Download INTERRUPCION IN-VITRO DE EL GEN PARP (POLI ADP

INTERRUPCION IN-VITRO DE EL GEN PARP (POLI ADP-RIBOSIL
POLIMERASA) DE EL HONGO FUSARIUM OXYSPORUM.
Manríquez Núñez, J. (1); Martínez Cadena, M.G. (2); López Ramírez, L.A.(2).
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Investigación en Biología Experimental (IIBE)
Universidad de Guanajuato
RESUMEN
Se trabajo con el hongo Fusarium oxysporum como modelo de experimentación debido
a que el hongo presenta características similares de la respuesta a daño en DNA que las
encontradas en levaduras y humanos, se comenzó con la obtención de el micelio para la
posterior extracción del DNA genómico, después por medio de PCR se obtuvieron los
fragmentos de el gen PARP y de el fragmento de resistencia a higromicina de el hongo
los cuales se unieron posteriormente por PCR de doble unión para la obtención de el
gen interrumpido, la revisión de los resultados fue por medio de electroforesis
horizontal en geles de agarosa, la purificación de los fragmentos y de la fusión del gen
fue por medio de un KIT para la extracción en gel de agarosa de bajo punto de fusión, la
siguiente parte del proyecto consiste en la inserción de el gen interrumpido, selección de
mutantes y determinar el papel de el gen en la reparación del DNA.
INTRODUCCION
El género Fusarium abarca un gran número de especies de amplia distribución, las
cuales se han identificado a lo largo de dos siglos, no solo como importantes patógenos
en plantas, sino también como productores de toxinas, capases de causar la muerte en
animales e incluso en el hombre (Moss y Smith, 1984).
A pesar de ello, muchas especies tienen notable valor biotecnológico, utilizándose en el
control biológico de plagas, en la producción de metabolitos secundarios de importante
valor comercial (ciclosporina, giberelinas) y en la obtención de biomasa útil en la
elaboración de una amplia gama de alimentos.
La poli-ADP-ribosilación es el proceso que se da en respuesta a lesiones en el ADN,
dichas lesiones pueden ser producidas por agentes endógenos o exógenos tales como el
daño oxidativo. La enzima poli-ADP-ribosil polimerasa (PARP) puede influenciar y
regular los procesos de reparación del ADN. En caso de que la PARP se sobre active,
puede causar agotamiento de la coenzima NAD, indispensable en la actividad oxidoreductiva, pero también puede provocar acidificación y disminuir el nivel de ATP.
Se ha demostrado que la rápida acidificación que se da después de grandes daños en el
ADN puede suprimir la apoptosis lo cual permite la muerte necrótica (Martin O. David,
tomado de tesis doctoral, 2006).
La poli-ADP-ribosilación desempeña papeles diversos en muchos procesos moleculares
y celulares, incluyendo la detección y reparación de daños del ADN, modificación de la
cromatina, transcripción, muerte celular y función del aparato mitótico. Estos procesos
son de gran importancia para muchos resultados fisiológicos y patofisiológicos,
incluyendo mantenimiento del genoma, carcinogénesis, envejecimiento, inflamación y
la función neuronal.
Etapas de activación de la PARP
METODOS
El hongo Fusarium oxysporum fue incubado en medio YPG estéril con un protocolo
establecido para el crecimiento de el mismo, se recupero el micelio y se congelo, la lisis
del micelio fue agregando nitrógeno liquido y triturando con ayuda de un mortero
después se realizo la extracción del DNA genómico que serviría para la obtención de los
fragmentos, la obtención se realizo por medio de PCR estándar con oligos específicos
para cada fragmento, después de obtener los fragmentos se fusionaron por medio de
PCR de doble unión, los resultados de la obtención de los fragmentos así como de el
gen interrumpido se confirmaron por electroforesis horizontal en gel de agarosa.
RESULTADOS
Obtención del DNA genómico de Fusarium oxysporum
En la foto puede observarse una buena recuperación del DNA genómico del hongo.
Se cargaron 5 l de él purificado de DNA genómico para la electroforesis, los tres tubos
contenían cantidades similares del micelio pulverizado
PCR del fragmento 1
Se cargaron 3 l de la reacción de PCR para el fragmento 1 para correr la electroforesis,
los carriles corresponden a la cantidad de DNA genómico adicionado para la reacción 5,
0.5 y 0.2 l respectivamente, puede notarse una mejor amplificación en el carril 1.
PCR del fragmento 2
Se cargaron 3 l de la reacción de PCR para el fragmento 2 para correr la electroforesis,
los carriles corresponden a la cantidad de DNA genómico adicionado para la reacción 5,
0.5 y 0.2 l respectivamente, a diferencia de el PCR para el fragmento uno en los 3
carriles se tiene buena definición de la banda correspondiente al fragmento 2.
PCR para la obtención del fragmento Hph.
Se cargaron 5 l de la reacción de PCR para la obtención del fragmento de Hph, se
utilizo la misma cantidad de DNA para la obtención del fragmento de higromicina.
Fusión de los 3 fragmentos
Se utilizaron diferentes pares de oligos para la fusión de los fragmentos, un par para los
primeros 3 carriles y otro para los siguientes 3 lo que se puede observar es que con el
segundo par se obtienen mejores resultados, se puede notar que estos carriles son mas
limpios y tienen una mayor cantidad de el gen interrumpido.
CONCLUSION
En general creo que se realizo un buen trabajo ya que se lograron todos los objetivos, se
tuvieron algunas complicaciones con el equipo utilizado para los PCR’s, el método de
extracción para el fragmento fue modificado un poco debido a el tamaño del material
genético porque si se utilizaba el protocolo de extracción del fabricante del KIT lo más
probable sería que la fusión de los tres fragmentos sufriera daño, creo que el proyecto es
importante por el objetivo principal que es describir de una forma más exacta la
participación de el gen PARP en la respuesta al daño en DNA ya que el modelo en el
que se está experimentando es parecido a la respuesta que se genera en humanos y
pienso que en posteriores proyectos puede servir como buena referencia.
BIBLIOGRAFIA
Alexander Bürkle, Poly ADP-Ribosylattion, Chapter 1, 2004
D´ Amours D, Desnoyers S, D´Silva I, Poly ADP- ribosylation reactions in the regulation
of nuclear functions. Biochems J 1999
Martín O. David, Modulación por la Poli (ADP-Ribosa) Polimerasa-1 de la expresión
génica durante la carcinogénesis epidérmico; Tesis Doctoral 2006.
Moss, M. O. y Smith, J. E. (1984). The Applied Mycology of Fusarium.