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Caracterización de la enzima lacasa en biocompósitos para la
determinación del índice de polifenoles en vino
Silvia Gómez, Manel Del Valle, Salvador Alegret, María Isabel Pividori*
Grup de Sensors i Biosensors, Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona,
Bellaterra, Spain.
* Tel: +34 93 581 4937, Fax: +34 93 581 2379. E-mail address: [email protected]
Resumen
Los polifenoles son un grupo heterogéneo de moléculas que comparten la característica de poseer
en su estructura varios grupos bencénicos sustituidos con funciones hidroxílicas. Existe un gran
interés en el poder antioxidante de estas moléculas naturales, debido a que tienen efectos positivos
sobre enfermedades degenerativas crónicas, enfermedades vasculares y cáncer. Por otro lado, los
beneficios en la salud que actualmente se le adjudican al vino, se relacionan tanto con su consumo
moderado, como por su contenido en polifenoles, que además le otorgan sus propiedades
organolépticas características. Los compuestos fenólicos del vino incluyen, entre otros, a los ácidos
fenólicos (cumarínico, cinámico, cafeico, gentísico, ferúlico y vanílico) y flavonoides (catequinas,
quercetina) y estilbenos (resveratrol). El presente trabajo se dirige al desarrollo de una nueva
estrategia de determinación de polifenoles basados en biosensores enzimáticos de lacasa, como
alternativa a los métodos analíticos actuales basados en el HPLC o en los métodos colorimétricos,
que requieren instrumentación sofisticada y largos tiempos de análisis. En este trabajo se
desarrollaron biosensores enzimáticos de lacasa de "trametes versicolor", mediante la integración de
esta enzima a la formulación de compósitos de grafito-epoxi, obteniéndose un biocompósito lacasaGEB. En este trabajo se muestran los principales resultados obtenidos en la determinación de
polifenoles en vino usando biosensores enzimáticos basados en un biocompósito lacasa-GEB.
Palabras clave: polifenoles, biosensor electroquímico enzimático, vino, enzima lacasa.
Desde el punto de vista de su estructura
química, los polifenoles son un conjunto de
moléculas heterogéneas que se caracterizan
por su aromaticidad y por contener uno o varios
grupos hidroxilos unidos directamente al anillo
aromático. Además de las formas solubles,
encontradas principalmente en vacuolas, hay
también formas polimerizadas de solubilidad
variable,
tales
como
los
taninos,
o
completamente insolubles como las ligninas.
Los
polifenoles
tienen
características
estructurales que les confieren su potencial
antioxidante: la presencia de sustituyentes
donadores de hidrógeno y la posibilidad de
deslocalización electrónica. Debido a la
deslocalización de los electrones, los radicales
resultantes son lo suficientemente estables
como para no desencadenar reacciones
radicalarias en cadena [2].
Respecto al vino, su composición es
extremadamente compleja ya que en su matriz
se han identificado un gran número de
compuestos polifenólicos. Además de etanol, el
1. Introducción
Los polifenoles son moléculas que tienen una
importante función en las plantas, así como en
los alimentos. En estos, los polifenoles se
utilizan principalmente como colorantes y
también como antioxidantes. Existe un gran
interés en el poder antioxidante de estas
moléculas naturales, debido a que se cree que
tienen efectos positivos sobre enfermedades
degenerativas
crónicas,
enfermedades
vasculares y el cáncer [1]. Los polifenoles se
usan en la industria alimentaria para
incrementar el tiempo de conservación, que
puede limitarse debido a la oxidación de las
grasas. Este fenómeno de oxidación de las
grasas no sólo es indeseable a nivel
organoléptico del alimento, por la aparición del
sabor/olor a rancio, sino también debido a que
puede tener implicaciones en la salud humana,
ya que la exposición a radicales libres aumenta
el riesgo de padecer las enfermedades crónicas
antes mencionadas.
419
vino, en especial el vino tinto, contiene un alto
número de compuestos tales como ácidos
fenólicos (cumarínico, cinámico, cafeico,
gentísico, ferúlico y vanílico), trihidroxi
estilbenos
(resveratrol
y
polidatina),
y
flavonoides
(antocianinas,
catequina,
epicatequina,
miricetina,
kaempferol,
y
quercetina). De entre todos los compuestos, los
polifenoles de la uva se encuentran en la piel,
especialmente en las células epidérmicas, y en
las pepas, siendo su concentración más baja en
la pulpa.
Actualmente, se dispone de varios métodos
para el análisis de compuestos polifenólicos.
Entre ellos cabe destacar la cromatografçía
líquida o los métodos colorimétricos (métodos
de Folin-Ciocalteau, vainillina-HCl y n-butanolHCl). Las desventajas de estos métodos es el
largo tiempo de análisis o su alto coste.
En el presente trabajo se plantea el diseño de
un
biosensor
enzimático
basado
en
biocompósitos rígidos para la determinación del
índice polifenólico en matrices alimentarias, y se
demuestra su utilidad en vinos. Para tal fin, se
escogió como enzima la lacasa (EC 1.10.3.2),
glicoproteína producida por algunos hongos y
bacterias y capaz, mediante sus centros de
cobre, de catalizar la oxidación de diversos
compuestos fenólicos [3]. Sus propiedades
catalíticas la cualifican para oxidar compuestos
fenólicos de forma natural usando como aceptor
natural el O2 (Figura 1), mientras que mediante
mediadores redox pueden oxidar también
compuestos no fenólicos, en presencia de O2 y
H2O de forma simultánea.
electroquímica de los transductores realizada
por voltamperometría cíclica se llevó a cabo con
un sistema electroquímico de CH Instruments.
El sistema de tres electrodos usado fue, en
todos los casos, el electrodo de trabajo o
indicador (electrodo de compósito de grafitoepoxy (GEC) y electrodos de biocómposito de
grafito-epoxy modificados con enzima lacasa
(lacasa-GEB)), el electrodo de referencia
ORION de Ag/AgCl/KCl (3M) de doble unión y el
electrodo auxiliar de platino CRISON 52 67 1.
2.2 Reactivos
Para la preparación de los electrodos
enzimáticos se ha utilizado: Grafito en polvo de
tamaño de la partícula < 20 μm (Merck,
Alemania) y Resina epoxi EPO-TEK H77 (Epoxy
Technology, USA). Enzima lacasa de trametes
versicolor (Fluka) > 20 unidades/mg.
Los reactivos usados para la preparación de las
soluciones han sido de calidad proanálisis o
similar.
Como sustratos se ha empleado soluciones 1
mM en agua bidestilada de: ácido gálico, ácido
cafeico, trans-resveratrol, catequina hidratada.
La solución reguladora ABS a pH 3,5 fue
preparada con acetato potásico 0,1 M y cloruro
sódico 0,1 M. La solución reguladora CBS a pH
5,0 fue preparada en concentraciones de citrato
sódico tribásico dihidratado 0,1 M y cloruro
sódico 0,1 M.
2.3 Construction of the magneto graphiteepoxy composite (m-GEC)
La preparación de los electrodo ha sido descrita
previamente de forma detallada [4, 5]. Para
conseguir los transductores electroquímicos
modificados con la enzima lacasa o
biocompósitos, (lacasa-GEB o bioscompósitos
de lacasa grafito epoxi), se añade el porcentaje
de
GEC
y
lacasa
respectivamente,
consiguiendo así las siguientes proporciones
98:2 (lacasa 2% -GEB), 90:10 (lacasa 10% GEB), 85:15 (lacasa 15% -GEB) y 80:20 (lacasa
20%-GEB).
Una vez homogeneizadas todas las mezclas,
introducidas y compactadas en el cuerpo del
transductor, se deja endurecer el compósito o
biocómposito en estufa a 40º C para no
desnaturalizar la enzima, durante 7 días hasta
obtener un material rígido. Una vez endurecido
el transductor se realizó un pulido de la
superficie utilizando un papel de lija de diferente
rugosidad (400, 800 y 1200) hasta utilizar
finalmente papel de alúmina de 3 μm (948201
Polishing strips, ORION). Este proceso se llevó
Fig. 1. Representación esquemática del ciclo catalítico de la
enzima lacasa frente a sustratos polifenólicos.
En este trabajo, los biosensores enzimáticos
basados en biocompósitos de la enzima lacasa
son caracterizados electroquímicamente y
estudiados frente a distintos sustratos
polifenólicos.
2. Experimental
2.1 Instrumentación
Todas las medidas amperométricas se
realizaron con una unidad amperométrica LC
4C de la casa comercial BAS (Bioanalytical
Systems Inc., USA). La caracterización
420
a cabo antes de cada determinación
amperométrica o voltamperométrica.
electroquímicas de las reacciones catalizadas
respecto a cuando no lo están.
2.4 Caracterización electroquímica de los
biosensores de lacasa
2.6.
Caracterización
de
la
actividad
enzimática de los biosensores lacasa frente
a compuestos polifenólicos en vino
Para llevar a cabo la caracterización de los
biosensores enzimáticos de lacasa se ha
empleado
la
voltamperometría
cíclica.
Inicialmente,
se
llevo
a
cabo
una
voltamperometría
cíclica
sin
especies
electroactivas para caracterizar el porcentaje
óptimo de la enzima en la composición de los
biocompósitos y los estudios del material a
distintas velocidades de barrido en una celda
electroquímica de 20 mL de solución reguladora
ABS, pH 3,5. En estas condiciones, se procedió
a realizar los barridos en sentido anódico hasta
un potencial de 1.0 V a una velocidad de barrido
ν = 100 mV s-1, con los biosensores
enzimáticos de lacasa-GEC de 0, 2, 10, 15 y 20
%. Caracterizaciones posteriores se realizaron
modificando la velocidad de barrido durante la
voltamperometría cíclica.
La
caracterización
de
la
actividad
enzimática de los biosensores de lacasa frente
a compuestos polifenólicos en vino se llevó a
cabo tanto por voltamperometría cíclica como
por amperometría, mediante la adición de vino
tinto y blanco, y utilizando como celda
electrolítica 20 mL de ABS a pH 3,5 o CBS a pH
5,0, siendo el electrodo de trabajo el biosensor
lacasa-GEB.
Para
el
caso
de
la
voltamperometría
cíclica,
realizado
en
condiciones estáticas, se seleccionó como
potencial inicial 0,0 V, yendo en sentido
negativo hasta -0.4 y revirtiendo el sentido del
barrido hasta 1.V. Todas las voltamperometrías
cíclicas se realizaron con una dilución 1/5 del
vino en la celda.
Para el caso de la amperometría, se
polariza el electrodo de trabajo a un potencial
determinado, entre -0,3 V y 0,4 V. Se realizan
adiciones de vino, hasta una dilución final de
1/40 en la celda electroquímica.
Al mismo tiempo, y luego de la selección del
potencial idóneo de trabajo para ABS a pH 3,5 o
CBS a pH 5,0, es de 0,1 V, se realizaron
adiciones crecientes de vino en la misma celda
utilizada con anterioridad para los estudios
amperométricos de las sustancias polifenólicas.
En todos los casos, los experimentos se
llevaron a cabo en sensores controles GEC con
el objeto de comparar las respuestas
electroquímicas de las reacciones catalizadas
respecto a cuando no lo están.
2.5.
Caracterización
de
la
actividad
enzimática de los biosensores lacasa frente
a sustratos polifenólicos
Esta caracterización se llevó a cabo tanto
por voltamperometría cíclica como por
amperometría, mediante la adición de
polifenoles modelos, tales como (ácido cafeico,
catequina, trans-resveratrol y ácido gálico), y
utilizando como celda electrolítica 20 mL de
ABS a pH 3,5 o CBS a pH 5,0, siendo el
electrodo de trabajo el biosensor lacasa-GEB.
Para el caso de la voltamperometría cíclica,
realizado en condiciones estáticas, se
seleccionó como potencial inicial 0,0 V, yendo
en sentido negativo hasta -0.4 y revirtiendo el
sentido
del
barrido
hasta
1,0
V.
voltamperometrías cíclicas se realizaron con 91
μM de sustancias polifenólica en la celda. En
todos los casos,el mismo experimento se llevo a
cabo en sensores controles GEC con el objeto
de comparar las respuestas electroquímicas de
las reacciones catalizadas respecto a cuando
no lo están. Para el caso de la amperometría,
se trabajó con agitación y se conectó la misma
celda que la descrita para voltamperometría, al
potenciostato y se polariza el electrodo de
trabajo a un potencial determinado, entre -0,4 V
y 0,3 V. Se realizan adiciones de sustrato
polifenólico hasta una concentración de 24,3
μM. En todos los casos, el mismo experimento
se llevo a cabo en sensores controles GEC con
el objeto de comparar las respuestas
3. Resultados y discusión
3.1 Caracterización electroquímica de los
biosensores de lacasa
La Figura 2 muestra los resultados
obtenidos de la caracterización de los
biosensores enzimáticos de lacasa-GEB con
diferente cantidad de enzima (0, 2, 10, 15 y
20%) en solución reguladora ABS a pH 3,5 con
-1
una velocidad de barrido de 0,1V s .
Como puede observarse, existe un par de
picos de oxidación debido a la transferencia
electrónica directa de la enzima al transductor.
Estos potenciales a ν= 0,1V s-1, se encuentran
en 240 mV y 16.8 mV para el pico anódico y
catódico, respectivamente. Tal y como puede
421
observarse en la Figura, es importante destacar
que a medida que aumenta la proporción de
enzima, desde 0 a 10 %, se observa un
aumento evidente de la señal debido al centro
catalítico de cobre de la enzima, pero para
cantidades superiores, esta señal decae, debido
al empeoramiento de la conducción del material
biocompósito. Por lo tanto, se tomó como
material para subsecuentes estudios el
biosensor de lacasa(10%)-GEB.
(Ipc), ya que se incrementa linealmente con la
velocidad de barrido, al menos hasta 0.4 V s-1.
Fig.4. Estudio de la dependencia de Ipa e Ipc con la
velocidad de barrido para un biosensor de Lacasa(10%)GEB.
Estos resultados confirman la transferencia
electrónica directa de la enzima, ya que la
reacción no sería un proceso controlado por la
difusión, sino por la superficie, como se espera
para sistemas con los reactivos inmovilizados
en la superficie del transductor. Cabe destacar,
además, que la relación entre las pendientes
anódicas y catódicas, de valor cercano a la
unidad, indican que el proceso de transferencia
electrónica directa del sitio catalítico de la
enzima al biocompósito es un proceso
reversible.
Fig.2. Voltamperometría cíclica de los biosensores de
lacasa (lacasa- GEB) de diferente composición (0,2,10,15 y
20%) en solución reguladora ABS a pH 3,5 y velocidad de
-1
barrido 0,1 Vs . Se emplea como control un electrodo GEC.
Se ha estudiado el comportamiento del
biosensor a diferentes velocidades mediante
voltamperometría cíclica obteniéndose el
resultado que se muestra la Figura 3.
3.2.
Caracterización
de
la
actividad
enzimática de los biosensores lacasa frente
a sustratos polifenólicos
En esta caracterización (Figura 5), se
pretende evaluar el efecto electrocatalítico del
biosensor enzimático lacasa(10%)-GEB, frente
a diferentes sustancias polifenólicas, tales como
a) catequina, b) ácido cafeico, c) ácido gálico, y
d) trans-resveratrol , utilizando ABS pH= 3,5
(izquierda) y CBS pH 5,0 (derecha). En todos
los
casos
se
muestra
el
primer
voltamperograma cíclico solapado del sensor
control GEC, antes y después de la adición de
la sustancia polifenólica, y el biosensor
enzimático lacasa(10%)-GEB. Como puede
deducirse del cambio del perfil de patrón en el
biosensor lacasa(10%)-GEB respecto al GEC,
es evidente. Además, de la figura se puede
deducir, para el caso de las voltamperometrías
en el sensor GEC, que algunos de estos
compuestos
son
electroquímicamente
reversibles (catequina y ácido cafeico), mientras
que los otros dos compuestos demuestran un
comportamiento irreversible (ácido gálico y
trans-resveratrol), ya que una vez oxidados en
la superficie del electrodo, no pueden volver a
ser reducidos electroquímicamente.
Fig.3: Voltamperometría cíclica a diferentes velocidades de
barrido (20, 40, 60, 80, 100, 200, 300 y 400 mVs-1) en 20
mL solución reguladora de ABS.
Como puede observarse en la Figura 3,
existe una clara dependencia de las corrientes
anódicas y catódicas y de sus correspondientes
potenciales con la velocidad de barrido. En la
Figura 4 se observa que existe linealidad tanto
de la corriente anódica (Ipa) como catódica
422
Fig.5. voltamperometría cíclica de los electrodos GEC y los biosensores de lacasa(10%)-GEB en ABS pH 3,5 (izquierda) y en
CBS pH 5,0 (derecha) v= 200 mVs-1. En todos los casos antes y después de la adición de a) catequina; b) ácido cafeico; c)
ácido gálico; y d) trans-resveratrol todos a concentración 90,9 μM.
423
Teniendo en cuenta la dirección del barrido,
(potencial inicial 0,0 V, yendo en sentido
negativo hasta -0.4 y revirtiendo el sentido del
barrido hasta 1,0 V), se observa en todos los
casos un aumento de la Ipc (señal de
reducción) como consecuencia de la acción
enzimática de la lacasa del biosensor, que oxida
los polifenoles, excepto para los compuestos
irreversibles. En este caso, no es posible
observar la reducción de los compuestos
previamente oxidados por la enzima. En
general,
se
observa
que
el
efecto
electrocatalítico
para
los
compuestos
reversibles es más marcado cuando se usa
CBS, pH=5, mientras que la señal debida a la
enzima lacasa aparece solapada por las
señales de los polifenoles. Para el caso de los
compuestos irreversibles, sin embargo, se
observa un incremento más marcado cuando se
usa ABS, pH 3,5. En este caso, debido a que no
existe solapamiento con la señal de reducción
de los compuestos debido a su irreversibilidad,
se puede suponer que la señal que se
incrementa es la correspondiente al sitio
catalítico de la enzima, teniendo además en
cuenta que los potenciales se corresponden a
los observados en la Figura 2. Con el objeto de
seleccionar un potencial capaz de detectar los
diferentes
polifenoles,
se
realizó
la
amperometría (resultados no mostrados). En
este caso, se espera observar la reducción de
los polifenoles reversibles previamente oxidados
por la acción de la enzima lacasa del biosensor.
El biosensor es capaz de detectar tanto en ABS,
pH=3,5 como en CBS, pH=5,0, la señal de
reducción de los polifenoles reversibles
(catequina y ácido cafeico), mientras que para
el caso de los compuestos irreversibles se
obtiene una escasa señal de reducción. Cabe
destacar también que el biosensor es más
sensible para ácido cafeico cuando se usa CBS,
obteniéndose las señales de reducción más
altas, respecto al resto de polifenoles, mientras
que para el ABS, tanto ácido cafeico como
catequina son observados con casi la misma
sensibilidad. Como resultado del estudio
amperométrico, se puede concluir que para
cuantificar ácido cafeico o catequina, puede
aplicarse un potencial de 0,0 o de 0,1 V (vs
Ag/AgCl), y que la mejor solución para la
determinación es CBS, pH=5,0.
efecto electrocatalítico del biosensor enzimático
de lacasa(10%)-GEB a diferentes potenciales, y
frente a diferentes vinos, comparando con elñ
sensor GEC sn enzima. En la Figura se muestra
el resultado para Vino tinto Cermeño (2006)
D.O. Ribera de Duero (utilizando CBS pH 5,0).
Fig.6: Representación de la señal amperométrica del
biosensor lacasa(10%)-GEB a diferentes potenciales de
vino tinto Cermeño (2006) con una dilución 1/40 en 20,0 mL
de buffer CBS pH 5,0.
Se puede concluir que para cuantificar
polifenoles en vino con el biosensor enzimático,
puede aplicarse un potencial de 0,1 V (vs
Ag/AgCl), tanto en ABS (resultados no
mostrados) como en CBS, aunque la respuesta
amperométrica es mayor en CBS.
Luego de la selección del potencial idóneo
de trabajo para ABS a pH 3,5 o CBS a pH 5,0,
es de 0,1 V, se realizaron adiciones crecientes
de vino en la misma celda, y los resultados se
muestran en la Figura 7.
Fig. 7. Representación de la señal de Intensidad obtenida
frente al volumen adicionado de vino tinto Cermeño (2006)
(adiciones de 100 μL hasta un volumen de 1000μL) con los
electrodos GEC y Lacasa(10%)-GEB CBS pH 5,0.
El potencial escogido para este biosensor
es altamente selectivo, ya que como se puede
observar, no existe respuesta del sensor GEC,
sin enzima, a la adición del vino, por lo que la
respuesta del biosensor lacasa(10%)-GEC
puede asumirse a la acción enzimática de la
lacasa sobre los polifenoles del vino.
3.3.
Caracterización
de
la
actividad
enzimática de los biosensores lacasa frente
a compuestos polifenólicos en vino
En la caracterización amperométrica que se
muestra en la Figura 6, se pretende evaluar el
424
4. Conclusiones
El dispositivo desarrollado para la determinación
de compuestos polifenólicos ha demostrado
tener múltiples ventajas en la detección de
polifenoles en vino. Se ha demostrado que la
enzima se inmoviliza fácilmente, conservando
sus propiedades electroquímicas debido a la
capacidad de regeneración de la superficie del
electrodo mediante el pulido. El proceso de
fabricación sencillo. Estos dispositivos realizan
medidas estables y reproducibles mediante
amperometría, lo que posibilitaría el uso de
instrumentación asociada portátil para medidas
de campo. Otra de las ventajas que presenta es
la no necesidad de pretratamiento de las
muestras. Por otro lado, la enzima lacasa
muestra una transferencia electrónica directa
(DET) cuando se integra en la formulación de
un transductor electroquímico rígido como es el
biocompósito de grafito-epoxi (Lacasa-GEB). El
biosensor permitirá el análisis in situ de
polifenoles en vinos, así como en otras matrices
alimentarias, de forma rápida, simple y con un
bajo coste. Las perspectivas futuras se dirigen
hacia la comparación de la metodología
desarrollada con los métodos de referencia
(HPLC y Folin-Cicalteau) y la aplicación para la
determinación de polifenoles en muestras
alimentarias.
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425