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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico ACTIVACIÓN DEL MECANISMO DE ARN DE INTERFERENCIA PARA SILENCIAR LA EXPRESIÓN DEL GEN RAB5 EN CAMARÓN (LITOPENAEUS VANNAMEI) MEDIANTE ARN DE DOBLE CADENA Guillermo Arturo Adams Quiñónez Universidad de Occidente [email protected], Antonio de Jesús Rivera Loredo Universidad de Occidente [email protected]. Asesor Dr. Píndaro Álvarez Ruiz [email protected] Planteamiento Las enfermedades virales y bacterianas siguen siendo la principal amenaza para los cultivos acuicolas en todo el mundo. Se ha demostrado que el RNA de interferencia (RNAi) dirigido al silenciamiento de genes, es una herramienta sumamente efectiva para contrarrestar la replicación viral. El RNAi es un mecanismo celular que se inicia cuando un RNA de doble cadena largo (dsRNA), es procesado a RNAs pequeños que son guiados a secuencias complementarias en el RNA mensajero (mRNA) para degradarlo de manera específica. En este sentido, las proteínas Rab son pequeñas GTPasas que regulan el transporte, acoplamiento y fusión de vesículas durante la endocitosis de partículas, incluyendo virus. En camarones, el silenciamiento de Rab7 confirió un efecto antiviral. En otros organismos Rab5 participa antes que Rab7 en el proceso de infección. Por lo anterior, el objetivo de este estudio es construir una molécula de dsRNA con la secuencia del gen Rab5 de camarón y evaluar su poder de silenciamiento. Metodología Se detectó la secuencia del gen Rab5 en camarón blanco (Litopenaeus vannamei) (Por lo que la llamamos LvRab5) y se clonó en el vector de clonación pGEM-T Easy vector (Promega). Mediante la enzima T7-RNA polimerasa se sintetizaron las cadenas de RNA-antisentido de LvRab5 y mediante la enzima SP6-RNA polimerasa se sintetizaron las cadenas de RNA-sentido de LvRab5. Ambas cadenas de RNA (sentido y antisentido) fueron purificadas con TRIzol (Life Technologies) y formados por complementariedad los dsRNAs. Se realizó un experimento con camarones de 5 ± 1g colocados individualmente en acuarios de 5 L con agua de mar a 30 UPS y aireación constante. Se manejaron tres tratamientos con 24 organismos cada uno: 1) camarones inyectados con dsRNA de LvRab5. 2) camarones inyectados con un dsRNA ajeno al camarón (16S bacteriano). 3) camarones inyectados con Bufer PBS 1X. Se tomaron muestras de hemolinfa y branquias de dos organismos por tratamiento a las 0, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas post tratamiento y se evaluó la expresión de LvRab5 mediante RT-PCR. Se midió la expresión de β-actina como control interno de las reacciones. Conclusiones generales Los resultados indicaron que la cantidad de mRNAs del gen LvRab5 en hemocitos disminuyó significativamente a partir de las 36 horas post tratamiento. En tejido branquial se observó una tendencia similar, sin embargo el silenciamiento fue menos evidente. Estos resultados demuestran que es posible silenciar el gen LvRab5 en camarón blanco, por lo tanto será necesario realizar otros experimentos para determinar si está involucrado en el proceso de infección de virus que afectan al camarón. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014
