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REVISTA ESPAÑOLA DE ENFERMEDADES DIGESTIVAS
Copyright © 2005 ARÁN EDICIONES, S. L.
REV ESP ENFERM DIG (Madrid)
Vol. 97. N.° 11, pp. 805-814, 2005
Role of intestinal bacterial overgrowth and intestinal motility in
bacterial translocation in experimental cirrhosis
E. Sánchez, F. Casafont, A. Guerra, I. de Benito1 and F. Pons-Romero
Services of Gastroenterology and 1Microbiology. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander, Spain
ABSTRACT
Background: intestinal bacterial overgrowth (IBO) is related
to small bowel motility and has been involved in the pathogenesis
of bacterial translocation (BT) in experimental models, and both
overgrowing gut flora and translocating bacteria to mesenteric
lymph nodes are common features in cirrhosis.
Objectives: the aims of this study were to analyze cecal aerobic bacteria and intestinal transit in cirrhotic rats, and their relationship with BT, evaluating the role of intestinal bacterial overgrowth and small bowel dismotility in the development of BT in
experimental cirrhosis.
Material and methods: we included twenty-seven male
Sprague-Dawley rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis
without ascites and ten controls. Cultures of mesenteric lymph
nodes (MLN), peripheral and portal blood, liver, spleen and cecal
samples were carried out. Small intestinal transit was determined
in ten cirrhotic rats and in ten control rats.
Results: the prevalence of bacterial translocation was 56%.
Total cecal aerobic bacteria count was significantly higher in cirrhotic rats than in control rats (p < 0.001). Cirrhotic rats with
translocated bacteria had higher total aerobic intestinal counts
than culture-negative MLN bacteria (p < 0.05). The prevalence of
total intestinal bacterial overgrowth in cirrhotic animals was 67%,
and 0% in control animals (p < 0.001). According to BT, total
IBO was more frequent in cirrhotic rats with BT versus those
without BT (93 vs. 33%) (p < 0.001). Of the translocating bacteria, 95.6% were found to be overgrown in the cecum. The smallintestinal transit was slower in cirrhotic rats (60.5 ± 12.7 cm vs.
81.2 ± 5.7 cm) than in control animals (p < 0.001).
Conclusions: these results suggest that the increase of intestinal aerobic bacteria in experimental cirrhosis is associated with
translocation. In addition, IBO is frequent in cirrhotic rats, and is
supposed to play an important role in the development of BT. Im-
This work has been supported by a grant (C03/02) from FIS-ISCIII, “Red
Nacional de Investigación en Hepatología y Gastroenterología” (RHIGH).
Recibido: 05-05-05.
Aceptado: 31-05-05.
Correspondencia: Fernando Casafont Morencos. Servicio de Aparato Digestivo, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Avda. de Valdecilla, s/n. 39008 Santander. e-mail: [email protected]
paired motility of the small intestine is a common feature in cirrhosis and may be implicated in the pathogenesis of IBO.
Key words: Intestinal bacterial overgrowth. Bacterial translocation. Experimental cirrhosis. Intestinal motility.
Sánchez E, Casafont F, Guerra A de Benito I, Pons- Romero F.
Role of intestinal bacterial overgrowth and intestinal motility
in bacterial translocation in experimental cirrhosis. Rev Esp
Enferm Dig 2005; 97: 805-814.
INTRODUCTION
The passage of viable flora from the gastrointestinal
tract to the mesenteric lymph nodes (MLN) is known as
bacterial translocation (BT) (1). This process has been
documented to occur in numerous clinical situations, and
has been associated with the development of sepsis by
gram-negative bacteria (2).
Infections are frequent in the setting of cirrhosis, and
organisms of enteric origin cause most of them (3). Several studies have documented the importance of BT in
cirrhosis (4,5), and it appears to play a key role in the
pathogenesis of spontaneous bacterial peritonitis (SBP)
(6,7). The mechanisms promoting the translocation of the
gut flora in cirrhosis are not totally understood, although
endotoxemia and malnutrition have both been involved
(8-10). The disruption of the gut flora equilibrium is related to the development of BT (11,12). Intestinal bacterial overgrowth (IBO) has been reported in cirrhotic patients and related to the development of SBP (13-16). In
addition, selective intestinal decontamination with suppression of aerobic intestinal bacteria prevents BT in cirrhotic rats, and is the current prophylaxis for SBP in humans (17-20). On the other hand, several studies have
shown that impaired intestinal motility is one of the fac-
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E. SÁNCHEZ ET AL.
tors contributing to enteric bacterial overgrowth, and also
that intestinal transit is delayed in the setting of cirrhosis
mainly related to the severity of disease (21-24).
The aims of the present study were: first, to evaluate
the aerobic cecal flora in cirrhotic rats and its relationship
with BT; second, to establish the role of IBO in bacterial
translocation; and third, to study intestinal motility in experimental cirrhosis.
MATERIAL AND METHODS
Twenty-seven rats with carbon tetrachloride-induced
cirrhosis and ten normal rats were studied. The induction
of cirrhosis was performed according to the experimental
model described by Runyon et al. (25). Male SpragueDawley rats were caged under constant temperature and
humidity conditions, with a 16/8 hour light/dark cycle,
and fed with standard rodent chow, all in agreement with
the guidelines for animal research in the Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals. Rats were observed
daily. Cirrhosis induction began with the animals weighing 100-150 g, and by administering 1.5 mmol/l of phenobarbital in the drinking water. When the rats reached
200 g of body weight, intragastric CCl4 was given using a
50% dilution with olive oil by esophagic cannulation
with a special needle and no anesthesia. CCl4 was given
weekly with a starting dose of 40 µl, with subsequent
doses being increased depending on the change in body
weight.
Bacterial translocation and IBO study
When the animals reached an established cirrhotic situation (between 9 and 11 weeks) various samples were
obtained for later processing. Anesthesia was induced by
inhalation of ethyl ether (Iqanalítica, Probus S.A.
Barcelona, Spain). One sample of peripheral blood was
taken before laparotomy.
Laparotomy was then carried out under aseptic conditions, following removal of the abdominal fur and applying a local antiseptic solution. The peritoneum was then
opened and potential sources of infection were searched
for. Samples were obtained in the following order: portal
blood, mesenteric lymph nodes from the ileo-cecal area,
liver, and spleen; in all cases, this was performed before
death. Finally, cecal samples were collected. Sections of
the liver were also obtained for histological analysis.
Samples of peripheral and portal blood were cultured
by immediate inoculation into blood culture bottles
(Bactec Plus/ aerobio) and by later processing in a Bactec
9240 system (Becton-Dickinson. Maryland. USA). Liver,
spleen, and MLN samples were homogenized in brainheart medium and then plated (0.1 ml) on CNA and MacConkey agar for twenty-four hours. Blood bottles with a
positive culture were plated in the same way. Cecal sam-
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ples were homogenized in brain-heart medium, and diluted to 10-2, 10-4 and 10-6. Diluted homogenates of cecal
samples were cultured (0.1 ml) in the same plates (CNA,
and MacConkey). Microorganisms were identified by
usual bacteriological methods: API 20E (Bio Mérieux
SA. Mercy l’Etolile. France) and MicroScan (Baxter
Healthcare, West Sacramento, CA, USA).
Bacterial translocation was defined as culture-positivity of MLN. Intestinal aerobic bacterial overgrowth was
defined as a cecal bacterial count higher than the mean
value plus two standard deviations of bacterial count in
normal rats.
Intestinal transit determination
Gavage feedings of nonabsorbable liquid markers
were given via an orogastric tube to determine intestinal
transit. One hour before the BT study, 0.1 ml of Evans
Blue solution (50 mg in 1 ml of 0.9% NaCl, Sigma
Chemical Co.) was administered via the orogastric tube.
Upon completion of the BT study, the whole small intestine was evaluated. As previously reported (26), intestinal transit was determined by measuring the distance between the gastric pylorus and the distal site of small
intestine that was colored in blue.
Statistical analysis
Results are expressed as means or proportions, as required. Stools and MLN counts of colonies are presented
as log10 colony-forming units (CFU) per ml of homogenate. Intestinal transit is expressed as the distance in
centimeters between the gastric pylorus and the distal site
of small bowel that was colored in blue. Kruskal-Wallis
non-parametric ANOVA test was used for multiple comparisons. Mann-Whitney U test and Chi square or Fisher’s exact test were used for comparisons between
groups. A p-value of less than 0.05 was considered significant.
RESULTS
All the rats had cirrhosis at the time of the study. Regarding BT, pathogenic bacteria were cultured from the
MLN of 56% of rats. None of the control rats translocated (p < 0.02). The majority of bacteria isolated were enteric gram-negative organisms, and the most frequent
cultured organism was E. coli, which grew in 66.7% of
cultures. Seven polymicrobial cases of BT were found.
Total MLN bacterial count in translocated rats was 3.37 ±
1.24. Table I shows bacteria isolated in cecal samples and
mesenteric lymph nodes.
Total cecal aerobic bacterial CFU was significantly
higher in cirrhotic rats (15.61 ± 5.36 log10 CFU) than in
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ROLE OF INTESTINAL BACTERIAL OVERGROWTH AND INTESTINAL MOTILITY
IN BACTERIAL TRANSLOCATION IN EXPERIMENTAL CIRRHOSIS
Table I. Cultures of samples from cirrhotic rats
Rat nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Cecum sample
MLN
E. coli, EB
E. coli, EB, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, PT, PS
E. coli, PRT, Aerogenes
E. coli, EC, PS
E. coli, PRT
E. coli, EB, EC
E. coli, EB, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, PRT
E. coli
E. coli, EB, Klebsiella
E. coli, PRT
E. coli, EB
E. coli
E. coli, EB
E. coli
E. coli, PRT
E. coli, EB
E. coli, EB, P
E. coli, Proteus
E. coli, EB
E. coli, EB, PRT
E. coli
NG
EB, EC
NG
NG
EC, PRT
E. coli, PS, PRT
PRT, Aerogenes
E. coli, EC
E. coli
NG
E. coli, EB
EC
NG
NG
E. coli
E. coli, PRT
E. coli
NG
EB
NG
NG
NG
E. coli
E. coli
NG
NG
EB: Enterobacter sp.; EC: Enterococci; PRT: Proteus sp.; PS: Pseudomonas sp.; NG: no growth.
control rats (7.89 ± 2.07 log10 CFU) (p < 0.001). This increase of cecal bacterial count was mainly due to a greater
UCF count of Escherichia coli (p < 0.001) and Proteus sp.
(p < 0.001) (Table II). Enterococci were cultured in 7 cirrhotic rats and Enterobacter sp. in 17 cirrhotic animals,
while they were not detected in control rats.
Cirrhotic rats were classified according to the presence
or absence of BT; in 12 animals bacterial translocation
was not detected. Total aerobic cecal bacterial counts in
both groups and in controls are illustrated in figure 1. Cirrhotic rats with translocated bacteria had higher total aerobic intestinal counts (17.36 ± 4.71 log10 CFU) compared
to culture-negative MLN bacteria (13.39 ± 5.52 log10
CFU) (p < 0.05). Cecal bacterial count was also higher in
Log
10
CFU/ ml
+1.96*SD
+SD
Mean
-DS
-1.96*SD
30
25
p < 0.001
20
15
10
5
0
SI
With TB
CTR
Controls
NO
Without TB
Fig. 1. Total intestinal aerobic bacteria (log10) in cecal samples of normal rats, cirrhotic rats without bacterial translocation (BT) and cirrhotic
anmals with BT.
Número total de bacterias aerobias intestinales (log10) en muestras de
ciego de rats controles y ratas cirróticas con o sin traslocación bacteriana.
animals without BT than in controls (7.89 ± 2.07 log10
CFU). Significant differences in bacterial count were observed between groups (KW = 17.32, p < 0.001).
The prevalence of total intestinal bacterial overgrowth
in cirrhotic animals was 67%. According to BT, total IBO
was more frequent in cirrhotic rats with BT than in those
without BT (93 vs. 33%) (p < 0.001) (Fig. 2). The relationship between translocation of a specific organism and
the presence of intestinal overgrowth for this microorganism in cirrhotic rats was evaluated (Table III). Bacterial
translocation of a specific bacterium was almost always
associated with the IBO for that organism, and this occurred in all but one case of BT (only one enterococcus
translocated without enterococci overgrowth in the ce-
Table II. Aerobic bacterial intestinal population (log10 UFC)
Total flora
E. coli
Enterococci
Enterobacter
Pseudomonas
Proteus
Klebsiella
Controls
Cirrhotics
7.89 ± 2.07
7.88 ± 2.07
0
0
0
5.66 ± 0.93
0
15.61 ± 5.36
15.02 ± 5.23
17.52 ± 4.89
14.61 ± 5.76
18.97 ± 0.77
15.33 ± 4.34
11.51
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p < 0.001
p < 0.001
p < 0.001
Fig. 2. Prevalence of intestinal bacterial overgrowth (IBO) in cirrhotic
rats with and without bacterial translocation (BT).
Prevalencia del sobrecrecimiento bacteriano intestinal (SBI) en ratas cirróticas con o sin traslocación bacteriana (TB).
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Table III. Presence of bacterial translocation for a specific organism in cirrhotic rats with and without intestinal bacterial
overgrowth
Total
E. coli
Enterococci
Enterobacter sp.
Pseudomonas sp.
Proteus sp.
Klebsiella sp.
Aerogenes sp.
IBO (-)
1/9
IBO (+)
14/18
0/9
1/21
0/12
0/25
0/12
0/26
0/26
10/18
3/6
3/15
1/2
4/15
0/1
1/1
cum, although it was present in cecal cultures). Cecal
overgrowth of one specific organism was not always associated with the translocation of that organism, and each
organism showed a different translocation rate: E. coli
56%, Enterococci 50%, Pseudomonas sp. 50%, Proteus
sp. 27%, Enterobacter sp. 20%. One animal presented cecal overgrowth and translocation to MLN regarding
Aerogenes sp. (Table III).
Intestinal transit was delayed in cirrhotic animals; the
nonabsorbable marker travelled 60.5 ± 12.7 cm distal to the
pylorus in cirrhotic rats, versus 81.2 ± 5.7 cm in controls (p
< 0.05) (Fig. 3). It was not possible to establish a significant
relationship between BT and intestinal transit time.
cm
100
90
80
70
60
50
40
30
Controls
Cirrhosis
Fig. 3. Intestinal transit in cirrhotic rats and controls.
Tránsito intestinal en ratas cirróticas y controles.
DISCUSSION
The passage of gut flora to MLN (bacterial translocation) has been postulated as the main pathogenic mechanism in cases with infection due to enteric gram-negative
bacteria (1,27). Infectious complications by enteric flora
are common in the setting of cirrhosis, and BT has been
demonstrated to play an important role in the development of spontaneous bacteremia and spontaneous bacterial peritonitis (28-32).
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This study confirms the high prevalence of BT in experimental cirrhosis, even in the early stages of the disease without ascites. In previous studies the development
of BT was more frequent in cirrhotic rats with ascites,
and García-Tsao found BT only in cirrhotic animals with
ascites (4,6). Our data suggest that ascites is not necessary for the development of BT, and there must be other
promoting factors in cirrhosis. There may be several
causes for this high prevalence of BT in cirrhosis, such as
intestinal mucosal abnormalities, associated malnutrition,
immunological alterations, and intestinal bacterial overgrowth (4,33-39).
In the present study cirrhotic rats showed a significantly higher total intestinal aerobic bacteria count than control animals, mainly due to gram-negative enterobacteria
(E. coli and Proteus). This moved the rate of IBO up to
67% in cirrhotic animals, which is in agreement with
findings by other author (39,40). These bacteria are the
most frequently implicated in the development of BT, as
previously published (7,10,30,39). Moreover, we observed that the intestinal bacterial count in cirrhotic rats
was higher in animals with BT than in those without it.
Similarly, cirrhotic rats with IBO showed a higher rate of
BT than those without IBO.
Such a relationship between IBO, BT, and the occurrence of infection has been seen as much at the experimental level as in human studies. In animal models IBO
leads to translocation, and in cirrhotic animals it also
leads to the development of SBP (6,7,41). Our results
stand for the presumed role of bacterial overgrowth as a
promoting factor of bacterial translocation in liver cirrhosis, then favoring the development of SBP. In fact, our
group has previously found that in cirrhotic patients the
presence of IBO was related to a higher incidence of SBP
during hospitalization (13). All these data suggest that in
liver cirrhosis intestinal bacterial overgrowth promotes
BT and then the development of infectious complications
such as SBP.
A point to highlight in our study is that even when
translocation of a specific bacterium from the gut was associated with a cecal overgrowth of that same organism,
not all animals with IBO showed translocation. Thus, in
experimental cirrhosis, IBO for each bacteria is a necessary but not sufficient factor for the translocation of that
organism, and therefore some other factors must be involved. Intrinsic virulence of bacteria might be one of
these factors; there are microorganisms that are more predisposed to translocate, perhaps because of differences in
its ability to penetrate the intestinal epithelium (42-44).
Indeed, in our study we observed that the translocation
rate of overgrown bacteria was different –E. coli and Enterococci were more predisposed, which is consistent
with published results.
The indigenous gut flora is controlled by different defensive physiological mechanisms, such as gastrointestinal motility, gastric acidity, and bacterial interactions
(36,42,45-47). Some of these can be impaired in cirrho-
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IN BACTERIAL TRANSLOCATION IN EXPERIMENTAL CIRRHOSIS
sis, where hypoclorhidria (15) and delayed small intestinal transit (47-51) have been described. Evidence from
various studies has shown that altered intestinal motility
may be involved in the pathogenesis of IBO in patients
with liver disease (23,51), and could be associated with a
higher incidence of SBP (24). A number of studies where
the administration of prokinetic drugs caused a decrease
in both IBO and BT point at the contribution of altered
intestinal motility to these phenomena. In our study, cirrhotic animals showed a slower intestinal transit than
controls, although a significant relationship between this
dismotility and BT could not be established. The lack of
this statistic correlation may be due to the non-direct nature of the method used to assess intestinal transit compared with the more precise methods used in other studies (55,56).
Taken together, these data suggest that intestinal bacterial overgrowth in the setting of cirrhosis may appear early, yet in the absence of ascites, and it is one of the factors
triggering bacterial translocation. In addition, it seems
that overgrowth of a specific bacteria is a necessary but
non-sufficient condition to produce translocation. Finally,
cirrhosis is associated with reduced intestinal motility,
which prevents normal peristaltic clearance; this may result in enteric bacterial overgrowth and subsequent
translocation.
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Papel del sobrecrecimiento bacteriano intestinal y de la motilidad
intestinal en la traslocación bacteriana en un modelo experimental
de cirrosis
E. Sánchez, F. Casafont, A. Guerra, I. de Benito1 y F. Pons-Romero
Servicios de Aparato Digestivo y 1Microbiología. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Universidad de
Cantabria. Santander
RESUMEN
Introducción: el sobrecrecimiento bacteriano intestinal (SBI)
está relacionado con la motilidad del intestino delgado y diferentes
trabajos con modelos experimentales han sugerido su relación con
el desarrollo de traslocación bacteriana (TB). Tanto el sobrecrecimiento bacteriano intestinal como la traslocación bacteriana son
eventos frecuentes en la cirrosis hepática.
Objetivos: los objetivos de este estudio han sido analizar la
población cecal de bacterias aerobias y el tránsito intestinal en un
modelo de ratas cirróticas y su relación con la TB.
Material y métodos: el estudio se ha realizado en un modelo
experimental de cirrosis inducida por tetracloruro de carbono por
vía oral en ratas Sprague-Dawley. Se llevaron a cabo cultivos microbiológicos convencionales a partir de ganglios linfáticos mesentéricos (GLM), sangre portal y periférica, hígado, bazo, y muestras
cecales de todos los animales. Además se determinó el tiempo de
tránsito intestinal en 10 ratas cirróticas y en 10 controles.
Resultados: la prevalencia de la traslocación bacteriana en
los animales cirróticos fue de un 56%. La población de gérmenes
aerobios en el ciego en las ratas cirróticas fue significativamente
mayor (p < 0,01) que en las ratas controles. Las ratas cirróticas
con TB presentaron un población bacteriana intestinal más elevada que las ratas sin TB (p < 0,05). La prevalencia de SBI en los
animales cirróticos fue de un 67% frente a un 0% en los animales
control (p < 0,01); también el SBI fue más frecuente en las ratas
cirróticas con TB que en las cirróticas sin TB (93 vs. 33%) (p <
0,01). De las bacterias que traslocaron un 95,6% presentaban sobrecrecimiento en ciego. El tránsito intestinal fue más lento en las
ratas cirróticas (60,5 ± 12,7 vs. 81,2 ± 5,7 cm) que en los animales controles (p < 0,01).
Conclusiones: estos resultados sugieren que el sobrecrecimiento bacteriano es frecuente en ratas cirróticas y predispone al
desarrollo de traslocación bacteriana intestinal. Además, este sobrecrecimiento probablemente está favorecido por la existencia de
una dismotilidad intestinal, frecuente en este modelo de cirrosis
experimental.
Palabras clave: Sobrecrecimiento bacteriano intestinal. Traslocación bacteriana. Cirrosis experimental. Motilidad intestinal.
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PAPEL DEL SOBRECRECIMIENTO BACTERIANO INTESTINAL Y DE LA MOTILIDAD
INTESTINAL EN LA TRASLOCACIÓN BACTERIANA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE CIRROSIS
INTRODUCCIÓN
El paso de bacterias viables desde el intestino a los
nódulos linfáticos mesentéricos (GLM) es conocido
como traslocación bacteriana (TB) (1) y es un fenómeno
que ocurre en numerosas situaciones clínicas que se caracterizan por el frecuente desarrollo de sepsis causadas
por gérmenes gram-negativos (2).
Las infecciones son una complicación frecuente de los
enfermos cirróticos y la mayoría de ellas están causadas
por organismos de origen entérico (3). Diferentes estudios han documentado la importancia de la TB en la cirrosis (4,5), la cual parece jugar un papel importante en la
patogénesis de estas infecciones y especialmente en la
peritonitis bacteriana espontánea (PBE) (6,7). Los factores que favorecen la traslocación de la flora intestinal en
la cirrosis no están completamente definidos y entre otros
han sido involucrados la endotoxemia y la malnutrición
(8-10). La ruptura del equilibrio ecológico en la flora intestinal parece ser un factor importante que se ha relacionado también con el desarrollo de TB y la predisposición
a la aparición de infecciones (11,12). Por ejemplo, el sobrecrecimiento bacteriano intestinal (SBI) que se ha observado en algunos pacientes cirróticos, ha sido relacionado con una mayor predisposición al desarrollo de PBE
(13-16). Otro dato que demuestra la importancia de la
flora intestinal como factor patogénico de las infecciones
en la cirrosis es el hecho de que la descontaminación intestinal selectiva mediante la administración de antibióticos, ha demostrado que previene la TB en ratas cirróticas,
y es la profilaxis habitual de la PBE en pacientes cirróticos (17-20). Además, diversos estudios han demostrado
que una motilidad intestinal deficiente es uno de los factores que contribuye al desarrollo de sobrecrecimiento
bacteriano intestinal (SBI) y algunos autores han observado la existencia de un tránsito intestinal enlentecido en
la cirrosis hepática, en relación con la gravedad de la enfermedad (21-24).
Los objetivos de este estudio han sido, en primer lugar, analizar la flora bacteriana del ciego en ratas cirróticas y su relación con la traslocación bacteriana; en segundo lugar establecer el papel que desempeña el SBI en la
traslocación bacteriana; y finalmente, estudiar la motilidad intestinal en relación con estos fenómenos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Hemos estudiado 27 ratas macho Sprague-Dawley con
cirrosis inducida por tetracloruro de carbono (CCl4) y
diez ratas sanas como controles. La cirrosis se ha inducido siguiendo el modelo experimental descrito por Runyon y cols. (25): los animales son mantenidos a temperatura y humedad constantes, con un ciclo de luz-oscuridad
de 16/8 horas, y alimentados con pienso estándar; de
acuerdo con las indicaciones para la investigación con
animales plasmadas en la “Guía para el Cuidado y Uso de
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los Animales de Laboratorio”. Los animales estuvieron
bajo observación diaria. La inducción de la cirrosis comenzó cuando pesaban entre 100 y 150 g, mediante la
adición de fenobarbital al agua de bebida a una concentración de 1,5 mmol/L. Cuando las ratas alcanzaron los
200 g de peso se les administró CCl4 por vía intragástrica,
usando una dilución al 50% con aceite de oliva, y mediante canulación esofágica con una aguja especial, sin
anestesia. El CCl4 fue administrado semanalmente partiendo de una dosis de 40 µL que fue aumentándose según el incremento de peso corporal del animal.
Estudio de la traslocación bacteriana y del SBI
Cuando los animales alcanzaron un estado de cirrosis
estable (entre 9 y 11 semanas) recogimos las muestras
para su procesamiento posterior. Para ello los anestesiamos con éter etílico (Iqanalítica, Probus S.A. Barcelona).
Antes de la laparotomía tomamos una muestra de sangre
periférica.
La laparotomía se llevó a cabo bajo condiciones de
asepsia tras remover la piel y aplicar localmente una solución antiséptica. A continuación abrimos el peritoneo y
exploramos posibles fuentes de infección. Las muestras
fueron recogidas en el siguiente orden: sangre portal, nódulos linfáticos mesentéricos de la cavidad íleo-cecal, hígado, y bazo; siempre antes de la muerte del animal. Finalmente, se recogieron muestras de ciego. También se
obtuvieron muestras de hígado para análisis histológico.
Inoculamos inmediatamente las muestras de sangre
portal y periférica en frascos de hemocultivo (Batec Plus/
aerobio) y luego las procesamos en el sistema Bactec
9240 (Beckton-Dickinson, Maryland, EE.UU.). Homogeneizamos las muestras de hígado, bazo, y nódulos linfáticos que fueron colocadas en placas de CNA y agar MacConkey por espacio de 24 horas. Las muestras de ciego
fueron homogeneizadas y luego diluidas 10:2, 10:4 y
10:6 previo a su cultivo en placas similares. Identificamos los microorganismos mediante los métodos bacteriológicos convencionales: API 20E (Bio Mérieux S.A.
Mercy l’Etoile, France) y MicroScran (Baxter Healthcare, West Sacramento, CA, EE.UU.).
Definimos la existencia de traslocación bacteriana
como el hallazgo de cultivo positivo en los GLM y la
existencia de SBI cuando el contaje de bacterias en ciego
superó la media más dos desviaciones estándar de la población en ratas normales.
Determinación del tránsito intestinal
Una hora antes del estudio de TB administramos a los
animales un marcador líquido no absorbible, azul de
Evans (50 mg en 1 mL de solución de NaCl al 0,9%), a
través de un tubo orogástrico. Tras finalizar el estudio de
traslocación evaluamos el intestino delgado en su totali-
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dad. Siguiendo un método descrito previamente (26) determinamos la velocidad de tránsito intestinal midiendo
la distancia entre el píloro y el sitio más alejado del intestino delgado teñido con azul de Evans.
Análisis estadístico
Expresamos los resultados como medias o proporciones, según lo requerido. El número de colonias se expresan como logaritmo en base 10 de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mL de homogeneizado.
Expresamos el tránsito intestinal como la distancia medida en centímetros entre el píloro y la zona más distal del
intestino teñida con el colorante. Para las comparaciones
múltiples hemos usado el test ANOVA y el test no paramétrico de Kruskal-Wallis. Para las comparaciones entre
grupos hemos usado el test de la U de Mann-Whitney y
los test de Fisher o Chi cuadrado. Consideramos significativos los valores de p menores de 0,05.
RESULTADOS
Todas las ratas tuvieron cirrosis en el momento del estudio. En cuanto a TB, el 56% de las ratas presentaron
cultivos positivos en GLM; ninguna de las ratas controles
presentó traslocación (p < 0,02). La mayoría de las bacterias aisladas fueron gram-negativas entéricas y el organismo cultivado más frecuentemente fue E. coli, que creció en un 66,7% de los cultivos. Encontramos 7 casos de
TB polimicrobiana. La población bacteriana total en los
GLM de las ratas con traslocación fue de 3,37 ± 1,24
log10 CFU. La tabla I muestra las bacterias aisladas de las
muestras de ciego y de nódulos linfáticos mesentéricos.
La población bacteriana total en ciego fue significativamente mayor en las ratas cirróticas (15,61 ± 5,36 log10
CFU) que en las ratas controles (7,89 ± 2,07 log10 CFU),
p < 0,01. Este incremento se debió fundamentalmente a
un aumento en la población de E. coli (p < 0,01) y de
Proteus sp. (p < 0,01) (Tabla II). En 7 ratas cirróticas encontramos Enterococus y en 17 ratas cirróticas Enterobacter sp.; no encontramos estos organismos en ratas
controles.
Clasificamos las ratas cirróticas de acuerdo a la presencia o ausencia de TB; no detectamos traslocación en
12 animales cirróticos. La figura 1 ilustra el número total
de bacterias aerobias en ciego de ambos grupos y el grupo control. Las ratas cirróticas con traslocación presentaron una población bacteriana intestinal más elevada
(17,36 ± 4,71 log10 CFU) que las que no presentaron traslocación (13,39 ± 5,52 log10 CFU) (p < 0,05). Estas últimas a su vez presentaron mayor población que los animales controles (7,89 ± 2,07 log10 CFU). Estas diferencias
entre los grupos fueron estadísticamente significativas
(KW = 17,32; p < 0,01).
La prevalencia de SBI en las ratas cirróticas fue de un
67%. En relación a la traslocación, el SBI total fue más
REV ESP ENFERM DIG (Madrid)
Tabla I. Resultados de los cultivos del contenido cecal y de
los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) en los animales
cirróticos
Nº de rata
Muestra de ciego
GLN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
E. coli, EB
E. coli, EB, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, PT, PS
E. coli, PRT, Aerogenes
E. coli, EC, PS
E. coli, PRT
E. coli, EB, EC
E. coli, EB, PRT
E. coli, EB, EC, PRT
E. coli, EB, PRT
E. coli
E. coli, EB, Klebsiella
E. coli, PRT
E. coli, EB
E. coli
E. coli, EB
E. coli
E. coli, PRT
E. coli, EB
E. coli, EB, P
E. coli, Proteus
E. coli, EB
E. coli, EB, PRT
E. coli
SC
EB, EC
SC
SC
EC, PRT
E. coli, PS, PRT
PRT, Aerogenes
E. coli, EC
E. coli
SC
E. coli, EB
EC
SC
SC
E. coli
E. coli, PRT
E. coli
SC
EB
SC
SC
SC
E. coli
E. coli
SC
SC
EB: Enterobacter sp.; EC: Enterococci; PRT: Proteus sp.; PS: Pseudomonas sp.; SC: sin crecimiento.
Tabla II. Población intestinal de gérmenes aerobios en las
muestras cecales (log10 UFC)
Total flora
E. coli
Enterococci
Enterobacter
Pseudomonas
Proteus
Klebsiella
Controls
Cirrhotics
7,89 ± 2,07
7,88 ± 2,07
0
0
0
5,66 ± 0,93
0
15,61 ± 5,36
15,02 ± 5,23
17,52 ± 4,89
14,61 ± 5,76
18,97 ± 0,77
15,33 ± 4,34
11,51
p < 0,001
p < 0,001
p < 0,001
frecuente en las ratas cirróticas con TB que sin ella (93
vs. 33%) (p < 0,01) (Fig. 2). Analizamos la relación entre
la traslocación de un organismo específico y la presencia
de SBI de ese mismo microorganismo (Tabla III). La
traslocación de una bacteria específica estuvo casi siempre asociada al SBI de la misma. Esto ocurrió en todos
los casos de TB menos en uno (1 caso de traslocación de
Enterococus sin sobrecrecimiento de este en ciego, aunque sí presente en cultivo). Por el contrario, el sobrecrecimiento de un organismo específico en ciego no siempre
estuvo asociado a la traslocación de este. Cada organismo
presentó un rango diferente de traslocación: E. coli 56%,
Enterococus 50%, Pseudomonas sp. 50%, Proteus sp.
27%, Enterobacter sp. 20%; un animal presentó sobre-
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PAPEL DEL SOBRECRECIMIENTO BACTERIANO INTESTINAL Y DE LA MOTILIDAD
INTESTINAL EN LA TRASLOCACIÓN BACTERIANA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE CIRROSIS
Tabla III. Presencia de traslocación bacteriana de organismos
específicos en ratas cirróticas con o sin sobrecrecimiento
bacteriano intestinal
Total
SBI (-)
1/9
SBI (+)
14/18
E. coli
Enterococci
Enterobacter sp.
Pseudomonas sp.
Proteus sp.
Klebsiella sp.
Aerogenes sp.
0/9
1/21
0/12
0/25
0/12
0/26
0/26
10/18
3/6
3/15
1/2
4/15
0/1
1/1
crecimiento intestinal y traslocación a GLM de Aerogenes sp. (Tabla III).
Con respeto al estudio del tránsito intestinal, los animales cirróticos presentaron un tránsito intestinal más
lento (60,5 ± 12,7 cm) que el observado en los animales
control (81,2 ± 5,7 cm) (p < 0,05) (Fig. 3). No fue posible
establecer una relación significativa entre la existencia de
un tránsito intestinal prolongado y el desarrollo de traslocación bacteriana.
DISCUSIÓN
La traslocación bacteriana intestinal se ha postulado
como el principal mecanismo patogénico en los casos de
infecciones debidas a bacterias gram-negativas entéricas
(1,27). Dado que este tipo de infecciones son muy frecuentes en la cirrosis hepática, se piensa ue la TB también juega un papel muy importante en esta situación,
concretamente favoreciendo la aparición de bacteriemias
y de peritonitis bacteriana espontánea (28-32).
Nuestro estudio confirma la alta prevalencia de TB, al
menos en la cirrosis experimental, incluso en las primeras
fases de la enfermedad, en las que no ha aparecido todavía ascitis. En estudios previos el desarrollo de la TB se
ha relacionado fundamentalmente con la aprición de ascitis e incluso en el trabajo de García-Tsao sólo los animales cirróticos con ascitis presentaron TB (4-6). Nuestros
datos sugieren que la acitis no es imprescindible para la
aparición de TB y que deben existir otros factores que
promueven su aparición diferentes de la misma. Entre los
factores que han sido implicados en la existencia de una
mayor predisposición a la aparición de TB se encuentran
las disfunciones o anormalidades en la barrera mucosa
intestinal, la malnutrición, la presencia de alteraciones inmunológicas y el sobrecrecimiento bacteriano intestinal,
todas ellas descritas en casos de cirrosis hepática (4,3339).
En nuestro modelo las ratas cirróticas tuvieron una
población bacteriana cecal significativamente mayor
que los animales controles, fundamentalmente a expensas de un incremento en la flora gram-negativa (E. coli
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y Proteus). Este aumento en la población bacteriana
condujo a la aparición de sobrecrecimeinto en el 67% de
los animales cirróticos, hallazgos que confirman los
descritos por otros autores (39,40). Hay que señalar que
son precisamente estas bacterias gram-negativas las que
se han asociado con mayor frecuencia con el fenómeno
de traslocación (7,10,30,39). De hecho, en nuestro estudio hemos observado que la población bacteriana intestinal de los animales cirróticos era mayor en los que
presentaban TB que en los que no. Igualmente, las ratas
cirróticas con criterios de SBI tuvieron una mayor prevalencia de TB que las ratas sin sobrecrecimiento. Esta
relación entre el SBI y la existencia de TB y la aparición
de complicaciones infecciosas, ha sido valorada previamente tanto a nivel experimental como en estudios en
humanos. En animales cirróticos y también en los no cirróticos se ha observado que la existencia de SBI se correlaciona con la aparición de TB y en casos de cirrosis
con el desarrollo de PBE (6,7,41). Nuestros resultados
confirman el probable papel del sobrecrecimiento bacteriano como factor promotor de la traslocación, en la cirrosis hepática y posiblemente favoreciendo la aparición
de PBE. De hecho, nuestro mismo grupo ha observado
que en pacientes cirróticos la existencia de SBI se relaciona con una mayor prevalencia de PBE durante la
hospitalización, con respecto a los pacientes cirróticos
sin sobrecrecimiento (13). Por tanto, todos estos datos
sugieren que en la cirrosis hepática el SBI es un factor
promotor de la TB y posteriormente del desarrollo de
complicaciones infecciosas como la PBE.
Un dato interesante de nuestro estudio es que si bien la
traslocación de un germen específico se asocia a su sobrecrecimiento a nivel cecal, no todos los animales con
sobrecrecimiento presentaron traslocación. Este dato sugiere que el sobrecrecimiento intestinal de cada bacteria
es un factor necesario pero no suficiente, para su traslocación y que por tanto existen otros factores involucrados
en la misma. Uno de estos factores probablemente está en
relación con la propia virulencia del germen. Se sabe que
existen bacterias que tienen una mayor facilidad y predisposición para traslocar, debido a diferencias en su capacidad de penetrar el epitelio intestinal (42-44). En nuestro
trabajo hemos observado que los organismos que traslocaron con más frecuencia fueron E. coli y Enterococci,
resultados que están en consonancia con lo descrito en la
literatura.
Es conocido que la flora intestinal esta controlada por
diferentes mecanismos fisiológicos como la motilidad
gastrointestinal, el ácido gástrico y las interacciones bacterianas (36,42,45-47) que tratan de impedir su sobrecrecimiento. En la cirrosis hepática se ha descrito que varios
de estos mecanismos pueden estar alterados y así se ha
observado por ejemplo la existencia de hipoclorhidria (15)
y enlentecimiento del tránsito intestinal (47-51). Esta hipomotilidad a su vez se ha puesto en relación con el desarrollo de SBI en pacientes con hepatopatías (23,51) y se
ha asociado a una mayor incidencia de PBE (24). La pro-
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E. SÁNCHEZ ET AL.
bable implicación de este trastorno de la motilidad intestinal en la patogenia del SBI y la traslocación bacteriana
está avalada por los hallazgos de diferentes estudios en
los que se ha observado que la administración de fármacos procinéticos provoca una disminución en ambos fenómenos (52-54). En nuestro estudio hemos observado
también un tránsito intestinal más lento en los animales
cirróticos que en los controles, aunque no hemos podido
establecer una correlación significativa con la traslocación bacteriana. Probablemente una de las causas de esta
falta de correlación se deba al método indirecto utilizado
para medir el tiempo de tránsito intestinal, que no permite una valoración detallada del mismo, comparado con
REV ESP ENFERM DIG (Madrid)
métodos mucho más exactos y sensibles utilizados en
otros estudios (55,56).
Todos estos datos sugieren que en la cirrosis hepática
el sobrecrecimiento bacteriano intestinal aparece de forma frecuente y precoz, incluso antes del desarrollo de
ascitis y que es un factor promotor de la traslocación
bacteriana. Además, para que un determinado germen
trasloque, su sobrecrecimiento es una condición necesaria aunque no suficiente. Por último, la cirrosis se asocia
con frecuencia a un tránsito intestinal enlentecido, lo
que probablemente es un factor favorecedor de la aparición del sobrecrecimiento bacteriano intestinal y por
tanto de traslocación.
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