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DESARROLLO DE TÉCNICAS
MOLECULARES PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
ACÉTICAS
José M. Guillamón
Departamento de Bioquimica i Biotecnologia
Facultat d’Enologia de Tarragona
Universitat Rovira i Virgili
[email protected]
Rovira i Virgili University
BACTERIA ACÉTICAS. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS
• Bacilos Gram negativos moviles
• Catalasa Positivos
• Metabolismo estrictamente aeróbio
• Capacidad para crecer en medio ácido
• Capacidad para oxidar una gran cantidad de sustratos
• Aplicaciones industriales: vinagre, Ácido glucónico,
sorbosa, celulosa, etc.
1
Taxonomía
de las bacterias
acéticas
Taxonomía de las bacterias acéticas
• Persoon (1822)
Mycoderma
• Pasteur (1868)
Mycoderma aceti
• Beijerinck (1900)
Acetobacter
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Taxonomía de las bacterias acéticas
• Gluconobacter
G. oxydans
• Acetobacter:
A. aceti
A. pasteurianus
A. hansenii
A. liquefaciens
Taxonomía de las bacterias acéticas
Reordenación por pruebas moleculares (año 2003)
6 Géneros y 34 especies:
• Acetobacter (14 especies)
• Gluconobacter (3 especies)
• Gluconoacetobacter (11 especies)
• Acidomonas (1 especie)
• Asaia (4 especies)
• Kozakia (1 especie)
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Taxonomía de las bacterias acéticas
Especies aisladas en vinagres
Acetobacter
Gluconoacetobacter
A. aceti
Ga. hansenii
A. pasteurianus
Ga. europaeus
Ga. xylinus
Ga. oboediens
Ga. intermedius
Ga. entanii
Aislamiento
y
Recuento
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AISLAMIENTO Y RECUENTO DE ACÉTICAS
Toma de muestra
Uva, vino o vinagre
Recuento en placa
Dilución decimal o
Centrifugación (10.000 rpm/10 min)
Disolución del CaCO3
Medio de cultivo GYC
• Glucosa 5%
• Extracto de levadura 1%
• Pimaricina (100mg/l)
• Penicilina (3U/ml)
• Carbonato Cálcico (0.5%)
Incubar 48 horas/ 28ºC
Tinción Gram y prueba de la catalasa
Otros medios de aislamiento
Medio RAE (Sokollek et al., 1998)
Medio Manitol
Glucosa
D-Manitol
40 g
25 g
Extracto levadura 10 g
Extracto levadura
5g
Peptona
Peptona
3g
10 g
Fosfato sódico
3,38 g
Ácido cítrico
1,5 g
Etanol
20 ml
Ácido acético
10 ml
Agar
10 g
Agua
Agar
Agua
15 g
1 Litro
1 Litro
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Técnicas de identificación
y recuento independientes
del cultivo
Identificación de especies de bacterias acéticas mediante
análisis de restricción del gen ribosomal 16S
1) Amplificación mediante PCR del gen ribosomal 16S
16S
ITS
23S
ITS
5S
2) Digestión del fragmento amplificado con diferentes enzimas de
restricción
3) Separación de los fragmentos en base a su tamaño en un gel de
agarosa
6
Técnicas moleculares de identificación
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Permite amplificar una región del genoma bacteriano
millones de veces
Reacción de PCR:
• DNA molde
• Oligonucleótidos (20-24 nt) complementarios
a los extremos del fragmento a amplificar
• Nucleótidos
• Polimerasa
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Técnicas moleculares de identificación
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Técnicas moleculares de identificación
El análisis de restricción o RFLPs
Enzimas de restricción
EcoRI
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Análisis de restricción del rDNA 16S
1. Amplificación del rDNA 16S mediante la PCR
Se obtuvieron amplificados de todas las cepas de referencia
de un tamaño aproximado de 1450 pb
Productos de PCR
∼ 1450 bp
Productos de PCR
∼ 1450 bp
Análisis de restricción del rDNA 16S
2. Digestión del fragmento amplificado mediante
diferentes enzimas de restricción (hasta 8 enzimas)
Patrones de restricción obtenidos con TaqI
Ga.liquefaciens
A. pasteurianus
Ga.G.oxydans
hansenii A. aceti
Ga. Xylinus
Ga. europaeus
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Tamaños de los fragmentos de restricción
Cepa
Enzima de restricción TaqI
Enzima de restricción RsaI
G. oxydans 1408
350+190+175+160+120+120+110
400+400+400+150+90
G. oxydans 360
350+190+175+160+120+120+110
400+400+400+150+90
G. oxydans 1484
350+190+175+160+120+120+110
400+400+400+150+90
G. oxydans 1414
350+190+175+160+120+120+110
400+400+400+150+90
A. aceti 1261
850+350+210
500+400+300+150+125
A. aceti 298
850+350+210
500+400+300+150+125
A. aceti 1505
850+350+210
500+400+300+150+125
A. aceti 1372
850+350+210
500+400+300+150+125
A. pasteurianus 1262
500+350+330+210
500+400+300+150+125
A. pasteurianus 1553
500+350+330+210
500+400+300+150+125
Ga. hansenii 1527
650+350+210+175
500+400+400+150
Ga. liquefaciens 1381
500+350+210+175+160
500+400+400+150
Ga. liquefaciens 1347
500+350+210+175+160
500+400+400+150
Ga. xylinus 1515
500+350+210+175+160
500+400+400+150
Ga. xylinus 1518
500+350+210+175+160
500+400+400+150
Ga. europaeus 6160
500+350+210+175+160
500+400+400+150
ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓN VÍNICA
Diversidad de especies de bacterias acéticas
100%
80%
Ga. liquefaciens
Ga. hansenii
A. pasteurianus
A. aceti
G. oxydans
60%
40%
20%
nt .
F.F. Esp
o
F.F. Inoc
.
M.F. Esp
ont.
M.F. Ino
c-
Mosto
0%
10
ESTUDIO ECOLÓGICO DE UNA FERMENTACIÓN
MALOLÁCTICA
% especies de acéticas
Diversidad de especies de acéticas durante la FML
100%
80%
Ga. liquefaciens
Ga. hansenii
G. oxydans
A. aceti
60%
40%
20%
0%
0
12
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Día de Fermentación Malolactica
Tipificación de cepas de bacterias acéticas
mediante la técnica ERIC-PCR
⊇ En bacterias se han descrito secuencias repetitivas en el genoma:
• Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)
⊇ Ya existen oligonucleotidos diseñados para la amplificación por PCR
de las secuencias comprendidas entre estos elementos repetitivos
ERICs
LMG 1390
LMG 1484
LMG1282
LMG 1408
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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
• No es necesario el cultivo previo
• Cuantifica poblaciones de bacterias mediante
cuantificación del ADN bacteriano de la muestra
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Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
Recuento de poblaciones de bacterias acéticas
mediante la PCR cuantitativa
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Perspectivas de futuro:
• Cuantificar las distintas especies mediante la PCR
cuantitativa en vinagre
• Identificar mediante distintas técnicas independientes
del cultivo la diversidad de especies y de cepas
• Seleccionar cultivos iniciadores para acetificación
(cepas seleccionadas)
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