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INMOVILIZACION DE ENZIMAS -1
Dr. J. V. Sinisterra
Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com
Estabilidad de la lipasa de C. rugosa almacenada a distintas temperaturas
Reacción test. Hydrolysis de aceite de oliva.
Diseño de biocatalizadores con una elevada actividad por unidad de volumen
Una elevada actividad específica (U/ cat) es beneficiosa para un proceso escalable
pues así se requiere menor volumen de reactor para lograr la msima actividad.
En general el boiocatalizador no supera el 10% de la masa total y el “catalizador”
Suele ocupar entre el 10-20% del reactor.
Hay dos metodologías para obtener biocatalizadores robustos con altas cargas
de actividad
High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de enzima
inmovilizada.
CLEA.- Carrier-bound-cross linked enzymes
Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226
High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de
enzima inmovilizada.
Se obtienen jugando con la superficie del soporte y el tamaño de poro.
La relación enzima/soporte varia entre 0.1 y 0.2
El soporte suele tener unos 200 m2 /g y el tamaño de poro es de unos 100nm
Esto permite que muchas moléculas de enzima entren en el interior del soporte
Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226
CLEAS.- Carrier – bound cross-linked enzyme aggregates
CLEAs are prepared by 1) aggregation of enzymes
2) chemical cross-linking of enzyme aggregates
The main problem is that the particles size is < 10 µm- difficult to separate
from the reaction mixture
Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas
IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES
O
C
H
ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES
(polialdeh
ídos)
(polialdehídos)
Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas
IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES
O
C
H
ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES
(polialdeh
ídos)
(polialdehídos)
Inmovilización de enzimas
ADSORCIÓN
UNIÓN COVALENTE
ENZIMAS
ATRAPAMIENTO
1.-atrapamiento en micelas
2.- atrapamiento en organogeles
3.- atrapamiento en sistemas sol-gel
CLEAS
Inmovilización de enzimas
Requerimientos del método de inmovilización
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
Método sencillo
Método reproducible
Método suave en las condiciones de reacción
Método económico
Método seguro
Método versátil
Método factible de escalado
Buena congruencia geométrica enter la superficie del soporte y la enzima
Elevada demsidad de grupos activos por unidad de superficie en el soporte.
Métodos de inmobilización de una enzima monomérica
¿Es inerte el soporte?
En los procesos en que se trabaja con poca agua, la capacidad de captación de
agua por el soporte es determinante de la actividad catalítica
´
Se determina mediante la AQUOFILIA
Se dteermina con 1% de agua,
100mg de soporte y 1,5 mg de
Enzima unida
Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)
Actividad de la α-quimotripsina inmovilizada en distintos soportes,
en la esterificación de L-N-acetilfenilalanina con etanol
Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)
¿Qué residuos aminoacídicos se pueden utilizar para la inmovilización?
Los mas abundantes y
Los mas expuestos al
medio
Grupos reactivos
Criterios para seleccionar la metodología de inmovilización
1) Estabilidad del biocatalizador inmovilizado
2) Facilidad de manejo del biocatalizador inmovilizado
3) Soporte: precio, aquofilia, estabilidad, resistencia a la contaminación
Bacteriológica.
4) Naturaleza y estructura de la enzima
Criterios para seleccionar una reacción de inmovilización
1) Reacción sencilla
2) Reacción reproducible
3) Reacción que se lleve a cabo en condiciones suaves de T, medio de reacción etc.
4) Reacción barata
5) Reacción segura
6) Reacción escalable
Tipos de soportes
1) polisacaridos: sefadex, celulosa, agarosa, agar, quitina, etc
2) Soportes inorgánicos: óxidos metálicos, vidrio poroso, silice etc.
3) Proteinas fibrosas : colágeno, queratina etc.
4) Polímeros sintéticos : poli-acrilatos, poli- acrilamidas, alcohol polivinílico
5) Hidrogeles iónicos: alginato, pectato, carraginano etc.
Inmovilización por adsorción
Métodos de
activación de
soportes
Métodos de
activación de
soportes
La funcionalización mas utilizada de los soportes es el grupo epóxido
ya que permite muchas modificaciones de la superficie para interaccionar
con los distintos grupos funcionales de la proteína
El proceso de unión covalente es un proceso que ocurre en varios pasos
Union covalente a soportes polifuncionales
Si se quiere inmovilizar vía grupos ácido de la proteína
El empleo de las carbodiimidas se considera como el método
de elección
Inmovilización de
α-chimotripsina en
un copolimero PE/HENMA
Síntesis de Tyr-Leu
Inmovilización via grupos sulfuro
HCH3
CH3
COOH
COOEt
lLipase
C. rugosa
Inmovilización
Proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente los grados de libertad
de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc... por su unión a un soporte
(Taylor, Protein immobilization: fundamentals and applicatrions, 1991.)
Ventajas:
Mayor estabilidad enzimática.
Disminución interacciones proteína-proteína.
Facilidad de manipulación del microentorno
Disminución de costes por reutilización
Fácil separación del biocatalizador del producto
Inconvenientes
Alteración de la conformación enzimática.
Existencia de sistema soporte-enzima heterogéneo.
Posible pérdida de actividad enzimática
Métodos de inmovilización:
Fisicos: Atrapamiento, encapsulación, inclusión
Químicos: entrecruzamiento o unión directa al soporte
Unión directa:
Inmovilización por adsorción: hidrofóbica (Octil-Agarosa, EP100), iónica (Duolite)
Inmovilización covalente (Eupergit)
OH
O
H2N
Eupergit C
Enzima
NH