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Tema 15
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA I
1. Introducción
2. Inhibición reversible
2.1 Inhibición competitiva (inhibición
específica)
2.2 Inhibición no-competitiva
2.3 Inhibición incompetitiva o acompetitiva
2.4. Representación de Dixon
2.5 Inhibición por sustrato
1. Introducción
Desde el principio de la Enzimología se sabia de sustancias que
disminuían la velocidad de la reacción catalizada por los
catalizadores, “envenenando” o dificultando la actuación de
éstos.
Las sustancias que disminuyen la velocidad de reacción, química
o enzimática, se denominan inhibidores.
Los inhibidores se pueden dividir en tres grandes grupos:
- Inhibidores reversibles,
- Inhibidores pseudorreversibles
- Inhibidores irreversibles
INHIBIDORES REVERSIBLES  la unión del
inhibidor a la enzima es débil.
INHIBIDORES PSEUDOIRREVERSIBLES  la unión
del inhibidor a la enzima es fuerte.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES  la unión del
inhibidor a la enzima es prácticamente irreversible,
generalmente covalente (inhibidores suicidas).
2. INHIBICIÓN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles son sustancias que forman
complejos “dinámicos” o reversibles con la enzima (
interacciones de tipo débil) y que presentan propiedades
catalíticas diferentes a las de la enzima libre.
Cumplen las condiciones impuestas al Substrato para la
deducción de la ecuación cinética de M&M:
La concentración inicial de inhibidor
[Io] >> [Eo]
que para resolver la ecuación de velocidad en presencia de
inhibidor,
[EI] o [ESI] es despreciable frente a la de [Io].
Por lo tanto, en todo momento,
[I] = [Io]
Por otra parte, la formación de los complejos EI o ESI es muy
rápida, de forma que se alcanza rápidamente el siguiente
equilibrio:
E + I <=====> EI
y podemos definir la constante de disociación del complejo
EI:
[E] [I]
Ki = -----------[EI]
Donde.
[E] concentración de enzima libre
[I] concentración de inhibidor libre
[EI] concentración del complejo EI
-Así mismo, debemos tener en cuenta:
i) que la actividad de la enzima se afecta por la
presencia del inhibidor
ii) que las velocidades medidas son velocidades
iniciales
iii) que estamos en una situación de estado
estacionario
Consecuentemente, la concentración de las diferentes
especies químicas en que puede encontrarse la enzima: [E],
[ES], [EI] y en su caso [ESI] son constantes respecto del
tiempo,  d[EX]/dt = 0.
Si la enzima, a concentraciones saturante de inhibidor, no
presenta actividad catalítica alguna (v = 0) se dice que la
inhibición es completa o total.
Sin embargo, frecuentemente nos referimos a este tipo de
inhibición como inhibición lineal, ya que la representación de
Kmap/Vmaxap o de 1/Vmaxap frente a [I] nos da una linea recta.
Con menor frecuencia está el caso en que el complejo EI sí
presenta cierta actividad catalítica residual (v  0) a
concentraciones saturantes de inhibidor.
Este tipo de inhibición se conoce como inhibición parcial, o
inhibición hiperbólica, ya que la curva resultante al representar
Kmap/Vmaxap o 1/Vmaxap frente a la [I], nos da una curva
hiperbólica.
* Ambos tipos de inhibición, lineal e hiperbólica, pueden a su vez
subclasificarse de acuerdo con los parámetros cinéticos
aparentes de Michaelis-Menten que se vean afectados, si bien,
en lo que sigue, nos referiremos principalmente a la inhibición
lineal.
* La inhibición por inhibidores reversibles lineales,
tradicionalmente, y de acuerdo con el mecanismo de reacción,
se suele clasificar en tres grupos:
- Inhibición competitiva --> Inhibidores competitivos
- Inhibición no-competitiva --> Inhibidores no-competitivos
- Inhibición acompetitiva --> Inhibidores acompetitivos
2.1. Inhibición competitiva
En la inhibición competitiva o inhibición específica, el
inhibidor compite con el sustrato por el mismo centro activo
de la enzima.
La molécula del inhibidor es, generalmente, en todo o en parte,
un isóstero del sustrato, excluyendose mutuamente del centro
activo de la enzima.
Isóstero --> Moléculas que tienen formas y tamaños similares
Km
kcat
I
<=====>
E + S <====> ES ----------> E + P
Kic
EI -------->
- Así pues, la enzima total, Eo, puede estar como enzima libre, E,
unida al sustrato formando el complejo-ES, ES o como enzima
unida al inhibidor formando el complejo-EI, (EI).
Pero solamente el complejo ES puede dar producto.
- Y de acuerdo con la ecuación de conservación de masas
podemos escribir:
[Eo] = [E] + [ES] + [EI]
Vic = kcat [ES]
Velocidad inicial en presencia de inhibidor competitivo
El valor de la [ES] lo podemos obtener a partir de la cte de
Michaelis:
[E] [S]
Km = -----------[ES]
[E] [S]
[ES] = ----------Km
Y análogamente, el valor de la [EI] lo podemos obtener a partir de
la definición de la constante de disociación del complejo EI:
Kic
[E] [I]
Kic = -----------[EI]
[E] [I]
[EI] = -----------Kic
Sustituyendo estos valores en la ec. de balance de masas,
tenemos:
Eo = E + ES + EI
[E] [S]
[E] [I]
[Eo] = [E] + ------------ + -----------Km
Kic
E  Eo
Valor de la Enzima libre
1
[E] [S]
[ES] = ----------Km
Vic=Kcat [ES]
vic  kcatEo
1
I
S

Ki Km
S
ES  Eo
I
S Km
1

Ki Km
S
S
 V max
I
S Km
IKm
1

Km 
S
Ki Km
Ki
vic  V max
1
S
I 

Km1    S
 Ki 
Ecuación representa el comportamiento cinético de un inhibidor
competitivo puro
1
Así pues, la velocidad de reacción inicial, en presencia de
inhibidor competitivo vendrá dada por la ecuación:
[S]
vic = Vmax ----------------[S] + Kmap
- Ecuación semejante a la ec. de M&M, pero donde el valor de
Kmap depende de la concentración del inhibidor (I) y de la cte de
inhibición Kic.
I 

Kmap  Km1 

 Kic 
* En este tipo de inhibición reversible, los valores de las ctes de
inhibición, Kic, suelen ser del mismo orden que las Km. Oscilando
entre 10-3 y 10-6 M.
- Algunos inhibidores de este tipo suelen tener aplicaciones
medico-farmacéuticas.
¿Cuáles serán los mejores?
 aquellos que tengan un valor de Ki pequeño
* En estos casos, además de interesante, es necesario
determinar el valor IC50 o concentración de inhibidor que en unas
condiciones dadas produce una inhibición del 50%.
Cálculo del grado de inhibición, ei:
Grado de inhibición es un valor entre 0-1
Razón entre la velocidad en presencia de I y en ausencia.
a
I
ei 
S 

I  Kic 1 

Km 

Vic
a
V
e ic  1  a
Tarea
Calcúlalo
- El análisis de la ec. anterior nos indica que el valor del grado
de inhibición, ei, depende:
i) de la concentración de inhibidor, [I];
ii) del valor de la Kic;
iii) de la concentración de sustrato, [S]
iv) de la constante de Michaelis, Km
- A concentraciones altas de sustrato, [S], el valor de inhibición
puede ser no significativo.
- Cuando ei = 0,5, es decir cuando hay una inhibición del 50% , el
valor de IC50 viene dado por la ec. que hemos indicado
anteriormente.
Así pues, el valor IC50 para una inhibición competitiva no puede
considerarse como un valor característico del inhibidor, ya que
depende de la concentración actual de sustrato, [S] y de la Km
de la enzima para dicho sustrato.
Pero realmente lo que es útil es calcular la concentración de
inhibidor, [I], que causa un determinado grado de inhibición.
P Calculemos la concentración de un inhibidor competitivo que
causa una inhibición del 60% de la enzima E; sabiendo que la [S]
= 2 10-3 M, Km = 10-3 M y que la Kic = 5 10-3 M
Determinación gráfica de los parámetros cinéticos
en una inhibición competitiva
Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuación
de Michaelis-Menten; por ejemplo:
* 1/vic vs 1/[S] --> Representación de Linenweaver-Burk
* vic vs vic/[S] --> Representación de Eadie-Hoftee
* [S]/vic vs [S] --> Representación de Hanes
* vic vs [S] --> Representación directa o de EisenthalCornish
1/v
[I] > 0
[I] = 0
Representación de
Linenweaver-Burk
- 1/Km
1/Vmax
-1/Kmap
1/[S]
v
Representación de EadieHoftee
Vmax
a
m = tga´ = -Kmap
m = tga = -Km
a´
Vmax/Km
[I] > 0
v/[S]
Vmax/Kmap
Representación
de Hanes
[S]/v
[I] > 0
I=0
a
m = tga = 1/Vmax
- Km
Kmap/Vmax
Km/Vmax
-Kmap
[S]
Representación directa o de Eisenthal-Cornish
Vmax
v0
I=0
[I] > 0
-S1
-S2
Km
Kmap S0
2.2. Inhibición no-competitiva
En una inhibición no-competitiva el inhibidor se une a la enzima
en un centro de unión diferente al centro activo de la enzima.
Consecuentemente, las especies químicas en las que puede
encontrarse la enzima serán:
- la enzima libre, E,
- la enzima unida al sustrato, ES (complejo-ES)
- la enzima unida al inhibidor, EI (complejo-EI)
- la enzima unida al sustrato y al inhibidor, ESI o EIS
(complejo- ESI o EIS)
En el caso de la inhibición no-competitiva pura suponemos que
tanto la enzima libre, E, como el complejo-ES pueden unirse al
inhibidor, y que la constante de disociación, Ki, es igual en ambos
casos.
E y EI unen al sustrato sin que afecten a las constantes
de disociación (Km)
- En este caso, también, sólo el complejo-ES evoluciona dando
producto
Los inhibidores no-competitivos,
generalmente no presentan
relación estructural con el sustrato,
y se unen a la enzima en un sitio
distinto del centro activo.
Cuando [S] 
 no desaparece la inhibición.
Km
kcat
I
Ki
Km
<=====>
I
<=====>
E + S <====> ES ----------> E + P
Ki
EI <=====> ESI ---------->
* La deducción de la velocidad de reacción, en este caso, es
análoga a la realizada en el caso de la inhibición competitiva:
vinc = kcat (ES)
[Eo] = [E] + [ES] + [EI]+ [ESI]
[S]
vinc = Vmaxap -------------------[S] + Km
- Así pues, en una inhibición no-competitiva pura, la Km de la
enzima por el sustrato no se modifica, sin embargo, la Vmax sí se
modifica, transformándose en una Vmaxap.
V max ap
V max

I 

1  
 Ki 
* Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una
inhibición no-competitiva
- Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la
ecuación de Michaelis-Menten, por ejemplo:
*1/vinc vs 1/[S] --> Representacion de Linenweaver-Burk
vinc vs vinc/[S] --> Representación de Eadie-Hoffte
vinc vs [S] --> Representación directa o de EisenthalCornish
Representación de Linenweaver-Burk
1/vinc
(I) > 0
(I) = 0
1/Vmaxap
1/Vmax
- (1/Km)
1/S
Representación de Eadie-Hoffte
Vmax/Km
vinc/S
m = -(1/Km)
I=0
Vmaxap
I>0
Vmaxap/Km
Vmax
vinc
Representación directa o de Eisenthal-Cornish
v0
Vmax
(I) = 0
Vmaxap
(I) > 0
-S1
-S2
Km
S0
Cálculo del grado de inhibición, ei:
[I]
ei = ------------------[I] + Ki
Valor de la IC50 característica propia del
inhibidor
No depende de la [S] ni de la Km
Valor IC50 es igual a la Ki
2.3. Inhibición acompetitiva
* El tercer tipo de inhibición reversible es la inhibición
acompetitiva, en la que el inhibidor sólo puede unirse al
complejo-ES, formando un complejo-ESI, que no da producto.
* En este caso como en los dos anteriores, únicamente el complejo-ES da producto de
reacción.
- De acuerdo con el siguiente esquema:
Km
kcat
I
<=====>
E + S <====> ES ----------> E + P
Ki
ESI ---------->
* Al igual que los otros dos casos, en este la velocidad de
reacción viene dada por:
viac = kcat (ES)
[Eo] = [E] + [ES] + [ESI]
Y por tanto su deducción se realizará de manera análoga.
* Así pues, en una inhibición acompetitiva se modifica tanto Vmax como Km, y ambas se ven
afectadas por el mismo factor multiplicativo
viac 
Donde:
Vmax
S
Km

I 
S
1 



I
K
iac

 1 
 K 
iac 

[S]
viac = Vmaxap ---------------Kmap + [S]
Vmap 
Vmax

I 
1 

K iac 

K map 
Km

I 
1 

 K iac 
•Del análisis de la anterior figura así como de la ecuación que nos da viac
podemos observar que tanto la Vmax como la Km están disminuidas por un
mismo factor:
 I 
1  
 Ki 
¿No les parece paradójico que un inhibidor disminuya la Km de
una enzima por el sustrato?
Es decir, ¡que aumente la afinidad de la enzima por el sustrato!
- La respuesta la podríamos tener en el mecanismo de
inhibición
* Al unirse el inhibidor al complejo-ES desplaza el equilibrio y,
aparentemente, por lo tanto, la constante de disociación Kmap
disminuye.
Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una inhibición
acompetitiva
Representacion de Linenweaver-Burk
(I) > 0
1/viac
1/Vmaxap
(I) = 0
Tarea. Realiza
representaciones
gráficas con las
otras
representaciones
1/Vmax
- (1/Kmap)
- (1/Km)
1/S
2.4. Representación de Dixon-Webb
Dixon y Webb propusieron una representación gráfica alternativa de la
ecuación de inhibición competitiva y no-competitiva
Representando 1/vi frente a [I], manteniendo constante la (S).
1/vi
S1
S2 > S1
S2
-Ki
(I)
En el caso de una inhibición competitiva, para dos
concentraciones de sustrato fijas, (S1) y (S2), tendremos:
S1
1
1
Km 1
Km
----- = --------- + ---------- ------ + ---------------------- [I]
vic1 Vmax
Vmax [S1]
Vmax Ki [S1]
S2
1
1
Km 1
Km
----- = ---------- + --------- ------ + ---------------------- [I]
vic2 Vmax
Vmax [S2]
Vmax Ki [S2]
- Estas dos rectas se cortarán en el único punto común que
tienen, el correspondiente a 1/Vmax.
La condición de corte de estas dos rectas es que 1/vic1 = 1/vic2
- Así pues, igualando ambas ecuaciones, simplificando y
reordenando, llegamos a la siguiente ecuación:
1
I  1 
I 
1    1  
S1  Ki  S 2  K i 
- Por definición
1
1

S1 S 2
Luego, la solución a la anterior ecuación será:
- De donde:
I   Ki
I
1
0
Ki
* La representación gráfica de estas dos rectas:
1/vic
S1
S2 > S1
S2
1/Vmax
-Ki
(I)
* En el caso de una inhibición no-competitiva:
S1
1
1
Km
1
----- = --------- (1+[I]/Ki) + -------- ------ (1+[I]/Ki)
vinc1
Vmax
Vmax (S1)
S2
1
1
Km
1
----- = --------- (1+[I]/Ki) + -------- ------ (1+[I]/Ki)
vinc2
Vmax
Vmax (S2)
- Estas dos rectas se cortarán cuando 1/vinc1 = 1/vinc2.
* Operando de manera análoga al caso de la inhibición
competitiva, obtenemos:
1
1

S1 S 2
- Como por definición:
1
I  1 
I 
1    1  
S1  Ki  S 2  K i 
=> 1
+ (I)/Ki = 0
Luego:
(I) = -Ki
-Sustituyendo este valor en la ecuación que define 1/vinc,
obtenemos:
1/vinc1 = 1/vinc2 = 0
- Luego las rectas se cortan en un punto, sobre el eje (I), tal que
(I) = -Ki
1/vinc1
S1
S2 > S1
S2
-Ki
[I]
2.5. Inhibición por exceso de sustrato
* Este es otro tipo de inhibición reversible en el que un exceso de sustrato provoca una
pérdida de actividad de la enzima.
* En este caso, el modelo cinético presupone que una segunda molécula de substrato
puede unirse al complejo-ES dando lugar a la formación del complejo-ES2 que no da
producto:
Km
kcat
<=====>
E + S <====> ES ----------> E + P
S
Ks´
Suponemos que la constante de
disociación del segundo complejo
[ES2] es diferente a la Km
Se denomina Ks´
ES2 ---------->
- La ecuación de velocidad, como siempre, la podemos deducir a
partir de:
v = kcat (ES)
E S 
ES 
E S 
Ks`
ES 2 
Ecuación de conservación de la enzima
Km 
Eo = E + ES + ES2
2
S
ES
Eo  E  E

Km KmKs`
1
S
S2
1

Km KmKs´
[E] [S]
[ES] = ----------Km
v = kcat [ES]
v  kcatEo
E  Eo
1
S
Km
S
S2
1

Km KmKs´
1
S
v  V max
S
S 2 Km
1

Km KmKs´
La representación de v frente a (S) muestra una curva que presenta un máximo:
v
La concentración de sustrato
a la cual se obtiene el
máximo el óptimo de
velocidad
Igualando a cero la
primera derivada
con respecto a la [S]
Vmax
Sop  KmKs´
(S)op
(S)
- La representación de 1/v frente a 1/S es una hipérbola
cuadrática, que tiene un mínimo correspondiente al inverso de
(S)op.
1/v
1/Vmax
-1/Km
1/[S]op
1/[S]
Succinato produce inhibición por substrato de la succinato
deshidrogenasa.
Comenta cual podría ser el mecanismo de inhibición
Un mecanismo de inhibición podría:
Una molécula de sustrato se une a la enzima, después una
segunda molécula del S se une formando un complejo inactivo.
¿qué tipo de inhibición de los que hemos estudiado se ajusta a
la inhibición por sustrato?
E
-OOC
I
CH2
I
CH2
I
-OOC
E
-OOC
I
CH
II
CH
I
-OOC
Sustituyendo [I] por [S]
viac 
Vmax
S
viac 


I 
1 
 

 K iac   K m
 S

I  

 
1


  K iac  
viac 
Vmax
S


S 
1 
 

K
Km
iac  

 S


S 

 1 

K
 

iac 
Vmax S

S 


K m  S 1 
 K iac 
A bajos valores de [S]
M-M
S/Kiac tiende a cero
A altos valores de [S]
viac 
Km se desprecia
Vmax

S 
1 

K iac 

v
Vmax
(S)
RESUMEN
Inhibidores aquellos compuestos disminuyen la actividad de una enzima. Se agrupan en
tres clases: Reversibles, Pseudoirreversibles y suicidas.
Inhibidores reversibles cumplen las condiciones de Michaelis, la [Io] es muy superior a la
[Eo] siendo el complejo enzima-inhibidor [EI] despreciable frente a [I]
Tres tipos de inhibición reversible:
a) Inhibición competitiva el inhibidor compite por el mismo lugar que el substrato. La
velocidad máxima queda inafectada por el inhibidor que aumenta la Kmap al
multiplicarse la Km de la enzima por el factor (1+ I/Ki). El grado de inhibición
depende de las concentraciones de I y S, así como de la Km y Ki.
b) Inhibición no competitva el inhibidor se une a la enzima en un lugar diferente al
de la unión al substrato. La inhibición afecta a la velocidad máxima disminuyendo
su . valor al ser dividida por (1+ I/Ki). El grado de inhibición depende solamente de
la [I] y de la constante Ki.
c) Inhibición acompetitiva el inhibidor se une solamente al complejo EnzimaSubstrato, disminuye la velocidad máxima por el factor (1+ I/Ki) y, paradójicamente,
disminuye la Km por el mismo valor obteniéndose una Kmap menor.
Inhibición por exceso de substrato puede ocurrir. La curva de velocidad en función de
diferentes concentraciones de substrato presenta un máximo. En general se da este tipo
de inhibición cuando el substrato a grandes concentraciones puede reaccionar con la
proteína enzimática en lugar diferente al de la unión enzima substrato
P
Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)
v(mmol L-1 min-1)
[I] = 0
v´(mmol L-1 min-1)
[I] = 2 10-3 M
0,30
0,57
0.36
0,50
0,85
0.55
0,75
1,18
0.75
1,50
1,82
1.33
3,00
2,50
2.22
7,50
3,23
3.13
A partir de estos datos calcular, mediante la representación
adecuada: Vmax, Kmap, Kic y grado de inhibición (ei) para [S] =
0,65 mM. ¿Qué concentración de inhibidor habría que utilizar
para inhibir la enzima un 25% a la misma concentración de
sustrato?