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Dpto. Biología y Geología. Prof. Eduardo Benítez.
Cultura Científica 1º Bachillerato. Biotecnología.
BIOTECNOLOGÍA: INGENIERÍA GENÉTICA (E)
LABORATORIO VIRTUAL V: MANIPULACIÓN IN VITRO DE ÁCIDOS
NUCLEICOS- MODIFICACIÓN DE EXTREMOS POR RESTRICCIÓN,
ELABORACIÓN DE ADN RECOMBINANTE. CLONAJE Y EXPRESIÓN IN VIVO
Completa el informe de laboratorio utilizando la información de estas webs:
Animación 1. http://www.mhhe.com/sem/Spanish_Animations/sp_cloning_gene.swf
Animación 2. https://www.nlm.nih.gov/exhibition/fromdnatobeer/exhibition-interactive/recombinantDNA/recombinant-dna-technology.html
Animación 3. https://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html
Animación 4. http://www.mhhe.com/sem/Spanish_Animations/sp_genetic_engineering.swf
Animación 5. https://www.dnalc.org/resources/animations/transformation1.html
Animación 6.
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/cloning/cloning.htm
Lectura 1.
a) http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos3.
htm
b) http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos5.
htm
c) http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos6.
htm
Labo1. http://www.pbs.org/wgbh/harvest/engineer/transgen.html
Labo2. http://www.xplorehealth.eu/es/media/produce-una-diana-farmacologica
Labo 3. http://www.hhmi.org/biointeractive/transgenic-fly-virtual-lab
Nombre y apellidos:
Grupo:
Título de la práctica:
Fecha:
ANTECEDENTES
En la última práctica llevamos a cabo un análisis de restricción de un plásmido bacteriano y de
los RFLP’s de un paciente. Esta vez vamos a clonar un gen utilizando las herramientas que
aprendimos en la práctica anterior. Clonar un gen no es lo mismo que clonar un organismo
completo, por ello, cuando clonamos un solo gen hablamos de clonaje y cuando clonamos un
organismo completo hablamos preferiblemente de clonación.
Antes de que existiese la PCR se utilizó el clonaje de genes como método de amplificación, sin
embargo, la velocidad con que se puede llevar a cabo la PCR ha supuesto que el crear copias
de ADN in vitro desbanque al método in vivo. Actualmente el clonaje de genes es utilizado con
otras finalidades:
-
Crear “genotecas/bibliotecas genómicas”: cultivos celulares que contienen plásmidos
con secuencias de ADN específicas. De este modo se puede disponer de una secuencia
de interés con facilidad para realizar nuevos estudios con ella y se permite conservar el
genoma de organismos de interés: individuos con patologías únicas, ADN extraído de
restos arqueológicos, ADN de especies en peligro de extinción…
Calificación:
/10
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-
Producir proteínas u otros compuestos de interés en sistemas celulares heterólogos
(células de organismos distintos a aquellos que contienen esos genes en la naturaleza).
Crear tipos celulares u organismos con nuevas actividades (transgénicos/Organismos
Modificados Genéticamente/GMO’s).
1. ¿En qué grandes pasos se desarrolla la técnica del ADN recombinante o clonación celular?
(Lectura1a/Animación 1)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
2. Cita ejemplos específicos de aplicaciones que se hayan conseguido con ella. (Lectura1bc/Animación2 ):
3. Define (Lectura1a):
 Vector de clonación (define y enumera los tipos):
 Extremos cohesivos:
 ADN inserto:
 Muesca, mella o Nick:
 ADN recombinante:
 Célula hospedadora, anfitriona o receptora (indica los tipos):
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4. ¿En qué consistió el primer experimento de ingeniería genética llevado a cabo por Cohen
y Boyer en 1973? (Animaciones 4 y 5).
MATERIAL Y MÉTODOS GENERAL
5. ¿Qué métodos conoces para aislar el ADN de interés y fragmentarlo para conseguir el
inserto? (Lectura1a)
6. ¿Con qué herramienta genética podemos obtener extremos cohesivos en el plásmido
vector? (Lectura1a)
7. ¿Con qué herramienta genética podemos unir el vector con el inserto? (Lectura1a)
8. ¿Qué métodos podemos utilizar para introducir el ADN recombinante en la célula
hospedadora? Indica brevemente en qué consiste cada uno. (Lectura1a-ampliación)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
9. ¿Cómo se consigue “engañar” a la membrana plasmática para introducir un plásmido
desnudo a través de la misma sin que se repelan las cargas negativas del plásmido y los
fosfolípidos? (Animación3):
LABORATORIO 1. OMG VEGETAL, MEJORA VEGETAL
MATERIAL Y MÉTODOS
10. En el laboratorio 1 vas a utilizar el clonaje de ADN para generar un organismo modificado
genéticamente o transgénico. Responde (Labo1):
 ¿Con qué finalidad estás llevando a cabo esta modificación genética? ¿Es peligrosa
para el consumo humano?
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 Además del gen del Bacillus thuringiensis, ¿qué otro gen estamos introduciendo con
el vector?
 ¿Qué método utilizarías para introducir el plásmido recombinante en la bacteria
Agrobacterium tumefaciens?
 ¿Por qué nos interesa clonar este plásmido en Agrobacterium tumefaciens y no en
otra especie bacteriana o por clonación acelular (PCR)?
 ¿Los medios de cultivo para crecer bacterias o células eucariotas vegetales son
iguales?
 ¿Qué método has utilizado para seleccionar las bacterias y quedarte solo con las que
han incorporado el transgén (clones recombinantes)?
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
11. ¿Has tenido éxito en la generación de tu tomatera transgénica? ¿Cómo lo sabes?
LABORATORIO 2. OMG BACTERIANO, FARMACOGENÉTICA-PRODUCCIÓN PROTEÍNAS
ANTECEDENTES
El enzima POP se encuentra sobreexpresado en cerebros de pacientes con esquizofrenia. Se
piensa que si se inhibe su actividad los síntomas de esta enfermedad mental podrían
disminuir. Por ello se considera que POP puede ser una buena diana terapéutica.
Para producir nuevos fármacos es preciso disponer de grandes cantidades de la diana sobre
la que queremos que actúen. Obtener grandes cantidades de POP a partir de cerebros de
pacientes con esquizofrenia es difícil ya que la disponibilidad de la muestra es muy escasa.
OBJETIVO
En este laboratorio nos encargaremos de generar bacterias transgénicas que produzcan
grandes cantidades de POP para que, en una segunda fase del proyecto, podamos probar
nuevos fármacos sobre este enzima y tratar de curar la esquizofrenia.
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MATERIAL Y MÉTODOS
12. Haz un listado del material necesario para llevar a cabo nuestro proyecto (la nevera
está a la derecha de la imagen):
1)
9)
2)
10)
3)
11)
4)
12)
5)
13)
6)
14)
7)
15)
8)
16)
13. Marca con una “X” la opción correcta.
1) Lo primero es preparar nuestro inserto. Para ello:
a) Pipeteamos nuestro enzima de restricción, EcoRI, en el tubo eppendorf que contiene el
b)
c)
ADN con el gen que queremos insertar. EcoRI encuentra las dianas de restricción y libera el
gen POP al sobrenadante.
Pipeteamos nuestro enzima de restricción, EcoRI, en el plásmido que contiene el inserto.
EcoRI encuentra las dianas de restricción y libera el DNA de interés al sobrenadante.
Pipeteamos nuestro enzima de restricción, Taq1, en el tubo eppendorf que contiene el
ADN con el gen que queremos insertar. EcoRI encuentra las dianas de restricción y libera el
gen POP al sobrenadante.
2) A continuación añadiremos el inserto al tubo eppendorf con el plásmido que hemos
cortado previamente con el mismo enzima de restricción.
a) Las bases nitrogenadas de los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se aparean
espontáneamente y ya tenemos completo el plásmido recombinante.
b) Aunque las bases nitrogenadas de los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se
c)
aparean espontáneamente, los esqueletos azúcar fosfato del ADN del plásmido y el inserto
no se unen entre sí, quedan nicks o mellas, que hay que reparar mediante la DNA ligasa.
El plásmido y el inserto se aparean mediante un choque osmótico y térmico lo que propicia
la fromación de los enlaces en los extremos romos de ambos.
3) A continuación añadiremos el inserto al tubo eppendorf con el plásmido que hemos
cortado previamente con el mismo enzima de restricción.
a) Las bases nitrogenadas de los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se aparean
espontáneamente y ya tenemos completo el plásmido recombinante.
b) Aunque las bases nitrogenadas de los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se
c)
aparean espontáneamente, los esqueletos azúcar fosfato del ADN del plásmido y el inserto
no se unen entre sí, quedan nicks o mellas, que hay que reparar mediante la DNA ligasa.
El plásmido y el inserto se aparean mediante un choque osmótico y térmico lo que propicia
la fromación de los enlaces en los extremos romos de ambos.
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4) El método de introducción del plásmido en las bacterias consiste en:
a) Tratar las bacterias con cloruro de calcio de modo que la carga positiva del calcio atenúe
b)
c)
la repulsión entre las cargas negativas de los fosfolípidos y las cargas negativas del
plásmido. Por eso se guardan en la nevera, el frio estabiliza la unión entre el calcio y los
fosfolípidos.
Se le da el plásmido con cuchara y se le dice a la bacteria “que viene el avioooon” y ella
solita se lo come.
Lo mismo que la opción a y además se induce un choque térmico poniendo las bacterias a
42ºC. Esto hace que, debido a que la cantidad de sales en el exterior celular es mucho más
grande que en el interior, se forme una corriente iónica hacia dentro de la célula que
“empuja” el ADN al interior.
5) La eficiencia de la transformación bacteriana no es del 100%. Algunas bacterias no
incorporan el plásmido. ¿Qué hacemos para quedarnos solo con aquellas que lo tienen
y no trabajar con las que no lo incorporan?
a) Las rociamos con un pesticida.
b) Las ponemos en un medio de cultivo selectivo. El medio tiene un antibiótico (kanamicina,
c)
ampicilina) y como nuestro plásmido tiene un gen de resistencia a ese antibiótico las
bacterias que lo hayan incorporado serán resistentes al antibiótico y sobrevivirán mientras
que las que no lo incorporan se mueren.
No pasa nada, nos sobra tiempo y dinero, las cultivamos todas, luego aislamos y
purificamos las proteínas de todas las bacterias, con un western blot detectamos cuáles
han producido la proteína POP y volvemos a cultivar solo las que producen POP para
obtener mayores cantidades.
6) La técnica que microbiológica que hemos utilizado para “sembrar” en la placa petri y
aislar colonias de bacterias consiste en:
a) Por dilución y extensión en placa. Es decir, diluir mucho las bacterias, verterlas en el
b)
c)
centro de la placa Petri con una pipeta y extenderlo por todo el cultivo.
Por agotamiento mediante siembra en estría múltiple: con el asa de siembra esterilizada
en la llama del mechero Bunsen se toma una muestra de las bacterias y se aplica sobre el
cultivo haciendo cuatro grupos de estrías de modo que en la última estría queden colonias
aisladas.
No se aíslan durante el cultivo. Luego hacemos citometría de flujo y las separamos
mediante un láser que las identifica.
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Cultura Científica 1º Bachillerato. Biotecnología.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
7) Aunque en un estudio real ya sabríamos qué gen de resistencia tiene nuestro plásmido
y no haríamos tantos cultivos, en este laboratorio hemos probado suerte y hemos
clonado un plásmido que no sabemos qué gen de resistencia contiene. De los tres
cultivos que se muestran ¿cuál nos interesa?
a) El primero porque tiene ampicilina y se han aislado bacterias resistentes a este antibiótico.
b) El segundo porque con la kanamicina hemos conseguido matar todas las bacterias.
c) El tercero porque si no ponemos antibiótico es mejor ya que sobreviven todas.
Amp
Kan
/
8) ¿Hemos conseguido nuestro objetivo?
a) Sí, hemos aislado bacterias resistentes a ampicilina.
b) Sí, hemos aislado bacterias con el plásmido que queríamos clonar y las hemos puesto a
c)
crecer en un cultivo en agitación para que se reproduzcan y así obtener grandes
cantidades del enzima POP que será nuestra diana terapéutica.
No, no hemos conseguido desarrollar el fármaco contra la esquizofrenia que queríamos.
LABORATORIO 3. OMG ANIMAL
En el laboratorio 3 también se busca generar un organismo modificado genéticamente, en
este caso Drosophila melanogaster. Se pretende hacer que estas moscas sean
bioluminiscentes.
1. Si formases parte de un comité de bioética que debe asignar una subvención a un
proyecto de investigación de biotecnología, ¿a cuál de los tres proyectos estudiados
concederías los fondos? ¿Por qué?
2. Este es un laboratorio más complejo y que exige un nivel elevado. De manera
opcional y voluntaria puedes jugar con el laboratorio3 y hacer un resumen sobre el
procedimiento que has seguido y los resultados obtenidos. Para tu proyecto final
puede resultar útil que te fijes en los pasos que hay que seguir para generar un
organismo transgénico desde el principio.