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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
PREPARACION DE MUESTRAS PARA SECUENCIACION CAPILAR
Vargas Jiménez Juan Edilberto, Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma de Baja
California, [email protected]. M. en C. Marcos Daniel Martínez Peña, Centro
Nacional de Recursos Genéticos (CNRG-INIFAP) Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales Agrícolas y Pecuarias [email protected]
Planteamiento del problema
La identificación genética de bacterias ha tomado importancia en los últimos 10
años. La preparación de muestras para la secuenciación de blancos moleculares
es crucial para la Colección de Microorganismos del CNRG (CM-CNRG). La
preparación inicia con la extracción de DNA de las cepas a identificar y su
evaluación para determinar si tiene la calidad suficiente para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para el gen 16S rDNA y la purificación mediante el
uso de perlas magnéticas. Con la estandarización de estos procesos se asegura la
identidad de las cepas incluidas en la CM-CNRG.
Metodología de la investigación
La identificación con base al DNA bacteriano es de suma importancia para la CMCNRG. En esta colección se emplean métodos comerciales de extracción de DNA
o se extrae por la técnica de fenol cloroformo, el DNA genómico se visualizó por
corrimiento electroforético en geles de agarosa al 0.8% para determinar la
integridad del DNA. La cuantificación se realizó mediante la comparación con un
estándar de concentración, siguiendo las medidas de seguridad para laboratorios
de microbiología. Una vez extraído el DNA bacteriano se realizó una PCR con
iniciadores reportados en la literatura para amplificar los primeros 500 pb del gen
16S rDNA, la amplificación se visualizó mediante un corrimiento electroforético en
geles de agarosa al 1.5%. La purificación de los amplicones se realizó mediante
un sistema comercial con base a la unión del DNA a perlas magnéticas. Las
muestras purificadas son enviadas al servicio de secuenciación. Con las
secuencias obtenidas se realiza la identificación mediante un análisis
bioinformático para la edición de las secuencias y la identificación se realiza
mediante un análisis BLAST y una reconstrucción filogenética.
Resultados y Conclusión
Se trabajó con 33 cepas de bacterias a las cuales se les realizó la extracción de
material genético por el método modificado de Wilson (1990). Las muestras
presentaron la calidad suficiente para realizar la PCR. Se obtuvieron 26
amplicones de las 33 cepas trabajadas, y se enviaron 26 amplicones al servicio de
secuenciación. La edición de las secuencias se realizará mediante diferentes
programas computacionales para determinar su identidad con base a los criterios
de Rossello-Mora y Aman.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014