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OCT1018_REDVET Estudio preliminar de efectos antimicrobianos “in vitro” del musgo Sphagnum magellanicum Brid. Resumen Existe actualmente una tendencia generalizada en el estudio y la utilización de plantas medicinales, efectuándose esfuerzos por la búsqueda de complejos que proporcionen nuevas sustancias activas con efectividad antimicrobiana. En el presente estudio se realizaron evaluaciones de la actividad antimicrobiana del musgo Sphagnum magellanicum (Pompón) en 2 estados; fresco y disecado, estéril y no esterilizado. Para llegar al principio activo del musgo se realizaron distintas extracciones a partir de agua, alcohol etílico al 96%, acetona y hexano y un proceso de rehidratación con calor, para el caso del musgo disecado. Para medir la actividad inhibitoria sobre diversos microrganismos, se utilizaron las siguientes bacterias Streptococcus agalactiae, Bacillus y hongos: cereus, Staphylococcus Escherichia coli, aureus, Salmonella enteritidis, Pseudomona aeruginosa, Malassezia pachydermatis y Candida albicans. La sensibilidad in vitro se determinó mediante la técnica standard de difusión en agar Kirby-Bauer. Los resultados obtenidos mostraron actividad antimicrobiana sólo del musgo en estado fresco y sin esterilizar, a partir del extracto realizado con acetona y hexano, en proporción de 1:2 y sin diluir. Los microorganismos más sensibles a la acción antimicrobiana del extracto de S.magellanicum fueron los hongos levaduriformes, luego se ubicaron las bacterias gram posituivas y en último lugar las bacterias gram negativas. Sobre P. aeruginosa no se observó actividad inhibitoria. Summary Among the most widespread trends in the study and use of medicinal plants are efforts in the search for new complexes to provide effective antimicrobial substances. The present study evaluated the antimicrobial activity of the moss Sphagnum magellanicum (Pompon) in two states: fresh and dried, sterile and non-sterile. To reach the active compund of the moss different extractions were made from water, 96% ethyl alcohol, acetone and hexane and a process of rehydration with heat, if moss is dried. During the research, the following bacteria and fungi were used as microorganisms for testings: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Malassezia pachydermatis and Candida albicans. The selection of the strains mentioned was representatives of gram-positive and negative bacteria groups, and yeast-fungi. The method used was the Bauer-Kirby standard technique, for the performance of susceptibility testing by agar diffusion with disks. The results obtained showed antimicrobial activity only in fresh moss and non-sterile, made from the extract with acetone and hexane. The most sensitive microorganisms to the moss were yeasts fungi then the Gram positive bacterias and last, the negative Gram. However in the case of P. aeruginosa, no activity was observed. Introducción La explotación del musgo Sphagnum magellanicum se ha realizado en Chile desde 1998, y el principal motivo ha sido su exportación a países como Taiwán, Estados Unidos y Japón, entre otros (Diaz et al., 2005; Zegers; et al, 2006). Este musgo se concentra entre las regiones IX a XII, donde se presenta un clima apropiado para su desarrollo. El clima al que se hace mención es conocido como ''templado frío”, con una temperatura promedio de 10ºC (Whinam; et al, 1997). La extracción del musgo es una actividad que desarrollan principalmente pequeños agricultores. El proceso de producción se inicia cosechando el musgo en los humedales de forma manual, para luego secarlo y trasladarlo a bodegas en donde mediante máquinas comercialización (Orueta, 2007). es procesado y envasado para su El tiempo de regeneración del musgo varía entre 3 y 5 años, tiempo que debiera ser respetado para favorecer una buena recuperación. Sphagnum magellanicum pertenece a la división Bryophyta, es una planta sin sistema vascular, debido a ello, se encuentra principalmente en áreas de luz escasa y húmeda. Absorbe la humedad y nutrientes directamente por la superficie de las hojas (Martínez; et al., 1999). Los musgos no poseen las mismas barreras anatómicas que las plantas vasculares, por lo que se ha sugerido que la acumulación de ciertos compuestos como los flavonoides, tienen un rol fundamental en su defensa y adaptación a condiciones causantes de estrés oxidativo. Esta capacidad de actuar como antioxidantes naturales le confiere a este musgo, una gran aplicación en el campo de los alimentos, la industria, la medicina, la cosmética, entre otros (Aubad et al., 2007). Dentro de las diversas cualidades que se le han descrito a este musgo, destacan entre otras, su gran poder de absorción y retenedor de agua características que permiten su aplicación para fines industriales y agrícolas( Schofield 1985) . Así también, en forma deshidratada puede ser utilizado como combustible y como descontaminante de metales pesados en derrames, entre muchas de sus aplicaciones (Crignola et al., 2002) . Recientemente un estudio realizado por Montenegro et al., 2009 demostró las propiedades antimicrobianas del musgo Sphagnum magellanicum en estado seco especialmente, contra microorganismos gram positivos. En el presente trabajo se investigó el comportamiento de un extracto obtenido a partir del musgo Sphagnum magellanicum frente a microorganismos gram positivos, gram negativos y dos especies de hongos levaduriformes, con el objetivo de corroborar y complementar los escasos estudios existentes sobre el tema, en nuestro país. Materiales y Métodos: Musgo Sphagnum magellanicum (5 Kg aprox.) en estado fresco y deshidratado procedente de una turbera del sector Metri, Carretera Austral Km 27, Puerto Montt. Cepas microbianas ATCC y de campo de bacterias gram positivas: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Bacillus cereus. Bacterias gram negativas: Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Hongos levaduriformes: pachydermatis y Candida albicans. Malassezia Solventes: Asociación de 400mL de Metanol, 1.100mL de Acetona y 2.200mL de Hexano. Equipos y material fungible común del Laboratorio de Microbiología de la Universidad Santo Tomás. Método: El musgo después de lavarse con agua destilada estéril fue molido en mortero, se disolvió en acetona y hexano en una proporción de 1:2 respectivamente, se agregó sulfato de sodio y finalmente se llevó a un rotavapor a 40°C durante 30 minutos aproximadaemte a fin de evaporar los solventes orgánicos. De acuerdo a metodología de Durán et al., 2004 y Rangel et al., 2001 adaptado al musgo Sphagnum magellanicum. Así se obtuvo el extracto concentrado, con el que se impregnaron los sensidiscos para los ensayos de sensibilidad antimicrobiana. Utilizando la técnica de sensibilidad in vitro de Kirby-Bauer se preparó un inóculo de acuerdo a un estándar de turbidez de 0,5 McFarland, su equivalente óptico (106 UFC/mL). El inóculo incubado por 24 horas a 37°C fue transferido a placas Petri, donde se depositaron los sensidiscos impregnados en el extracto de S. magellanicum, antes de 15 minutos. Los antibióticos utilizados como standard en bacterias Gram positivas fueron Amoxicilina y Cefradina, en Gram negativos se utilizó Sulfa Trimetoprim y Neomicina y en Hongos Miconazol y Nistatina. A las 24 horas de incubación se realizó la lectura de las placas. Todos los ensayos se realizaron en triplicado. La variable en este estudio fue descrita en términos de Promedio, Desviación Estándar y Coeficiente de Variación.La diferencia entre los promedios se determinó mediante la prueba de Tukey (p ≤ 0,05). Resultados y Discusión La extracción desde musgo disecado, tanto esterilizado como sin esterilizar, no mostró actividad antimicrobiana bajo las condiciones ensayadas. Esto podría explicarse debido a la termoestabilidad del extracto o la concentración del mismo. Musgo fresco Al igual que en el caso del musgo disecado, las extracciones realizadas con agua y alcohol etílico al 96%, no demostraron actividad antimicrobiana. Sin embargo al utilizar la extracción con acetona y hexano, se obtuvo halos de inhibición, según se observa en el siguiente cuadro. Cuadro N°1 Actividad antibacteriana de extracto S. magellanicum sobre bacterias gram positivas. Ensayo X ± D.E. C.V. C.V. C.V. C.V. Total (mm) S. aureus S. agalactiae B. cereus (%) Amoxicilina 26,33 ± 18,01a* 5,55 2,31 8,55 68,40 Cefradina 23,56 ± 9,07ab 7,56 2,31 9,3 38,49 Sphagnum 12,89 ± 3,65 b 15,60 3,42 6,57 28,31 magellanicum (*) Letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).D.E.= Desviación Estándar C.V.= Coeficiente de Variación El halo producido por el musgo S. magellanicum en bacterias Gram positivas fue menor, pero semejante estadísticamente al halo producido por Cefradina, siendo sólo diferente significativamente al halo producido por Amoxicilina (p ≤ 0,05) (Cuadro N°1). Existen varios estudios realizados a partir de plantas que demuestran actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, lo que coincide con el presente estudio en el caso de Sphagnum magellanicum. Dentro de estos estudios se puede mencionar que los extractos etanólicos, acetónicos y acuosos de Chilca blanca (Baccharis nitida) también mostraron actividad antimicrobiana contra S. aureus (Rangel y col., 2001). Del mismo modo los extractos orgánicos y acuosos de Tilo (Justicia pectoralis), según Vera (2007), también evidenciaron halos de inhibición al ser ensayados frente a S. aureus. Cuadro N°2 Actividad antibacteriana de extracto S. magellanicum sobre bacterias gram negativas. X ± D.E. C.V. C.V. C.V. C.V. (mm) E. coli S. enteritidis P. aeruginosa (%) Neomicina 19,00 ± 3,96a* 3,19 4,86 3,95 20,84 Sulfa 17,56 ± 13,27a 2,20 8,77 0 75,56 Ensayo Trimetropim 5,44 ± 3,65 b Sphagnum 26,64 19,94 0 67,09 magellanicum (*) Letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas (p ≤ 0,05). D.E.= Desviación Estándar; C.V.= Coeficiente de Variación En el caso de las bacterias Gram negativas el musgo S. magellanicum presentó una respuesta menor, en efecto. S. magellanicum mostró un mayor poder antibacteriano contra bacterias Gram positivas que contra Gram negativas, lo que coincide con los resultados del estudio realizado por Kang y col. (2006). La acción mas potente presentada por el extracto del musgo en bacterias gram positivas que gram negativas, puede explicarse, probablemente, por algún efecto sobre la pared bacteriana (peptidoglicano).En tal caso su actividad podría asemejarse a la de los antibióticos betalactámicos. Cuadro N°3 Actividad antimicótica de extracto S. magellanicum sobre hongos del tipo levaduriformes Ensayo X ± D.E. C.V. C.V. C.V. (mm) C. albicans M. pachydermatis (%) Miconazol 32,00 ± 8,76a* 4,01 0 27,37 Sphagnum 26,67 ± 2,73a 0 2,35 10,23 2,50 ± 2,33 b 0 0 93,2 magellanicum Nistatina (*) Letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas (p ≤ 0,05). D.E.= Desviación Estándar C.V.= Coeficiente de Variación Mejor aún que los resultados inhibitorios obtenidos sobre bacterias gram positivas fueron los que se obtuvieron sobre C. albicans y Malassezia pachydermatis (levaduras). A pesar que el halo producido por el musgo S. magellanicum sobre estos hongos, fue menor, que el generado por Miconazol, estadísticamente fueron semejantes. Como puede evidenciarse estos resultados demuestran que existe un evidente efecto antifúngico del extracto del musgo S. magallanicum en estado fresco, sobre hongos levaduriformes. Esta investigación entrega nuevos antecedentes metodológicos, para preservar las propiedades antmicrobianas observadas en el musgo S. magellanicum, abriendo una esperanza para futuros estudios más concluyentes, tendientes a la cuantificación e identificación de los compuestos fenólicos, responsables específicos, de esta respuesta farmacológica. Y lo más importante al ser un producto natural, permite pensar en múltiples aplicaciones industriales, como por ejemplo, en el embalaje de alimentos u otros productos en los que no se permita la presencia de sustancias inhibidoras. Conclusiones: Se observaron fuertes evidencias de efectos antimicrobianos ''in vitro'' del musgo Sphagnum magellanicum. El extracto de Sphagnum magellanicum demostró mejores efectos inhibitorios sobre hongos levaduriformes, luego sobre bacterias gram positivas y finalmente un efecto más reducido sobre bacterias gram negativas. Sólo se obtuvieron resultados positivos a partir de extractos de musgo en estado fresco. 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