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Cinética de Reacciones
Catalizadas por Enzimas
Las enzimas son biomoleculas que se comportan como
catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones
químicas en los sistemas biológicos.
Una enzima es una proteína con una bien definida estructura
primaria y secundaria.
La estructura primaria está determinada por la secuencia de
los aminoácidos, en tanto que la estructura secundaria tiene que
ver con el arreglo en el espacio, el cual depende en gran manera
de los puentes de hidrógeno.
Éstas biomoléculas son estables y funcionan en condiciones
muy suaves, ambiente acuoso, bajas temperaturas y en muchas
ocasiones pH neutro.
La catálisis enzimática es esencial para los organismos vivos,
ya que hace posible que en condiciones fisiológicas tengan
lugar reacciones químicas, las que en ausencia de catalizador
requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
La actividad catalítica
depende de la integridad de
su conformación proteica
nativa.
Si se desnaturaliza o
disocia en subunidades
pierde su actividad
En 1890s, Emil Fischer propuso un modelo de llave
cerradura para explicar la especificidad de las enzimas.
Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan
reacciones de sustratos en una configuración, pero no en otra.
Una enzima puede contener uno o más sitios activos. El sitio
activo consiste solamente de unos cuantos residuos de
aminoácidos y el resto de la proteína se requiere para mantener su
integridad tridimensional.
Carboxipeptidasa A en la hidrólisis de uniones peptídicas
Grafica de la velocidad de una reacción catalizada
por enzima vs. concentración de sustrato
v0 =
a[ S ]
b + [S ]
Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.
Cinética de Michaelis-Menten
k1
k2
E + S ⇄ ES → P + E
E = enzima
S = sustrato,
ES = complejo enzima
sustrato
k-1
Para derivar una expresión de velocidad. Michaelis and Menten
inicialmente asumieron que el paso lento es la formación de P a
partir del complejo enzima-sustrato, ES. La formación de ES, se
considerada como un proceso de equilibrio rápido.
 d [ P] 
v0 = 
 = k 2 [ ES ]
 dt  0
Cinética de Michaelis-Menten
k1
k2
E + S ⇄ ES → P + E
k-1
Cuando k-1 >> k2
 d [ P] 
v0 = 
 = k 2 [ ES ]
dt

0
La constante de disociación
Ks =
k −1 [ E ][ S ]
=
k1
[ ES ]
A un tiempo corto después del comienzo de la reacción, la concentración
total de enzima [E]0 = [E] + [ES]
Ks
([ E ]0 − [ ES ])[ S ]
=
[ ES ]
⇒
[ ES ] =
[ E ]0 [ S ]
K s + [S ]
Sustituyendo en la expresión de velocidad:
k 2 [ E ]0 [ S ]
 d [ P] 
v0 = 
=

dt
K s + [S ]

0
Cinética de Michaelis- Menten
k 2 [ E ]0 [ S ]
 d [ P] 
v0 = 
=

dt
K s + [S ]
0

Tiene la forma de la
ecuación de la hipérbola
a[ S ]
v0 =
b + [S ]
a = k2[E] 0 y b = Ks
A baja concentración de sustrato, [S] << Ks
k2
 d [ P] 
v0 = 
=
[ E ]0 [ S ]

 dt  0 K s
La velocidad depende de la [S]
Esta ley de velocidad corresponde a la porción lineal de la gráfica de v0 vs. [S]
A alta concentración de sustrato, [S] >> Ks
 d [ P] 
v0 = 
 = k 2 [ E ]0 = Vmax
 dt  0
Bajo estas condiciones, todas las moléculas de enzima están en la forma del
complejo ES. Consecuentemente, la velocidad es de orden cero en [S]
Cinética de Michaelis-Menten
Cuando todas las moléculas de enzima están complejadas con el sustrato,
formando ES, la velocidad alcanza su máximo
v0 = k 2 [ E ]0 = Vmax
Representa la transición de
baja a alta concentración
Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.
Cinética del estado estacionario.
k1
k2
E + S ⇄ ES → P + E
k-1
concentración
En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan pronto como la enzima y el sustrato
se mezclaban, la concentración del complejo ES alcanzaba un valor constante, de
tal manera que la aproximación del estado estacionario podía aplicarse.
tiempo
Cinética del estado estacionario
k1
k2
E + S ⇄ ES → P + E
k-1
d [ ES ]
= k1[ E ][ S ] − k −1[ ES ] − k 2 [ ES ] = 0
dt
[E] = [E]0 - [ES]
[E]0 = [E] + [ES]
[ ES ] =
k1[ E ]0 [ S ]
k1[ S ] + k −1 + k 2
k1k 2 [ E ]0 [ S ]
 d [ P] 
v0 = 
=
k
[
ES
]
=

2
dt
k1[ S ] + k −1 + k 2

0
v0 =
k 2 [ E ]0 [ S ]
(k−1 + k 2 ) / k1 + [ S ]
Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas
k1
k2
E + S ⇄ ES → P
k-1
Estado estacionario:
v0 =
Equilibrio:
v0 =
k 2 [ E ]0 [ S ]
(k−1 + k 2 ) / k1 + [ S ]
v0 =
k 2 [ E ]0 [ S ]
K M + [S ]
KM =
k 2 [ E ]0 [ S ]
K s + [S ]
KM ≠ Ks
k −1
Ks =
k1
k −1 + k 2
k1
Este tratamiento define la velocidad máxima exactamente como el
modelo de Michaelis –Menten, Vmax = k2[E]0
v0 =
Vmax [ S ]
K M + [S ]
Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas
Cuando
la velocidad
inicial es la mitad del
máximo de la velocidad
v0 =
v0
Vmax
V [S ]
= max
2
K M + [S ]
[ S ] + K M = 2[ S ]
KM = [S]
[S]
Vmax y KM pueden determinarse a
partir de la gráfica de v0 vs [S]
Gráfica Linewaver-Burk
Muchas veces resulta complicado localizar el valor de Vmax a altas
concentraciones de sustrato. Lineweaver y Burk, propusieron un
método mas fácil que consiste en hacer una gráfica de 1/v0 vs. 1/[S].
v0 =
Vmax [ S ]
K M + [S ]
1
KM
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
1
v0
m=
1
−
KM
KM
Vmax
1
Vmax
1
[S ]
Gráfica Eadie-Hofstee
Eadie-Hofstee propusieron otro método para graficar los datos
cinéticos, éste método consiste en multiplicar ambos lados de la
ecuación del recíproco por v0Vmax
1
KM
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
Vmax
vK
= 0 M + v0
[S ]
v0
Vmax
m = −KM
Vmax
KM
Rearreglando:
v0 = Vmax −
v0 K M
[S ]
v0
[S ]
Significado de KM
KM Es un parámetro de afinidad con el sustrato. Mientras
mayor sea KM la unión es más débil.
Representa la concentración de sustrato a la cual la mitad de los
sitios activos de la enzima están ocupados por moléculas de
sustrato.
El valor de KM varía considerablemente de una enzima a otra.
KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH,
fuerza iónica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema
enzima-sustrato en particular.
Para la mayoría de las enzimas, KM está entre 10-1 M y 10-7 M
Significado de Vmax y k2
Como su nombre lo indica, Vmax representa la máxima
velocidad que puede alcanzarse.
De acuerdo con la ecuación, Vmax = k2[E]0, si se conoce la
concentración de enzima, se puede determinar también la
constante k2.
k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de
tiempo-1. En cinética enzimática k2 se conoce también como
número de recambio de la enzima ó constante catalítica, kcat.
El número de recambio de una enzima se define como el
número máximo de moléculas (o moles) de sustrato que se
converten a producto por unidad de tiempo. La mayoría de las
enzimas tienen números de recambio entre 1 y 105 s-1 en
condiciones fisiológicas.
Anhídrasa
Carbónica
CO2 + H2O
HCO3– + H+
A 25 oC la anhídrasa carbónica tiene uno de los números de
recambio mas altos que se conocen, k2 = 1×106 s-1.
Esto indica que una solución 1×10-6 M de enzima puede
catalizar la formación de 1 M de HCO3‒ a partir de CO2
(producido por metabolismo) y H2O por segundo.
Vmax = k2[E]0
Vmax = (1×106 s-1)(1×10-6 M) = 1 M s-1
En ausencia de la enzima, la constante de pseudo-primer orden
es 0.03 s-1
Ejercicio:
De Voe y Kistiakowsky (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 274) estudiaron la
cinética de hidratación de CO2 catalizada por la enzima anhidrasa carbónica
Anhídrasa
Carbónica
CO2 + H2O
HCO3– + H+
En esta reacción, el CO2 se convierte en ión bicarbonato. El bicarbonato es
transportado por el flujo sanguíneo y se vuelve a convertir en CO2 en los
pulmones, ésta reacción también está catalizada por la anhidrasa carbonica.
Cuando la concentración de enzima es 2.3 nM y T = 0.5 oC se midieron las
siguientes velocidades iniciales.
Velocidad (M s-1)
[CO2] / mM
2.78 × 10-5
1.25
10-5
2.5
8.33 × 10-5
5.0
1.67 × 10-4
20.0
5.00 ×
Determina KM y k2 para la enzima a esta
temperatura
Respuesta:
1
v0
1
KM
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
1
Vmax
= 4000 M −1 s
m=
Vmax = 2.5 × 10-4 M s-1
KM
= 40 s
Vmax
(
)
K M = (40 s )Vmax = (40 s ) 2.5 × 10 −4 M s −1 = 10 mM
1
[S ]
Vmax = k2[E]0
Vmax 2.5 ×10 −4 M s −1
5 −1
k2 =
=
=
1
.
1
×
10
s
−9
[ E ]0
2.3 ×10 M
Inhibición de las enzimas
La inhibición de algunas enzimas por metabolitos específicos
constituye un elemento importante en la regulación del
metabolismo intermediario.
Los tres tipos principales de inhibición reversible de las
enzimas son:
Competitiva.
Acompetitiva
No competitiva
Los tres tipos de inhibición se pueden distinguir
experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en
la cinética de reacción.
Inhibición Competitiva.
Tanto el sustrato, S, como el inhibidor, I, compiten por el mismo
sitio activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con
la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor, EI, análogo al
complejo enzima sustrato.
k1
k2
Mecanismo: E + S ⇄ ES → P
k-1
+
I
⇄
KI
El complejo EI no forma productos
EI
ES
E
EI
Inhibición Competitiva.
k1
k2
E + S ⇄ ES → P
+
k-1
I
⇄
KI
EI
KI =
[ E ][ I ]
[ EI ]
Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la
concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES]
Vmax [ S ]
v0 =
 [I ] 
 + [ S ]
K M 1 +
 KI 
 [I ] 

Excepto que el término KM está modificado por: 1 +
K
I 

ésta ecuación tiene la misma forma que la ec. de Michaelis-Menten v0 =
Vmax [ S ]
K M + [S ]
Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk
Vmax [ S ]
v0 =
 [I ] 
 + [ S ]
K M 1 +
 KI 
1 KM
=
v0 Vmax
[I]
 [I ]  1
1
1 +

+
 K I  [ S ] Vmax
1
v0
[I] = 0
m
intercepto = −
1
KM
 KI 


 K I + [I ] 
1
Vmax
1
[S ]
Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk
K
m= M
Vmax
 [I ] 
1 +

 KI 
m
KM KM [I ]
+
m=
Vmax Vmax K I
KM
m'=
Vmax K I
-KI
KM
Vmax
[I]
⇄
Inhibición Competitiva.
E + S ⇄ ES → P
+
I
EI
Debido a que la interacción del inhibidor con la enzima es
reversible:
Una
disminución en la concentración del inhibidor
desplazará el equilibrio hacia la regeneración de la enzima libre.
Dado que tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el
mismo sitio de unión, un aumento en la concentración de
sustrato, provee una segunda manera de revertir la inhibición
competitiva. Mientras mayor sea la concentración de sustrato
mayor será la cantidad de complejo ES.
Inhibición No Competitiva.
Un inhibidor no competitivo no se une al sitio activo de la enzima.
ES
ESI
E
ESI
EI
Mecanismo:
k1
k2
E + S ⇄ ES → P
k-1
+
+
I
I
⇄
⇄
KI
KI
EI + S ⇄ ESI
EI y ESI no forman productos
Inhibición No Competitiva.
k1
k2
E + S ⇄ ES → P
k-1
+
+
I
I
⇄
⇄
KI
KI
EI + S ⇄ ESI
Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la
concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES] + [ESI]
Vmax
[S ]
 [I ] 
1 +

KI 

v0 =
K M + [S ]
Inhibición No Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk
Vmax
[S ]
 [I ] 

1 +
KI 

v0 =
K M + [S ]
1 KM
=
v0 Vmax
1
v0
1  [I ] 
1 +

intercepto =
Vmax  K I 
−
 [I ]  1
1
1 +

+
 K I  [ S ] Vmax
 [I ] 
1 +

 KI 
[I]
[I] = 0
1
KM
1
[S ]
Inhibición No Competitiva.
Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el
mismo sitio de unión, un incremento en la concentración de
sustrato no puede revertir la unión porque también se
incrementaría el número de complejos que contienen inhibidor
(ESI).
El efecto de un inhibidor no competitivo es reducir la
concentración de complejos ES que pueden dar lugar a producto.
Puesto que Vmax = k2[E]0 y la concentración de enzima total
disminuye debido a la formación de ESI, se espera que un
inhibidor no competitivo disminuya la Vmax.
Inhibición Acompetitiva.
Un inhibidor acompetitivo no se une a la enzima libre, sino al
complejo enzima-sustrato, ES. La unión del sustrato modifica la
estructura de la enzima, de tal manera que la unión del inhibidor es
posible.
E
Mecanismo:
ES
ESI
k1
La adición de más
sustrato no revierte el
efecto inhibitorio
k2
E + S ⇄ ES → P
k-1
+
I
⇄
KI
ESI
ESI no forman producto
Inhibición Acompetitiva.
k1
k2
E + S ⇄ ES → P
k-1
+
I
⇄
KI
ESI
Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la
concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [ES] + [ESI]
Vmax
[S ]
 [I ] 
1 +

KI 

v0 =
KM
+ [S ]
 [I ] 
1 +

 KI 
Inhibición Acompetitiva. Ecuación de Linewaver-Burk
Vmax
[S ]
 [I ] 
1 +

KI 

v0 =
KM
+ [S ]
 [I ] 
1 +

 KI 
1 KM 1
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
1  [I ] 
1 +

intercepto =
Vmax  K I 
 [I ] 
1 +

 KI 
1
v0
[I]
[I] = 0
m=
−
1
KM
KM
Vmax
1
[S ]
Sin inhibición
1
KM
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
Tipo de Inhibidor
Efecto en la gráfica
Linewaver-Burk
Inhibición competitiva
1 KM
=
v0 Vmax
La pendiente incrementa
cuando [I] ↑ y la
ordenada se mantiene
constante
 [I ]  1
1
1 +

+
 K I  [ S ] Vmax
Inhibición no competitiva
Ambas, la pendiente y la
ordenada incrementan
1 KM  [I ]  1
1  [I ] 
1 +

1 +
 cuando [I] ↑
=
+
v0
Vmax 
K I  [ S ] Vmax 
Inhibición acompetitiva
1 KM 1
1
=
+
v0 Vmax [ S ] Vmax
 [I ] 
1 +

 KI 
KI 
La pendiente se
mantiene constante y la
ordenada incrementa
cuando [I] ↑
Efecto cinético
Vmax no se modifica
y KM incrementa
con [I]
Vmax disminuye
con [I] y KM no se
modifica
Vmax y KM ambas
disminuyen
Ejercicio:
Un químico midió la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima
tanto en ausencia como en presencia de inhibidor A, en un experimento
separado estudio el efecto del inhibidor B. En ambos casos la concentración
del inhibidor fue 8.0 mM
[S]/ M
vo / M s-1
No inhibidor
vo / M s-1
Inhibidor A
vo / M s-1
Inhibidor B
5.0 × 10-4
1.25 × 10-6
5.80 × 10-7
3.80 × 10-7
1.0 × 10-3
2.00 × 10-6
1.04 × 10-6
6.30 × 10-7
2.5 × 10-3
3.13 × 10-6
2.00 × 10-6
1.00 × 10-6
5.0 × 10-3
3.85 × 10-6
2.78 × 10-6
1.25 × 10-6
1.0 × 10-2
4.55 × 10-6
3.57 × 10-6
1.43 × 10-6
a) Determina los valores de KM y Vmax de la enzima. b) Para cada uno de los
inhibidores ( A y B ), determina el tipo de inhibición y calcula el valor de KI
en cada caso.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
La mayoría de las enzimas tienen un pH
característico al cual su actividad es máxima;
por encima o por debajo de ese pH la actividad
disminuye.
El pH óptimo de una enzima no es
necesariamente idéntico al pH de su entorno
intracelular normal, el cual puede hallarse a su
vez en la pendiente ascendente o descendente
de la curva. Por eso la relación pH-actividad de
una enzima puede constituir un factor en el
control intracelular de su actividad.
Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas
Al igual que sucede con la mayoría de las reacciones químicas, las
reacciones enzimáticas incrementan su velocidad con la temperatura.
La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica,
aproximadamente por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.
El pico de la gráfica al representar la actividad catalítica respecto a la
temperatura se debe a que las enzimas, al ser proteínas, se
desnaturalizan por acción del calor y se inactivan a partir de cierto
punto.
A partir de los 55-60 ºC la mayor parte de las enzimas se inactivan.
Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas siguen siendo
activas a temperaturas superiores a los 85 ºC.