Download 3.2. metodos - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Impronta genómica del gen Peg1 en el roedor tetraploide
Tympanoctomys barrerae (Rodentia,Octodontidae)
Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico.
Profesor Patrocinante: Dr. Milton Gallardo Narcisi – Instituto de Ecología y
Evolución.
Caroline Nicole Oriana Bacquet Pérez
Valdivia Chile 2003
Dedicatoria
A Catalina, por la magia que le da a mi vida cada día. A Jóse, por cinco años de camino, y
mil años de cariño. “En alas del amor volará el alma a casa, hacia su verdadero mundo”.
Platón.
Agradecimientos
A mi Papo, por enseñarme desde niña a amar la ciencia y la naturaleza, y por un
amor sin límites y sin tiempo, que siempre me ha hecho sentir especial. A Mamá, por
regalarme el amor por los libros y la sed de aprender, por enseñarme que nada es imposible
cuando se tiene voluntad. A mi pequeña Princesa Catalina, para cuando lo pueda leer, y
comprender, por ser mi amada Itaca, tan cercana y al mismo tiempo tan lejos, mi razón de
vivir y luchar, por estar en mis sueños desde siempre, por sus ojos de cielo, sus manos de
miel y su risa de pájaro. A mi amado Jóse, por ser el príncipe que llegó al principio y no al
final de la historia, y me salvó cada vez que los demonios asaltaron mi vida. Porque me
obligó a levantarme todas las veces que el cansancio me hacía caer, y querer morir y no
seguir luchando. Por devolverme todas y cada una de las esperanzas que perdía, y restañar
todas y cada una de mis heridas. A Milton Gallardo, mi “jefe” y profesor patrocinante de
tesis. Por ser más que eso, amigo, familia, cómplice, confesor, compañero de risas y llantos,
maestro y magnífico guía, y por la gran experiencia de vida que ha significado trabajar a su
lado. A Takuya Imamura y Andras Paldi, del Laboratorio de Patología, Epigenética y
Desarrollo del Instituto Jacques Monod, París, Francia, porque sin su apoyo intelectual,
material y emocional, esta tesis no hubiera sido posible. A Gudrun Kausel y Jaime
Figueroa, por su apoyo y amistad. A mis hermanos, Dudú, Emmanuel y Gori, a la Vale, que
es también como una hermana, a la Mamu, a muchos amigos especiales, a los compañeros
del lab, al gran Freddy, gracias por su cariño, ayuda y apoyo constante.
Esta investigación fue financiada por el proyecto FONDECYT 1010727 y ECOSCONICYT C01B02.
1. RESUMEN
La impronta génica es un fenómeno que se caracteriza por la expresión monoalélica
de un gen en forma dependiente del origen parental del alelo. Los genes que poseen
impronta están involucrados en procesos como crecimiento prenatal, formación de la
placenta, diferenciación de linajes celulares, y establecimiento de la conducta postnatal. En
ratones, el gen Peg1 (o Mest) es de copia única; está ubicado en el cromosoma 6 y posee
impronta genómica, expresándose desde el alelo paterno. Mediante análisis de las
secuencias nucleotídicas de Peg1 se indagó su expresión en Tympanoctomys barrerae, un
roedor con duplicación genómica total. Para ello, se extrajo RNA total de cuatro embriones
y se amplificó un fragmento del gen, que fue posteriormente clonado y secuenciado. Al
clonar esta región a partir de amplificación de DNA genómico, usando dos de los
embriones y su madre, se pudo caracterizar hasta tres alelos por individuo. Sólo uno de
estos alelos se expresa en los embriones, lo que demuestra impronta genómica en T.
barrerae. Además, se caracterizaron cuatro loci para retropseudogenes en esta especie. Dos
de ellos se expresan en los embriones, a pesar de poseer corrimiento en el marco de lectura
y codones de término que imposibilitan a estos transcritos para codificar una proteína
funcional. Al estudiar la estructura del fragmento genómico obtenido se encontró también
un sitio de splicing alternativo, que da origen a una secuencia no funcional de cDNA.
SUMMARY
Genomic imprinting is the monoallelic expression of genes in a parent-dependent
manner. Imprinted genes are implicated in fetal growth, function of the placenta,
development of particular cell lineages and postnatal behavior. In mice, Peg1 (also called
Mest) is an imprinted, single copy gene, located on chromosome 6, and it is expressed from
the paternal allele. Using nucleotide sequence analysis Peg1 gene expression was studied in
the rodent Tympanoctomys barrerae, a mammal with whole genome duplication. We
purified total RNA from four embryos, and performed RT-PCR in order to amplify a Peg1
fragment, which was cloned and sequenced. When the same fragment was cloned from
genomic DNA amplification of two embryos and their mother, three different alleles were
characterized. Expression was confirmed for only one of them, indicating genomic
imprinting for Peg1. Four retropseudogenes loci were also characterized in this species, two
of which are expressed in the embryos, despite they presented frameshifts and stop codons,
which make impossible for those transcripts to produce a functional protein. Finally, by
analyzing the structure of this genomic region, an alternative splicing site was found, which
gave origin to one of the non functional cDNA sequences.
2. INTRODUCCION
El DNA genómico es el templado final de la herencia, y como tal, ha sido
exhaustivamente investigado en el curso de las últimas décadas. Sin embargo, aún queda
mucho por comprender acerca de la regulación y transducción de la información genética
en los seres vivos (Jenuwein y Allis, 2001). Las células de un organismo multicelular son
genéticamente homogéneas, pero estructural y funcionalmente heterogéneas, debido a la
expresión diferencial de genes. Muchas de esas diferencias en la expresión génica ocurren
durante el desarrollo y son retenidas subsecuentemente a través de la mitosis (Jaenisch y
Bird, 2003). Alteraciones estables de este tipo se dice que son “epigenéticas”, porque son
heredables en el corto plazo, pero no involucran cambios de secuencias nucleotídicas en el
DNA (Matzke et al. 1999). En los últimos años, se ha demostrado que la actividad génica
es influenciada por las proteínas de empaquetamiento del DNA, por enzimas que modifican
tanto esas proteínas como el DNA, e incluso por RNAs. (Jenuwein y Allis, 2001; Matzke et
al, 2001; Jones y Takai, 2001). Los patrones de control epigenético son heredados a las
siguientes generaciones, lo que lleva a pensar que la unidad de herencia ahora se extiende
más allá de la secuencia de DNA, e incluye las modificaciones epigenéticas de dichas
secuencias (Martienssen y Colot, 2001; Wu y Morris, 2001). Las modificaciones
epigenéticas permiten que las células respondan a señales ambientales, hormonas, factores
de crecimiento, y otras moléculas regulatorias, sin alterar el DNA en sí mismo y aseguran
la apropiada activación génica durante el desarrollo (Pennisi, 2001). Estos cambios
involucran (i) metilación del DNA, (ii) modificaciones covalentes de las histonas
(acetilación, metilación, fosforilación), y (iii) remodelación de otras proteínas asociadas a la
cromatina (Rideout et al. 2001).
En la mayoría de los loci autosómicos en mamíferos, ambas copias del gen se
expresan por igual. Para otros genes, sin embargo, una copia está silenciada en al menos
algunos tejidos durante el desarrollo (Spencer, 2000). Como resultado se obtiene la
expresión preferencial de uno de los alelos, dependiendo de su origen parental (Bartolomei
y Tilghman, 1997; Li et al., 2002). Aunque los mecanismos que sustentan el proceso de
impronta no han sido completamente dilucidados, éste involucra tanto regiones
diferencialmente metiladas (DMR) como transcritos antisentido (Li et al., 2002).
En mamíferos, los genes con impronta están involucrados en el desarrollo
embrionario, formación de la placenta, diferenciación de ciertos linajes celulares,
funcionamiento del sistema nervioso y establecimiento de la conducta postnatal (Reik et al.,
2002; Ferguson-Smith y Surani, 2001). Basado en el origen parental del alelo transcrito,
algunos son expresados desde el alelo materno, y otros desde el alelo paterno (PEG) (Li et
al., 2002). Se conocen más de 70 genes con impronta genómica, de los cuales el 50% se
expresa desde el alelo paterno, y la otra mitad lo hace desde el alelo materno (Reik y
Walter, 2001). La impronta se inicia durante la gametogénesis y es trasmitida a los
embriones (Ferguson-Smith y Surani, 2001). Los genes con impronta comparten ciertas
características, que podrían ayudar a comprender su origen y función (Bartolomei y
Tilghman, 1997). Por ejemplo, estos genes tienden a agruparse en conglomerados de
regiones cromosómicas discretas. Además, los homólogos materno y paterno presentan
asincronía replicacional, durante la fase S del ciclo celular (Paldi, 2003). Estos genes
tienden a estar formados por unidades transcripcionales compactas, con intrones más
pequeños, y están asociados con patrones de metilación específicos según la forma de
expresión del alelo (Lefebvre et al., 1997). La evidencia sugiere que las secuencias que
poseen esos patrones diferenciales de metilación son importantes en la señalización inicial
y subsecuente expresión de los genes con impronta (Bartolomei y Tilghman, 1997).
El descubrimiento de tetraploidía en mamíferos ha derribado las ideas previas
acerca de las limitaciones impuestas por el sistema genético de los mamíferos (Gallardo et
al., 1999). De este modo, la duplicación genómica de T. barrerae emerge como un
interesante modelo para estudiar la regulación génica. Los organismos poliploides
contienen un número de cromosomas que es algún múltiplo de x (número cromosómico
básico), mayor que 2x, que es el contenido de cromosomas de las especies diploides
relacionadas (Pikaard, 2001). Con el descubrimiento de la condición tetraploide de este
roedor surge un gran interés por el estudio del control transcripcional y las modificaciones
epigenéticas que puede haber experimentado el genoma de esta especie ante un cambio de
tal magnitud. Para esta investigación se eligió el gen Peg1, que ha sido intensamente
estudiado en humano y ratón. Peg1 (o Mest, un transcrito específico de mesodermo) es un
gen de copia única que pertenece a la familia de las α/β hidrolasas. Se encuentra localizado
en el extremo proximal del cromosoma 6 de ratón, y en el cromosoma 7q32 en humano.
Peg1 consiste de 12 exones, con un tamaño exónico promedio de 212 pb para el cDNA de
2543 nt. Este dominio está sujeto a impronta genómica, produciéndose letalidad
embrionaria en casos de disomía uniparental materna del extremo proximal del cromosoma
6 (Lefebvre et al., 1997). En ratón, Peg1 se expresa exclusivamente desde el alelo paterno,
mientras en humanos este gen es transcrito desde dos promotores adyacentes. Sólo uno de
estos promotores posee impronta, expresándose exclusivamente desde el alelo paterno,
mientras el otro promotor se encuentra activo en ambos alelos. También se ha descrito
recientemente en humanos la expresión de un transcrito antisentido de PEG1 (Li et al.,
2002). En ratón, se ha identificado una región “CpG island” que cubre el exon 1 de Peg1,
demostrándose que esta región está diferencialmente metilada (Lefevre et al., 1997).
La presente investigación tuvo como objetivo conocer si un mamífero tetraploide
poseerá el mismo tipo de impronta génica que la encontrada en humano y ratón. Una vez
respondida esa pregunta, el segundo objetivo fue saber si T. barrerae expresa uno o dos
alelos de Peg1. Teóricamente los individuos heredarán dos alelos de cada progenitor, y la
expresión podría ser monoalélica (como en las especies diploides), o bialélica. Este hecho
posee relevancia, ya que se desea saber si en T. barrerae se produce “diploidización
funcional”, descrita previamente en otras especies poliploides. La “diploidización
funcional” es el resultado de una amplia gama de eventos genéticos y epigenéticos (i.e.,
eliminación de secuencias de DNA, silenciamiento génico, rearreglos cromosómicos) que
son inducidos por cambios en el estado de ploidía, y que derivan en una emulación del
modo de funcionamiento de los organismos diploides (Eckardt, 2001; Wendel, 2000;
Comai, 2000; Pikaard, 2001; Matzke et al., 1999; Scheid et al., 1996). El “silenciamiento
génico” debe ser visto como el reflejo de una variedad de fenómenos diferentes, incluyendo
el proceso clásico de deterioro lento que lleva a formación de pseudogenes, delección
genómica de estucturas completas y posiblemente de genes individuales, y modificación
epigenética (Wendel, 2000). El más frecuente de estos procesos en poliploides es la
colonización por pseudogenes (Soltis y Soltis, 1999). Un pseudogen es una secuencia que
está presente en el genoma de una determinada población, y se caracteriza por su similitud
con uno o más genes parálogos, aunque no produce una proteína funcional (Vanin, 1985).
Los pseudogenes son consecuencia de una duplicación génica que puede ocurrir de dos
formas distintas: por retrotransposición, o por duplicación del DNA genómico. Los
pseudogenes originados por retrotransposición son llamados pseudogenes procesados, o
retro-pseudogenes. Se caracterizan por la ausencia de promotor 5’ e intrones, presencia de
una poliadenilación 3’ y de repeticiones directas flanqueando la secuencia (Mighell et al.,
2000). Por otra parte, los pseudogenes generados por duplicación del DNA genómico se
originan a partir de genes que pierden su funcionalidad porque su duplicación fue
incompleta, o porque su redundancia no otorga ventajas adaptativas, lo que permite que
acumulen mutaciones deletéreas (Wendel, 2000; Mighell et al., 2000). Las regiones
pseudogénicas están habitualmente menos constreñidas, y han acumulado más mutaciones
que los genes que son traducidos a proteínas (Hirotsune et al., 2003).
La hipótesis que se plantea es que el gen en estudio presenta impronta en T.
barrerae. Esta hipótesis se fundamenta en la alta conservación de la impronta en
mamíferos, a pesar de las desventajas que conlleva la haploidía funcional que ésta implica
(Murphy y Jirtle, 2003). Además, se propone que la impronta en esta especie es afectada
por la “diploidización funcional” característica de los poliploides, lo que llevaría a la
expresión preferencial de sólo uno de los dos alelos heredados del progenitor para Peg1.
Respecto al tipo de impronta, la hipótesis nula predice la expresión de Peg1 desde el alelo
paterno.
Mediante la presente tesis se propuso estudiar la expresión del gen Peg1 en T.
barrerae, por caracterización de las secuencias de cDNA para este gen en progenitores y
descendientes directos. Si T. barrerae posee impronta para el gen Peg1, cada embrión
expresará sólo uno de los cuatro alelos que teóricamente posee, por lo que se espera
detectar sólo una secuencia funcional de cDNA. Para hacer la tipificación alélica, e indagar
en el tipo de impronta del gen, se realizará comparación de las secuencias del cDNA con
las secuencias genómicas de la madre y sus descendientes. Si las secuencias de cDNA
corresponden a un alelo que la madre no posee, se asumirá expresión paterna del gen, tal
como ocurre en organismos diploides.
Así, los pasos a seguir fueron:
- Diseñar partidores que amplifiquen un fragmento del cDNA de Peg1.
- Amplificar dicho fragmento mediante RT-PCR oligo-específico en RNA de cuatro
embriones, seguido de clonamiento y secuenciación del mismo.
- Caracterizar de el(los) alelo(s) de Peg1 expresado(s) en los embriones, mediante
análisis de las secuencias de cDNA.
- Amplificar de la misma región mediante PCR en DNA genómico de dos de los
embriones y su madre, y posteriormente clonar y secuenciar este fragmento.
- Caracterizar las secuencias génicas de Peg1 presentes en los especímenes
estudiados.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Material biológico
Células E. Coli “DH-5α Subcloning efficiency“ (Invitrogen). Los especímenes de T.
barrerae fueron colectados en su hábitat natural (Gallardo and Kirsch, 2001), y se
encuentran registrados en la colección de mamíferos del Instituto de Ecología y Evolución
de la Universidad Austral de Chile. Se utilizó dos hembras, con números de identificación
1708 y 1710, y cuatro embriones, dos de cada una de ellas, que se denominaron 1708
embrión 1, 1708 embrión 2, 1710 embrión 1 y 1710 embrión 2.
3.1.2. Enzimas
Invitrogen:
Taq DNA Polimerasa, EcoRI.
Promega:
RQ1 RNasa libre de DNasa.
3.1.3. Reactivos y otros
Genset SA:
Oligonucleótidos partidores (PCR y RT-PCR).
GibcoBRL:
DNA /HindIII, 1kb DNA ladder.
Invitrogen:
Topo Cloning Kit, Tris base, agarosa.
Merck:
Etanol absoluto, ácido clorhídrico 37%, isopropanol, cloroformo, ácido
acético glacial.
Promega:
100bp DNA ladder, Acces RT-PCR system, Blue/Orange loading dye 6x.
Qiagen:
QIAquick Gel Extraccion Kit, QiaPrep Miniprep Kit.
Sigma:
EDTA, SDS, formamida.
Winkler
Alcohol isoamílico, acetato de amonio, cloruro de sodio, fenol.
3.2. METODOS
3.2.1. Preparación de DNA genómico de T. barrerae
El DNA genómico de T. barrerae se aisló según un método estándar con algunas
modificaciones (Sambrook et al., 1989). Se pulverizó aproximadamente 0.5 g de tejido
hepático fresco en nitrógeno líquido, dejando luego evaporar el nitrógeno y agregando el
tejido pulverizado a un tubo Falcon conteniendo 10 volúmenes de tampón de extracción
(Tris/HCl 10 mM [pH 8.0], EDTA 0.1 M [pH 8.0], SDS 0.5%, RNasa pancreática 20
μg/ml). Se incubó por 1 hora a 37°C con agitación ocasional y luego se agregó proteinasa K
a concentración final de 100 μg/ml, incubando en baño a 50°C toda la noche. Se dejó que la
suspensión llegara a temperatura ambiente y se agregó un volumen de fenol equilibrado con
0.5 M Tris/HCl [pH 8.0], mezclando suavemente las dos fases por inversión, y luego las
fases se separaron por centrifugación a 5.000 rpm durante 15 minutos a temperatura
ambiente. La fase acuosa obtenida se transfirió a un tubo limpio con una pipeta de punta
ancha, y se repitió una vez más la extracción con fenol. A la fase acuosa obtenida de esta
segunda extracción se le agregó un volumen equivalente de fenol/cloroformo/AIA
(25/24/1), separando las fases por centrifugación a 5.000 rpm por 15 minutos a temperatura
ambiente. Se transfirió esta última fase acuosa a un tubo Falcon limpio, agregando 0.2
volúmenes de acetato de amonio 10 M y dos volúmenes de etanol 100% a –20°C. El ovillo
de ácido nucleico se removió con una pipeta Pasteur en forma de ganchillo y se lavó con
etanol 70% a –20°C, luego se dejó secar al aire. Posteriormente, el DNA proveniente de
tejido hepático de T. barrerae se resuspendió en 500 ul de tampón TE pH 8.0 (Tris/HCl 10
mM [pH 8.0], EDTA 1 mM [pH 8.0]) y se dejó disolviendo a 37°C durante toda la noche.
Para fines de almacenamiento se dejó a 4°C.
3.2.2. Cuantificación del DNA
La concentración del DNA se estimó midiendo su absorbancia a 260 nm, en un
espectrofotómetro UV-1203 Shimadzu. La pureza de los DNA se evaluó a través de la
razón A260/A280, que para un DNA puro fluctúa entre 1.7 y 1.85. Para calcular la
concentración se consideró que una unidad de absorbancia a 260 nm (1 OD) corresponde a
50μg/ml de DNA de doble hebra (Sambrook et al., 1989).
La concentración de DNA de algunas muestras diluídas se determinó directamente
en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, por comparación con un estándar de
concentración conocida, luego de finalizada la corrida electroforética y visualizado a la luz
UV.
3.2.3. Amplificación de secuencias nucleotídicas por PCR
En un tubo de polipropileno estéril de 0.2 μl se agregó 1 μl de solución de DNA
templado de T. barrerae 100 μg/ml (aproximadamente 100 ng de DNA genómico por
tubo), 2 μl de solución 2 μM de cada partidor específico para la amplificación (Set 1,
Sentido:
5’-CTGAAGAGTGAGCTGTGGGACATG-3’;
CAAGAAGCCCATGGGATCCTCTA-3’),
AATGATGGGRACTTGGTCATAGAC-3’;
(Set
Antisentido:
2,
Sentido:
Antisentido:
5’5’5’-
ACTGGGAACAGTGACAGAGGCAAGCGC-3’), 2 μl de tampón 10x (provisto con la
Taq polimerasa), 1.2 μl de MgCl2 25 mM, 0.4 ul de solución de dNTP 40 mM (10 mM cada
dNTP), 11.2 μl de agua destilada desionizada estéril y 0.2 μl de Taq polimerasa 5U/ μl,
hasta completar un volumen total de 20 μl. Como control negativo en un tubo que contenía
todos los componentes de la reacción de amplificación, exceptuando el DNA templado,
para descartar cualquier tipo de contaminación en el proceso. Los tubos se colocaron en un
termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, y el protocolo de amplificación seguido
consistió en un paso de denaturación inicial a 95°C por 5 minutos, luego treinta y cinco
ciclos consistentes en: un paso de denaturación a 94°C por 30 segundos, un paso de
apareamiento de los oligonucleótidos con el templado a 60°C por 1 minuto y un paso de
extensión a 72°C por 1 minuto. Al terminar los treinta ciclos se realizó un paso de
extensión final a 72°C por 10 minutos. La efectividad del proceso se estimó por
electroforesis en gel de agarosa al 1.5% con tinción de bromuro de etidio, utilizándose 5 μl
de producto de PCR por carril. Los tubos se almacenaron a –20°C.
3.2.4. Extracción de RNA total de T. barrerae
El RNA total de T. barrerae se aisló mediante TRIzol (Invitrogen), que consiste en
una solución monofásica de fenol y tiocianato de guanidina. Su funcionamiento se basa en
una modificación del método de aislamiento de RNA en una etapa desarrollado por
Chomczynski y Sacchi (1987). Se tomó entre 105 – 106 células provenientes de una placa
de cultivo primario de tejido embrionario de T. barrerae y se resuspendieron en 500 μl de
TRIzol, poniendo la suspensión en un tubo Eppendorf nuevo y estéril de 1.5 ml. Se dejó
reposar 5 minutos y en seguida se agregó 100 μl de cloroformo, mezclando
cuidadosamente, para luego dejar reposar durante tres minutos más. El tubo se centrifugó
entonces a 13.000 rpm por 15 minutos a 4°C y se recuperó la fase acuosa en un nuevo tubo,
agregándole 0.25 ml de isopropanol. Posteriormente, se centrifugó a 13.000 rpm por 10
minutos a 4°C. El precipitado de RNA obtenido fue lavado con etanol 75% y secado
brevemente al aire. Luego se disolvió en 20 μl de agua libre de nucleasas. Los tubos se
almacenaron a –20°C.
3.2.5. Análisis de RT-PCR
3.2.5.1. Tratamiento del RNA con DNasa
Para eliminar el DNA genómico contaminante en las muestras de RNA, se utilizó
DNasa I libre de RNasa mediante el kit comercial “RQ1 RNase-Free DNase Protocol“
(Promega). En un tubo Eppendorf nuevo y estéril se agregó 1 μl de RNA (Ver 3.2.4), 1 μl
de tampón de reacción 10x RQ1, 2 μl de DNasa libre de RNasa RQ1 (1U/μl) y 6 μl de agua
libre de nucleasas, hasta completar un volumen total de 10 μl. El tubo se incubó a 37°C por
1.5 horas y en seguida se agregó 1 μl de solución “RQ1 DNase Stop Solution” para detener
la reacción. Se incubó a 65°C por 10 minutos para inactivar la DNasa.
3.2.5.2. Amplificación por RT-PCR
La amplificación por RT-PCR se realizó mediante el kit comercial “Acces RT-PCR
system“ (Promega). En un tubo nuevo, estéril, de 0.2 ml se agregó 27.5 μl de agua libre de
nucleasas, 10 μl de tampón de reacción 5x de las enzimas transcriptasa reversa AMV y
DNA polimerasa Tfl, provisto con el kit, 1 μl de solución de dNTPs 40 mM (10 mM cada
dNTP), 2.5 μl de solución 2 μM de cada partidor específico para la amplificación (Sentido:
5’-CTGAAGAGTGAGCTGTGGGACATG-3’;
Antisentido:
5’-
CAAGAAGCCCATGGGATCCTCTA-3’), 1 μl de transcriptasa reversa AMV (5U/ μl) y
finalmente, 2.5 μl de preparación de RNA tratado con DNasa, hasta completar un volumen
final de 49 μl. Como control negativo se utilizó un tubo conteniendo todos los componentes
de la reacción con excepción de la transcriptasa reversa AMV. Los tubos se incubaron en
un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient a 48ºC por 45 minutos y luego se
incubó a 95ºC por 5 minutos (inactivación de la transcriptasa reversa y denaturación de los
híbridos RNA/cDNA/partidores). En seguida se agregó 1 μl de DNA polimerasa Tfl (5U/
μl) y se procedió con un protocolo de amplificación de treinta y cinco ciclos consistentes
en: un paso de denaturación a 94°C por 40 segundos, un paso de apareamiento de los
oligonucleótidos con el templado a 56.6°C por 1 minuto y un paso de extensión a 72°C por
1 minuto. Al terminar, se realizó un paso de extensión final a 72°C por 10 minutos. Los
resultados fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% con tinción de
bromuro de etidio, utilizándose 5 μl de producto de RT-PCR por carril. Los tubos fueron
guardados a –20°C.
3.2.6. Fraccionamiento de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Los productos de amplificación por PCR, las preparaciones, purificaciones y
digestiones de DNA se analizaron por electroforesis en geles de agarosa, cuya
concentración fluctuó entre 0.8 y 1.5%, dependiendo del tamaño de las moléculas por
visualizar. Como tampón de corrida se utilizó TAE 0.5x (Tris-acetato 20 mM [pH 8.0],
EDTA 1 mM y acetato de sodio 10 mM). Las muestras de DNA se aplicaron al gel
mezcladas con tampón de carga “Blue/Orange loading dye 6x” (Promega). Para estimar el
tamaño de los fragmentos de DNA visualizados en el gel, las muestras se fraccionaron
junto con un estándar de tamaño molecular de concentración conocida. La electroforesis se
llevó a cabo entre 50 – 100 mA y el gel se tiñó con bromuro de etidio a una concentración
final de 0.5 μg/ml. Las bandas de DNA se visualizaron en un transiluminador UV y se
fotografiaron con la cámara digital DC290 Kodak, utilizando filtro naranja.
3.2.7. Clonamiento de productos de amplificación en el vector pCR4-Topo
3.2.7.1. Purificación de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa
Para la purificación de la banda de DNA que correspondía al fragmento del gen
Peg1 amplificado mediante PCR y RT-PCR, se utilizó el kit comercial “QIAquick Gel
Extraccion Kit (Qiagen)”. Este método permite purificar fragmentos de DNA de tamaños
comprendidos entre 70 pb y 10 kb con una recuperación de DNA entre 70% y 80%. A
partir de geles de agarosa preparativos, la banda de interés se cortó con un bisturí estéril. El
trocito se colocó en un tubo Eppendorf y se agregó 3 volúmenes de solución “Buffer QG”,
incubando luego a 50ºC por 10 minutos. Posteriormente se agregó un volumen de
isopropanol, mezclando suavemente. El contenido del tubo se aplicó a una minicolumna
ubicada en un tubo de polipropileno. Esta se centrifugó a 13.000 rpm por 1 minuto a
temperatura ambiente, eliminando el líquido colectado en el tubo. Se agregó a la
minicolumna 0.75 ml de solución “Wash solution”, centrifugando nuevamente a 13.000
rpm por 1 minuto a temperatura ambiente, descartando luego la solución de lavado
colectada en el tubo y repitiendo la centrifugación. Posteriormente, la columna se colocó en
un tubo Eppendorf de 1.5 ml y para eluír el DNA se le aplicó justo en el centro 30 μl de
tampón TE pH 8.0 (Tris/HCl 10 mM [pH 8.0], EDTA 1 mM [pH 8.0]), se dejó reposar por
1 minuto y se centrifugó a 13.000 rpm por un minuto. Los resultados fueron analizados
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, con tinción de bromuro de etidio.
3.2.7.2. Ligación de fragmentos de DNA al vector linearizado y transformación de
células competentes
Los fragmentos de DNA de Peg1 amplificados por PCR y RT-PCR fueron clonados
mediante el kit ”Topo TA Cloning Kit” (Invitrogen) en el vector pCR4-Topo. Este vector
consta de 3579 pb, está linearizado y tiene integrado en los extremos un sistema de ligación
basado en la actividad de la DNA topoisomerasa I. Se mezcló en un tubo Eppendorf de 1.5
ml 2 μl de DNA purificado, 0.5 μl de “SALT solution” y 0.5 μl de vector. Se incubó 30
minutos a temperatura ambiente y se le agregó 50-100 μl de células E.coli DH5
“Subcloning efficiency competent cells” (Invitrogen), incubando por 30 minutos en hielo.
Luego se realizó golpe térmico a 37ºC por 2 minutos, para inducir la incorporación del
plásmido por las células competentes. Se agregó 250 μl de medio SOC (triptona 2%,
extracto de levadura 0.5%, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, Mg2+ 20 mM, glucosa 20 mM)
provisto por el kit comercial y se incubó a 37ºC durante una hora para favorecer el
crecimiento de los recombinantes. Posteriormente, se centrifugó la suspensión bacteriana a
7.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento fue sembrado en medio
sólido LBamp (100 mg/ml ampicilina) e incubado toda la noche en estufa a 37ºC.
3.2.8. Aislamiento de DNA plasmidial a pequeña escala
La extracción de DNA plasmidial se realizó por medio del kit comercial “QiaPrep
Miniprep Kit” (Qiagen), basado en el método de lisis alcalina y elusión del DNA plasmidial
en minicolumnas. Se tomó una colonia simple y se suspendió en 5-6 ml de medio líquido
LBamp (50 mg/ml ampicilina), incubando toda la noche a 37ºC con agitación. Se
centrifugó 3 ml del cultivo a 7000 rpm por 3 minutos a temperatura ambiente, y el
sedimento obtenido fue resuspendido en 250 μl de solución “Buffer P1” . Luego se agregó
250 μl de solución “P2” (tampón de lisis), invirtiendo suavemente el tubo 2-3 veces e
incubando a temperatura ambiente por 5 minutos. Posteriormente se agregó 350 μl de
solución “N3”, invirtiendo el tubo inmediata pero suavemente 2-3 veces. El tubo se
centrifugó después a 13.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a un
minicolumna ubicada en un tubo de polipropileno. Esta se centrifugó a su vez a 13.000 rpm
por un minuto, descartando el líquido colectado en el tubo. En seguida se agregó 750 μl de
solución “PE” (solución de lavado) a la minicolumna, centrifugando nuevamente a 13.000
rpm por un minuto a temperatura ambiente y descartando la solución de lavado colectada
en el tubo. Luego se repitió la centrifugación. En seguida, se colocó la minicolumna en un
tubo Eppendorf de 1.5 ml y para eluír el DNA se agregó 50 μl de tampón TE pH 8.0
(Tris/HCl 10 mM [pH 8.0], EDTA 1 mM [pH 8.0]) en el centro de la columna, dejando
reposar por un minuto y luego centrifugando a 13.000 rpm por 1 minuto a temperatura
ambiente. Para liberar el inserto del DNA plasmidial se realizó digestión enzimática con
EcoRI, según se describe en el punto 3.2.9, ya que el vector pCR4-Topo posee dos sitios de
restricción para EcoRI en el sitio de clonamiento múltiple.
3.2.9. Digestión con endonucleasas de restricción
En un tubo Eppendorf se colocó entre 1-6 μg de DNA plasmidial (2 μl del DNA
obtenido de la purificación de DNA plasmidial, cuya concentración osciló entre 500 ng/μl –
3 μg/μl), 0.5 μl de EcoRI 10U/μl, 1 μl de tampón 10x (provisto con la enzima) y 6.5 μl de
agua destilada, desionizada y estéril, hasta completar un volumen total de reacción de 10 μl.
El tubo se incubó a 37ºC por 2 horas, y los resultados de la digestión enzimática se
chequearon mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, con tinción de bromuro de
etidio.
3.2.10. Secuenciación de fragmentos de DNA
Para la secuenciación de los fragmentos de DNA y cDNA clonados en el vector
pCR4-Topo se utilizó el sistema ABI con secuenciador capilar, basado en el método de
extensión de partidor descrito por Sanger, (1979). Se utilizó cuatro didesoxinucleótidos
(ddNTPs) distintamente marcados por fluorescencia, junto con partidores T3 para generar
la polimerización de los ddNTPs, que fue diferencialmente terminada con el ddNTP
marcado y luego analizada por electroforesis capilar.
4. RESULTADOS
4.1. Amplificación de un fragmento de cDNA de Peg1 en T.
barrerae mediante RT-PCR
Los partidores utilizados en la amplificación de RT-PCR corresponden al set 1 de
partidores, cuyo diseño se detalla en el acápite 4.5. Los productos de amplificación
obtenidos se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, lo que permitió
estimar la cantidad aproximada de producto obtenido, la especificidad de la reacción de
RT-PCR y la ausencia de contaminación por DNA en la muestra de RNA total utilizada
como templado, purificado a partir de células embrionarias en cultivo. La figura 1 muestra
una corrida electroforética en agarosa al 1.5%, de un producto de RT-PCR del fragmento
Peg1 anteriormente mencionado. Se aprecia claramente la señal correspondiente al
fragmento esperado a la altura de los 300 pb, junto a la ausencia de cualquier tipo de
amplificación inespecífica. El control negativo consistió en una reacción con todos los
componentes del RT-PCR, menos la transcriptasa reversa. La total ausencia de señal en este
carril permite descartar la presencia de DNA genómico contaminante en el RNA total
usado como templado.
Los productos de amplificación por RT-PCR fueron purificados a partir del gel y
clonados en el vector pCR4-Topo, como se describe en el acápite 3.2.7, para su posterior
secuenciación.
FIGURA 1. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa al 1.5 % de un producto de
amplificación del fragmento Peg1 por RT-PCR. Carril 1:100 bp DNA ladder (Promega) (5
μl); carril 2: producto de amplificación de Peg1 por RT-PCR oligoespecífico en RNA total
de 1708 embrión 1 (15 μl); carril 3: control negativo RT-PCR, consistente en un tubo de
reacción sin transcriptasa reversa ( 15 μl). La flecha indica la banda correspondiente al
fragmento de amplificación esperado, de un tamaño molecular de 300 pb.
4.2. Extracción y purificación de DNA plasmidial
El DNA plasmidial de los recombinantes de Peg1 se analizó por electroforesis de
geles de agarosa al 1.5%, lo que permitió estimar su concentración aproximada, y el grado
de pureza alcanzado. En la figura 2 se muestra el resultado de la purificación después que
una alícuota del DNA se digirió con EcoRI, que libera el inserto. Se utilizó una alícuota del
DNA así purificado (aproximadamente 1 μg) para ser secuenciado por el método de
extensión de partidor descrito por Sanger, (1979).
4.3. Análisis de las secuencias de cDNA
4.3.1. Alineamiento de secuencias nucleotídicas
Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron alineadas mediante el programa
ClustalX (Thompson et al., 1997). Se encontraron cuatro distintos patrones de cDNA, que
fueron identificados con los números 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Las secuencias de los
diferentes individuos se subdenominaron con las letras a, b, c y d. Una de estas secuencias,
que llamaremos estándar fue compartida por los cuatro embriones, y corresponde a las
secuencias 2.a, 2.b, 2.c y 2.d. La secuencia 1 se encontró en dos embriones provenientes de
madres distintas, y se diferencia de la secuencia estándar por una delección de 10 pb. Las
secuencias 3 y 4 se diferencian de la secuencia estándar en 5 y 10 pb, respectivamente.
Diferencias de esta magnitud no son esperables en una región codificante, considerando
que la diferencia entre la secuencia estándar y el transcrito Peg1 de Mus musculus es de 2
pb (número de acceso GenBank BAC02716.1, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). En la figura
3 se observa el resultado del alineamiento, donde se puede apreciar en color rojo las
diferencias encontradas. Considerando el gran número de diferencias, las secuencias
nucleotídicas obtenidas por amplificación de RT-PCR fueron traducidas a la secuencia
aminoacídica correspondiente para evaluar su funcionalidad (Ver acápite 4.3.2).
FIGURA 2. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa al 1.5% de DNA
recombinante de Peg1 digerido con EcoRI. Carril 1: 100 bp DNA ladder (Promega) (5 µl);
carril 2, 3, 4, 5 y 6: DNA plasmidial conteniendo el inserto Peg1 digerido con EcoRI (1.5
µg). La flecha indica la banda correspondiente al fragmento Peg1 de 300 pb.
4.3.2. Alineamiento de secuencias aminoacídicas derivadas de cDNA
Las secuencias aminoacídicas se obtuvieron mediante el programa Transeq
(http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/). De esta forma, se pudo obtener tres posibles
marcos de lectura para esta secuencia de 300 pb. Para saber cuál de ellos correspondía a la
proteína codificada por el gen Peg1 se compararon las secuencias aminoacídicas obtenidas
con las de M. musculus, disponibles en el banco de datos del National Center for
Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El número de acceso de la
secuencia utilizada es BAC02716.1. Para el alineamiento de las secuencias se utilizó el
programa ClustalX (Thompson et al., 1997). En la figura 4 se muestran los resultados del
alineamiento. La secuencia 2 mostró un 98% de homología con la proteína de M. musculus
(no mostrado). Por su parte, las secuencias 1, 3 y 4 presentaron cambios en el marco de
lectura y codones de término que interrumpen la secuencia aminoacídica. Debido a esto, se
diseñó una estrategia especial para la amplificación de secuencias genómicas, que permitió
discriminar loci pseudogénicos del locus real de Peg1 (Ver acápite 4.5).
FIGURA 3. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de cDNA Peg1. Las letras en
rojo indican cambios nucleotídicos, los guiones en rojo indican delecciones. Entre
paréntesis al lado derecho se indica el número de clones en los que se encontró cada
secuencia. Los números (1, 2, 3, 4) identifican cada uno de los patrones nuceotídicos
encontrados, mientras que las letras (a, b, c, d) indican distintos individuos en los que se
encontró la secuencia. El número de registro de cada individuo se entrega entre paréntesis
al lado del número de secuencia correspondiente.
FIGURA 4. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas derivadas de cDNA Peg1.
Las flechas indican cambios en el marco de lectura. Los círculos indican codones de
término que interrumpen la secuencia. En azul, la única secuencia funcional encontrada es
compartida por los cuatro embriones en estudio. Entre paréntesis se indica el número de
clones en los que se encontró cada secuencia. Las secuencias más cortas se deben a
delecciones en el cDNA.
4.4.1. Preparación de DNA genómico de T. barrerae
Las preparaciones de DNA genómico se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa al 0.8%. Ello permitió estimar su concentración aproximada y el grado de
purificación alcanzado. La figura 5 muestra un fraccionamiento electroforético en agarosa
al 0.8%, de una muestra de DNA genómico sin digerir. Se aprecia claramente la ausencia
de contaminación por RNA en la muestra purificada y el alto peso molecular del DNA
genómico obtenido. El rendimiento alcanzado por este método fue de alrededor de 1 mg de
DNA genómico a partir de, en promedio, 0.5 g de tejido hepático fresco.
FIGURA 5. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa al 0.8% de una muestra
de DNA genómico sin digerir de T. barrerae. Carril 1: DNA fago  digerido con Hind III
(250 ng); carril 2 y 3: DNA genómico sin digerir de T. barrerae 1708 (1 µg). La flecha
indica la banda correspondiente al DNA genómico no digerido, de alto peso molecular.
4.5. Amplificación de un fragmento génico de Peg1 en T.
barrerae mediante PCR
A fin de distinguir los posibles loci pseudogénicos del locus funcional de Peg1, se
utilizaron dos sets de partidores, diseñados mediante comparación con las secuencias de
Peg1 de humano y ratón (números de acceso NT_007933.12 y NT_025741.12). En la
figura 6 se muestra una representación esquemática de las regiones amplificadas por ambos
sets de partidores en DNA genómico y cDNA. El set 1 consistió en un partidor sentido
localizado en el exón 9 del gen, y un partidor antisentido localizado en el exón 12. De esta
forma, sólo los pseudogenes fueron amplificados, ya que estos partidores abarcan una
extensa región en el gen funcional. Por el contrario, el fragmento que abarcan los partidores
en cDNA es de aproximadamente 300 pb. El set 2 consistió de un partidor sentido,
localizado en el extremo 5’ del exón 9, y un partidor antisentido, localizado en el extremo
5’ del exón 10. Así, se amplificaría el exón 10 completo (77 pb), el intrón 10 completo (1
kb), y parte del exón 9 (22 pb). Ya que los retropseudogenes no poseen intrones, el
fragmento esperado de 1 kb sólo puede corresponder a amplificación del locus funcional
de Peg1, y al mismo tiempo, se encuentra en la misma región génica amplificada por el set
1 de partidores.
Para la amplificación por PCR se usó como templado DNA genómico de una
hembra T. barrerae y sus dos embriones (T. barrerae 1708, 1708 embrión 1 y 1708
embrión 2). Los productos de amplificación obtenidos se analizaron por electroforesis en
geles de agarosa al 1.5%, lo que permitió estimar su concentración y la especificidad de la
reacción de PCR. La ausencia de contaminación de las soluciones utilizadas en la reacción
de amplificación se evaluó por ausencia de señal de amplificación en el carril
correspondiente al control negativo. Así, el producto obtenido es atribuible exclusivamente
a amplificación a partir del DNA genómico de T. barrerae utilizado como templado. Las
figuras 7 y 8 muestran un fraccionamiento electroforético en agarosa al 1.5% del producto
de amplificación por PCR con el set 1 y 2 de partidores, respectivamente. Se aprecia
claramente la señal correspondiente al fragmento esperado a la altura de los 300 pb, en el
caso del set 1 de partidores, y a la altura de 1 kb, en el caso del set 2 de partidores. Estos
fragmentos fueron purificados a partir del gel y clonados en el vector pCR4-Topo, para su
posterior secuenciación.
FIGURA 6. Representación esquemática de las regiones amplificadas por los sets de
partidores 1 y 2 en DNA genómico y cDNA de Peg1. Las flechas indican las posiciones de
los partidores, los rectángulos de colores representan los exones y las líneas negras entre
rectángulos representan los intrones. Se indica el tamaño aproximado de los fragmentos
amplificados por cada set de partidores.
4.6. Análisis de las secuencias génicas del fragmento Peg1 de T.
barrerae
4.6.1. Análisis de secuencias nucleotídicas resultantes de amplificación en
loci retropseudogénicos de Peg1
La secuenciación del producto de amplificación por PCR de 300 pb obtenido con el
set 1 de partidores permitió caracterizar cuatro loci pseudogénicos en el genoma de T.
barrerae. Se obtuvieron cuatro patrones de secuencias distintas, designados como A; B; C
y D. Estas cuatro secuencias no poseen intrones, por lo que emulan un fragmento de cDNA
de Peg1, y al compararlas con cDNA de Peg 1 en M. musculus mediante alineamiento
(ClustalX; Thompson et al., 1997) se aprecian múltiples delecciones que cambiarían el
marco de lectura (no mostrado). En la figura 9 se muestran el resultado del alineamiento
entre los cuatro patrones pseudogénicos encontrados, donde se puede apreciar la enorme
divergencia de las secuencias, las múltiples delecciones que éstas han acumulado, y la
presencia de numerosos codones de término. Al comparar estas secuencias con los patrones
de cDNA, se encontró que la secuencia 3 (Figura 4, secuencia 3.a) corresponde a un
transcrito del locus pseudogénico A, mientras que la secuencia 4 (Figura 4, secuencias 4.a y
4.b) corresponde a un transcrito del locus pseudogénico C.
FIGURA 7. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa al 1.5% de un producto de
amplificación del fragmento Peg1 por PCR con el set 1 de partidores. Carril 1: 1kb DNA
ladder (GibcoBRL) (500 ng); carril 2, 3, 4 y 5: producto de amplificación de Peg1 por PCR
en DNA genómico de T. barrerae 1708 (5 µl); carril 6: control negativo PCR (5 µl). La
flecha indica la banda correspondiente al fragmento Peg1 de 300 pb. Al amplificar con el
set 1 de partidores en DNA genómico de 1708 embrión 1 y 1708 embrión 2 se obtuvo un
fragmento del mismo tamaño molecular.
FIGURA 8. Fraccionamiento electroforético en gel de agarosa al 1.5% de un producto de
amplificación del fragmento Peg1 por PCR con el set 2 de partidores. Carril 1: 1kb DNA
ladder (GibcoBRL) (500 ng); carril 2 y 3: producto de amplificación de Peg1 por PCR en
DNA genómico de T. barrerae 1708 (5 µl); carril 4: control negativo PCR (5 µl). La flecha
indica la banda correspondiente al fragmento Peg1 de 1000 pb. Al amplificar con el set 2
de partidores en DNA genómico de 1708 embrión 1 y 1708 embrión 2 se obtuvo un
fragmento del mismo tamaño molecular.
4.6.2. Análisis de secuencias nucleotídicas resultantes de amplificación en
el locus funcional de Peg1
Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron alineadas mediante el programa
MacMolly Tetra 3.8 (http://www.mologen.com). En la figura 10 se aprecia una
representación esquemática de esta región del gen, junto a los elementos encontrados en
ella. Las regiones exónicas de estas secuencia corresponden a las encontradas en la
secuencia 2 del cDNA (Figura 4, secuencias 2.a, 2.b, 2.c y 2.d). Mediante inspección visual
del alineamiento se determinaron dos polimorfismos simples (1 bp) entre las secuencias.
Uno de ellos, ubicado en el intrón 9 (aproximadamente 360 pb río arriba del sitio aceptor de
splicing del exón 10), fue tentativamente denominado “sitio 1”, y correspondía a citosina o
adenina. El segundo sitio polimórfico se encontró en el exón 10, 37 pb río abajo de la
secuencia consenso del sitio aceptor de splicing, se denominó “sitio 2”, y correspondía a
adenina o guanina. En las figuras 11 y 12 se muestra un acercamiento del alineamiento en
las regiones polimórficas. La tabla I muestra combinaciones de estos sitios polimórficos,
que permitieron identificar tres alelos de Peg1 en la madre (T. barrerae 1708), dos en uno
de sus embriones (1708 embrión 1), y tres alelos en el segundo embrión (1708 embrión 2).
La secuencia 2 del cDNA posee guanina en el sitio 2, pero al encontrarse el otro sitio
polimórfico en una región intrónica, no fue posible determinar cuál de los alelos estaba
siendo expresado.
FIGURA 9. Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de los retropseudogenes de
Peg1 encontrados en T. barrerae. Las letras (A, B, C, D) corresponden a los cuatro
patrones de secuencias pseudogénicas encontradas. Las letras en rojo indican cambios
nucleotídicos en la secuencia. Los guiones rojos indican delecciones. Entre paréntesis se
muestra el número de clones en los que se encontró cada secuencia. Los asteriscos bajo el
alineamiento corresponden a sitios idénticos entre todas las secuencias alineadas. Los
círculos rojos marcan la posición de codones de término que interrumpen la secuencia
aminoacídica derivada.
FIGURA 10. Representación esquemática de la región genómica amplificada. Se
muestra un alineamiento de la región genómica amplificada en T. barrerae con las regiones
homeólogas en humano y M. musculus. Las flechas horizontales señalan las posiciones
respectivas para los partidores utilizados. Los exones se encuentran encerrados en
rectángulos, y se muestra también los intrones respectivos. En negrita se indican las
posiciones de los sitios de splicing normal y un asterisco muestra el sitio de splicing
alternativo
encontrado en la secuencia. Las flechas verticales señalan los sitios
polimórficos encontrados entre alelos, así como las bases que corresponden a éstos.
El análisis del alineamiento de las secuencias genómicas permitió también identificar
las secuencias consenso para los sitios de splicing entre el exón 9 y 10 del gen Peg1 en T.
barrerae. Además, se identificó un sitio de splicing alternativo 10 pb río abajo del sitio
aceptor usado normalmente. La secuencia 1 del cDNA (Figura 4, secuencias 1.a y 1.b)
corresponde a un transcrito del locus funcional de Peg 1 procesado mediante este sitio de
splicing alternativo.
FIGURA 11. Alineamiento de secuencias genómicas de Peg1 en el sitio polimórfico 1.
El rectángulo rojo enmarca uno de los sitios polimórficos encontrados, denominado como
“sitio 1”. Los números a la izquierda corresponden a los números de identificación de cada
secuencia. Los puntos indican sitios idénticos entre las secuencias alineadas.
FIGURA 12. Alineamiento de secuencias genómicas de Peg1 en el sitio polimórfico 2.
El rectángulo rojo enmarca uno de los sitios polimórficos encontrados,
denominado como
“sitio 2”. Los números a la izquierda corresponden a los números de identificación de cada
secuencia. Los puntos indican sitios idénticos entre las secuencias alineadas.
TABLA I. Distintos alelos de Peg1 en T. barrerae. En cada subsección se indica el
número de clones encontrados para cada combinación de polimorfismos simples en las
secuencias genómicas de Peg1. Sobre cada subsección se indica el número de
identificación de cada individuo, junto a la cantidad de alelos de Peg1 encontrados.
5. DISCUSION
Los genes duplicados por poliploidía pueden retener su función original, sufrir
diversificación en la función proteica o en su regulación, o una copia puede ser silenciada a
través de fenómenos mutacionales o epigenéticos. (Prince y Pickett, 2002; Rodin y Riggs,
2003). En esta tesis se estudió el efecto de la duplicación génica sobre el proceso
epigenético de la impronta, y, específicamente, sobre la expresión de los genes que la
presentan.
Las dos hipótesis que se pusieron a prueba en esta investigación fueron, primero,
que la impronta genómica se mantiene en el genoma duplicado de T. barrerae; y segundo,
que en este roedor tetraploide la impronta genómica se ve afectada por el proceso de
diploidización funcional, característico de los poliploides.
El análisis de las secuencias de cDNA de los cuatro embriones estudiados
comprueba ambas hipótesis. En ellos fue posible encontrar sólo un transcrito funcional para
Peg1. Esta secuencia la comparten los cuatro embriones, independientemente de su
procedencia, y demuestra la transcripción monoalélica de Peg1 en esta especie. Así, se
tiene expresión alélica preferencial, demostrando que la impronta genómica se mantiene de
alguna forma en este mamífero tetraploide, tal como en los diploides. Sin embargo, en
tetraploides la impronta podría haber dado lugar a expresión de uno o ambos alelos
heredados de un mismo progenitor. La expresión monoalélica de Peg1 implica equivalencia
con la condición diploide. Este hecho comprueba que la diploidización funcional también
ocurre en mamíferos poliploides, y ratifica la extrema importancia evolutiva de este evento
epigenético. Al respecto, la impronta se mantiene incluso en las condiciones de “shock
génico” impuestas por tetraploidía, y otorga nuevos matices a la polémica surgida acerca de
las causas evolutivas de este proceso.
La significancia biológica y las razones evolutivas de la impronta no son claras. Se
sostiene que la emergencia evolutiva de la impronta genómica ocurrió en un ancestro
común de los mamíferos vivíparos después de haber divergido de los monotremas (Murphy
y Jirtle, 2003). La haploidía funcional del proceso implica perder las ventajas de la
diploidía, que disminuyen el efecto deletéreo de las mutaciones recesivas (Spencer, 2000).
Al respecto, el costo de la expresión monoalélica es alto, y para superar la presión selectiva,
sus ventajas deben ser mayores que las desventajas que implica. Además, la expresión de
los genes con impronta es más compleja que lo que se había pensado inicialmente (Spencer,
2000). Los genes con impronta no siempre se expresan en forma dependiente del origen
parental, sino que su expresión puede variar desde ser estrictamente monoalélica a
estrictamente bialélica en diferentes tejidos y diferentes etapas del desarrollo. En efecto,
todos los genes con impronta se expresan bialélicamente al menos en un tejido, y en al
menos en una etapa del desarrollo (Paldi, 2003). Se sugiere que la iniciación de la
transcripción de uno u otro alelo es principalmente estocástica, donde la probabilidad de
iniciación exitosa del proceso determina si un gen es transcrito eficientemente. Entendido
así, es factible que los alelos paternos de un gen con impronta difieran de los maternos en la
probabilidad de transcripción debido a alteraciones cromatínicas (Pardo-Manuel de Villena
et al., 2000). En este contexto, la impronta no sería un mecanismo de regulación génica, y
la selección natural operaría sobre diferencias en la estructura de la cromatina según su
origen parental. Con ello se facilitaría el apareamiento durante la meiosis, se mantendría la
diferencia entre homólogos durante la reparación del DNA y se aseguraría la adecuada
recombinación mitótica y meiótica. (Paldi, 2003).
Teóricamente, un proceso de tal relevancia funcional debería presentarse también en
organismos poliploides. Mis datos demuestran que en T. barrerae la impronta genómica se
mantiene, a pesar del alto costo genético de silenciar tres de sus cuatro alelos. Esto implica
perder, para este gen, la ventaja evolutiva de redundancia génica con respecto a la
condición diploide. Tal efecto consiste en una mayor tolerancia a mutaciones e inserción de
elementos trasposables, debido al efecto tamponante de la duplicación génica (Soltis y
Soltis, 1999).
Investigaciones recientes sobre evolución génica en poliploides relacionan
fuertemente a los procesos epigenéticos con la adquisición de nuevas funciones en los
genes duplicados (Rodin y Riggs, 2003). La duplicación genómica conlleva relajación de la
selección sobre una copia génica, permitiendo la divergencia entre los genes duplicados y la
adquisición de nueva función (Wendel, 2000) Sin embargo, subsiste el dilema
pérdida/ganancia, porque la mayoría de los elementos duplicados recientes se degradará a
pseudogenes, debido a la mayor frecuencia de las mutaciones degenerativas respecto de las
ventajosas (Comai, 2000). Por lo tanto, parece requerirse un mecanismo adicional para
cambiar este equilibrio hacia la divergencia funcional. Al respecto, se ha sugerido que el
silenciamiento epigenético de los duplicados “protege” a estos genes de la
pseudogenización, ya que sólo la copia funcional sería blanco de la selección natural
(Rodin y Riggs, 2003).
Al analizar las secuencias de cDNA obtenidas se encontraron tres patrones de
secuencias no funcionales con un alto número de diferencias con respecto al cDNA
funcional de Peg1. Las secuencias aminoacídicas derivadas poseían cambios en el marco de
lectura y codones de término que interrumpían la secuencia aminoacídica. Estos
antecedentes sugirieron la presencia de transcritos pseudogénicos, lo que llevó a diseñar
una estrategia de amplificación de Peg1 que permitiese tipificar los alelos funcionales de
Peg1, y discriminar loci pseudogénicos del locus funcional. Para esto, se diseñó dos
conjuntos de partidores. Uno de ellos abarcaba entre los exones 9 y 12 del gen Peg1 en M.
musculus. Este set de partidores no amplificaba la región funcional, debido a que los
intrones generan una distancia enorme entre el partidor sentido y el antisentido. En un
retropseudogen, en cambio, estos partidores
amplificarían un fragmento de
aproximadamente 300 pb, cuya secuenciación y caracterización permitió distinguir cuatro
loci pseudogénicos en T. barrerae (loci A; B; C y D). Como se esperaba, dos de los tres
patrones
no
funcionales
de
cDNA
encontrados
correspondieron
a
transcritos
pseudogénicos. La mayoría de los retro-pseudogenes son inactivos, sin embargo, existen
instancias en las que el retrotransposón se mantiene como un gen funcional, carente de
intrones (Hirotsune et al., 2003). Los transcritos de pseudogenes pueden tener una
prevalencia mayor que su parálogo funcional, poseer expresión diferencial en distintos
tejidos, o presentar splicing alternativo. Sin embargo, su rol biológico es desconocido
(Mighell et al., 2000; Hirotsune et al., 2003). Algunos pseudogenes expresados pueden
tener importantes funciones. Por ejemplo, Makorina1-p1 regula la estabilidad del RNA
mensajero de su gen codificante homólogo (Hirotsune, 2003). Las funciones regulatorias
podrían favorecer una diversificación funcional más rápida que los genes que codifican
proteínas (Hirotsune et al., 2003). En el caso de los retropseudogenes de Peg1 que se
expresan en T. barrerae, ésta podría constituír una interesante vía de regulación génica que
permitiría interconectar la mayor tolerancia de los poliploides a la inserción de
retroelementos con el rápido desarrollo de una vía de regulación génica altamente
diversificable, que habría favorecido la evolución génica en esta especie.
Se encontró un transcrito del locus funcional, que por splicing alternativo sufrió
pérdida de funcionalidad, debido a corrimiento del marco de lectura y presencia de codones
de término que interrumpen la secuencia aminoacídica. No se conoce la causa de este tipo
de splicing alternativo, por lo que una investigación más exhaustiva del tema será requerida
en este aspecto.
Finalmente, debido a que se encontró sólo un polimorfismo en las regiones exónicas
de los alelos de Peg1, no fue posible discriminar entre una expresión monoalélica paterna o
materna, por lo que una de las proyecciones consistirá en clonar una porción exónica de
mayor tamaño, con el objeto de encontrar otros patrones polimórficos que permitan
responder a esta interrogante. Otras proyecciones involucran la identificación de
pseudogenes expresados por medio de Northern blot, y la incorporación de un mayor
número de individuos, así como de otros genes con impronta en mamíferos.
La continuación de los estudios de regulación génica en este roedor tetraploide es
fundamental, dado que la poliploidía ha jugado un rol significativo en la historia evolutiva
de plantas, vertebrados y otros eucariotas (Wendel, 2000). La poliploidización se ha
propuesto como un proceso altamente dinámico, que constituye una de las principales
fuerzas evolutivas en angiospermas, siendo la forma más drástica y eficiente para expandir
el tamaño del genoma (Otto y Whitton, 2000). Dentro de los vertebrados, se han encontrado
poliploides en varias especies de peces, anfibios y reptiles. La mayoría de los ejemplos
corresponden a especies que muestran un modo de herencia partenogénico, carecen de
cromosomas sexuales heteromórficos, o tienen un sistema laxo de determinación del sexo
(Otto and Whitton, 2000). Estudios recientes apoyan convincentemente que los humanos y
otros vertebrados serían antiguos poliploides. Al respecto, más de cincuenta familias de
genes, desde las aldolasas hasta los factores de transcripción con dedos de zinc se
encuentran presentes en copia simple en invertebrados, mientras su equivalente en
vertebrados corresponde hasta a cuatro genes, ubicados en distintos cromosomas (Spring,
1997). La teoría predice que bajo el sistema de determinación de sexo XY que poseen los
mamíferos, la mayoría de la progenie de individuos tetraploides sería estéril o inviable,
como consecuencia de la alteración de un mecanismo regulatorio, sensible al cambio en la
compensación de dosis (Wendel, 2000). Sin embargo, el descubrimiento de tetraploidía en
roedores ha revolucionado todas las ideas previas acerca de las limitaciones impuestas por
el sistema genético de los mamíferos (Gallardo et al., 1999), y emerge como un interesante
modelo de estudio en el campo de la regulación génica. Por el hecho de ser un poliploide
reciente, (Gallardo and Kirsch, 2001) y además ser el primer mamífero poliploide
reportado, Tympanoctomys barrerae ofrece una oportunidad única para estudiar los efectos
genómicos luego de una duplicación total.
BIBLIOGRAFIA
Bartolomei M. and Tilghman S. (1997). Genomic imprinting in mammals. Annu. Rev.
Genet. 31, 493-525.
Comai, L. (2000). Genetic and epigenetic interactions in allopolyploid plants. Plant. Mol.
Biol., 43, 387-399.
Eckardt, N.A. (2001). A sense of self: The role of DNA sequence elimination in
allopolyploidization. Plant Cell, 13, 1699-1704.
Ferguson-Smith, A. and Surani, M. (2001). Imprinting and the epigenetic asymmetry
between parental genomes. Science, 293, 1086-1089.
Futscher, B.W., Oshiro, M., Wozniak, R.J., Holtan, N., Hanigan, C.L., Duan, H. and
Domann F.E. (2002). Role for DNA methylation in the control of cell type-specific maspin
expression. Nat. Gen., 31, 175-179.
Gallardo, M. H., Bickham, J.W., Honeycutt, R.L., Ojeda, R.A.and Köhler, N. (1999).
Discovery of tetraploidy in a mammal. Nature, 401, 341.
Hirotsune, S., Yoshida, N., Chen, A., Garrett, L., Sugiyama, F., Takahashi, S., Yagami, K.,
Wynshaw-Boris, A. and Yoshiki, A. (2003). An expressed pseudogene regulates the
messenger-RNA stability of its homologous coding gene. Nature, 423, 91-96.
Jaenisch, R. and Bird, A. (2003). Epigenetic regulation of gene expression: how the
genome integrates intrinsic and enviromental signals. Nat. Gen., 33, 245-254.
Jenuwein, T. and Allis, D. (2001). Translating the histone code. Science 293, 1074-1079.
Jones, P. and Takai, D. (2001). The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.
Science, 293, 1068-1070.
Lefebvre, L., Viville, S., Barton, S., Ishino, F. and Surani, M. (1997). Genomic structure
and parent-of-origin-specific methylation of Peg1. Hum. Mol. Gen., 6,11, 1907-1915.
Li, T., Vu, T., Lee, K., Yang, Y., Nguyen, Ch., Bui, H., Zeng, Z., Nguyen, B., Hu, J.,
Murphy, S., Jirtle, R. and Hoffman, A. (2002). An imprinted PEG1/MEST antisense
expresed predominantly in human testis and in mature spermatozoa. JBC., 277, 16, 1351813527.
Martienssen, R. and Colot, R. (2001). DNA methylation and epigenetic inheritance in
plants and filamentous fungi. Science, 293, 1070-1073.
Matzke, M., Mette, M., Aufsatz, W., Jakowitsch, J. and Matzke,M.J. (1999). Host defenses
to parasitic sequences and the evolution of epigenetic control mechanisms. Genetica, 107,
271-287.
Matzke, M.A. and A.J. Matzke (1998). Epigenetic silencing of plant transgene as a
consequence of diverse cellular defense responses. Cell. Moll. Life. Sci., 54, 94 – 103.
Matzke, M.A., Scheid, O.M., and Matzke, A.J.M. (1999). Rapid structural and epigenetic
changes in ployploid and aneuploid genomes. BioEssays, 21, 761-767.
Murphy, S. and Jirtle, R. (2003). Imprinting evolution and the price of silence. BioEssays,
25, 577-588.
Mighell, A., Smith, N., Robinson, P. and Markham, A. (2000). Vertebrate pseudogenes.
FEBS Lett., 468, 109-114.
Ojeda, R.A., Borghi, G.B., Díaz, G.B., Giannoni, S.M., Mares, M.A., and Braun, J.K.
(1999). Evolutionary convergence of the highly adapted desert rodent Tympanoctomys
barrerae (Octodontidae). J. Arid. Environ., 41, 443-452.
Otto, S. P. and Whitton, J. (2000). Poliploid incidence and evolution. Annu. Rev. Genet. 34,
401-437.
Ozkan, H., Levy, A.A., and M. Feldman. (2001). Allopolyploidy-induced rapid genome
evolution in the wheat (Aegilops-Triticum) group. Plant Cell, 13, 1735-1747.
Paldi, A. (2003). Genomic imprinting: could the chromatin structure be the driving force?.
Curr. Top. Dev. Biol. 53, 115-138.
Pardo-Manuel de Villena, F., de la Casa-Esperón, E. and Sapienza, C. (2000). Natural
selection and the function of genome imprinting: beyond the silenced minority.TIG, 16, 12,
573-579.
Pennisi, E. (2001). Behind the scenes of gene expression. Science, 293, 1064-1067.
Pikaard, C. S., (2001). Genomic change and gene silencing in polyploids. TIG, 17, 675677.
Prince, V. and Pickett, B. (2002). Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes.
Nat. Rev. Gen. 3, 827-837.
Rodin, S., Riggs, A. (2003). Epigenetic silencing may aid evolution by gene duplication.
Journ. Mol. Evol., 56, 718-729.
Reik, W., and Dean, W. (2001). DNA methylation and mammalian epigenetics.
Electrophoresis, 22, 2838-2843.
Reik, W., Santos, F., Dean, W. (2002). Mammalian epigenomics: reprogramming the
genome for development and therapy. Theriogenology, 59, 21-32.
Reik, W. and Walter, J. (2001). Evolution of imprinting mechanisms: the battle of the sexes
begins in the zigote. Nat. Gen., 27, 255-256.
Sambrook, J., Fritch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory
manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 9.17-9.19.
Shaked, H., Kashkush, K., Ozkan, H., Feldman, M. and Levy, A. A. (2001). Sequence
elimination and cytosine methylation are rapid and reproducible response of the genome to
wide hybridization and allopolyploidy in wheat. Plant Cell, 13, 1749 – 1759.
Scheid, M. O., Jakovleva, L., Afsar, K., Maluszynska, J. and Paszkowski, J. (1996). A
change in ploidy can modify epigenetic silencing. PNAS, 93, 7114-7119.
Soltis, D. and Soltis, P. (1999). Polyploidy: recurrent formation and genome evolution.
TREE, 14, 9, 348-352.
Spencer, H. (2000). Population genetics and evolution of genomic imprinting. Annu. Rev.
Genet. 34, 457-477.
Spring, J. (1997). Vertebrate evolution by interspecific hybridization: Are we ployploid?
FEBS Lett. 400, 2-8.
Thompson, J., Gibson, T., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D. (1997). The
CLUSTAL_X window interface: flexible strategies for multiple sequence alignement aided
by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25, 4876-4882.
Vanin, E. (1985). Processed pseudogenes: characteristics and evolution. Annu. Rev. Gen.,
19, 253-272.
Wendel, J. F., (2000). Genome evolution in poliploids. Plant Mol. Biol., 42, 225-249.
Wu, C., Morris, J. (2001). Genes, genetics, and epigenetics: a correspondence. Science,
293, 1103-1105.