Te brindamos los siguientes datos:
Gen-Polimorfismo Cebador sense (5`-3`)
Cebador antisense (5`-3`)
Th ºC
SSTR2-T80C
GCTGGCTGGAACTAGCCTAA CACAACCCAATGATGCAGAC 55
Marca los cebadores en la secuencia y responde las siguientes preguntas:
a- ¿Con qué programa puede corroborar la hibridación de los cebadores? Teniendo en cuenta la temperatura
de hibridación informada qué ciclado propondría. ¿De qué tamaño, en pb, es el fragmento a amplificar?
b- En el fragmento a amplificar se encuentra marcado las secuencias de restricción de la enzima HincII: GTCAAC. Y el nucleótido polimórfico está subrayado en dicha secuencia, sabiendo que el polimorfismo es T80C.
¿Cuántos fragmentos observaré en la electroforesis si el producto amplificado fue cortado por la enzima de
restricción? ¿De qué tamaños serán dichos fragmentos digeridos?
Esquematice en un gel de agarosa como se observaría una muestra Homocigota T/T, Heterocigota y
Homocigota C/C. No olvide colocar un peso molecular de referencia.
3- a- Podría decirnos con que programa podría diseñar cebadores b- ¿para qué nos puede servir la información que
nos brinda este programa? c- Utilizando la siguiente secuencia nucleotídica donde se indica donde hibridan los
cebadores:
Secuencia del exón 5 del gen PTPN6, fosfatasa involucrada en cáncer y enfermedades inmunológicas, en la
secuencia se encuentra resaltado y subrayado los cebadores, y solo subrayados, los pares de bases polimórficos:
5´GTACCATGGCCACATGTCTGGCGGGCAGGCAGAGACGCTGCTGCAGGCCAAGGGCGAGCCCTGGACGTTTCTTGTGCGTGA
GAGCCTCAGCCAGCCTGGAGACTACGAGCTTTCTGTGCTCAGTGACCAGCCCAAGGCTGGCCCAGGCTCCCCGCTCAGGGTCAC
CCACATCAAGGTCATGTGCGAGGTAAGGTTCCTGCAGGA-3´
Coloque cuales serían los cebadores en las siguientes líneas:
Primer izquierda: 5`-____________________________________ -3`
Primer derecha. 5`-____________________________________ – 3`
d- Considerando la secuencia del punto anterior los cebadores amplifican una región de _____ pb. El sitio de corte
de la enzima AluI es: AG^CT y en esta secuencia reconoce el polimorfismo A670T. e- ¿Podría actuar la enzima en
alguno de los pares de bases polimórficos? ¿Por qué? f- ¿Cuál es el sitio polimórfico en la secuencia que reconoce la
enzima? g- Complete la información de la siguiente tabla y esquematice un gel de agarosa con los fragmentos
obtenidos luego de una digestión enzimática.
GENOTIPO
BANDAS
109 y 84 pb
_________________pb
_________ pb
4- Si Ud. trabaja en un laboratorio de Biología Molecular y tiene que poner a punto técnicas para detectar SNPs
(polimorfismos de nucleótido simple) comente:
- ¿qué reactivos necesitaría?
- ¿en qué tipos de geles resolvería los fragmentos amplificados?
Nota: si lo desea para este punto puede elegir un SNP en particular para tomarlo como ejemplo y desarrollar el
experimento.
5- Si Ud. está investigando un gen, como por ejemplo el Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
(CFTR), en el cual se conocen muchos polimorfismos pero además se sabe que pueden aparecer mutaciones
nuevas:
- ¿Qué técnica escogería, de las que se mostraron en teoría, para detectar un polimorfismo ya descripto? y
¿con qué polimorfismo comenzaría el estudio confirmatorio de la enfermedad? ¿Por qué?
- ¿Cómo haría para detectar si un fragmento amplificado contiene SNPs desconocidos?
- ¿En qué región de CFTR, teniendo en cuenta la estructura de un gen, nos interesaría encontrar
polimorfismos si se trata de un transportador de iones?
6- El gen TYMS (timidilato sintasa) presenta un polimorfismo de repeticiones en tándem de 28pb el cual se
encuentra en la región 5´UTR (TSER). En el laboratorio logramos amplificar estas regiones, obteniéndose según
el número de repeticiones los fragmentos del siguiente esquema:
Realizando un gel de agarosa para 5 muestras, se obtuvieron los siguientes resultados:
PM
1
2
3
4
5
C-
400pb
300pb
200pb
100pb
En el esquema observamos en el primer carril el peso
molecular (PM), indicando las bandas de 100, 200, 300 y
400 pb. De los carriles 2 al 6, se encuentran numeradas las
muestras del 1 al 5. En el carril 7 se encuentra el control
negativo de la reacción.
Observando el esquema interprete el número de repeticiones de TSER para las 5 muestras. Indique en cada caso
si el individuo es homocigota o heterocigota.
7-
Se amplificó el siguiente fragmento del exón 2 del gen SSTR2:
En rojo se indica la secuencia amplificada, en verde la secuencia que contiene el SNP C749T y en lila el SNP G846A,
en amarillo se muestra en ambas secuencia el nucleótido polimórfico. Luego de amplificar, se mandó al servicio de
secuenciación de MACROGEN (Corea) y se obtuvo el siguiente cromatograma:
Indique donde se encuentran los polimorfismos analizados y que alelo/s presenta el individuo en estas posiciones.
8- En los siguientes electroferogramas observamos dos individuos (A y B) con variantes alélicas indicadas
por flechas. Indicá en ambos casos qué alelos presentan cada uno de los individuos y especificá si la
variante se encuentra en homo o heterocigosis.
Indique donde se encuentra los polimorfismos analizados y que alelo/s presenta el individuo en estas posiciones.
A-
B-
Bibliografía:
Claros Díaz, M. G. 2001. “Bioquímica aplicada: Manual para el diseño experimental y el análisis de datos en
bioquímica y biología molecular” Asturias, España. Editorial Septem ediciones. Pag 51/56.
Cariaga Martinez, A. E., Zapata P. D. 2005 “El laboratorio de biologia molecular, una guia práctica”. Editorial
Universitaria de Misiones.
Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kai ser C, Krieger M, Scott M, Zipursky S, Darnell J. Biología celular y
molecular (quinta edición). Buenos Aires, Editorial Panamericana. 2005