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Aspergilosis ASPERGILOSIS INTRODUCCIÓN Entre los hongos considerados oportunistas se encuentran las especies del género Aspegillus; género que crece en importancia desde 1729, año en el que fue descripta la primera patología humana. Presentan una gran versatilidad metabólica y una gran capacidad para dispersar sus conidios dado que su cabeza conidial puede producir más de 500.000 conidios. Al género Aspergillus pertenecen aproximadamente 900 especies, cuyos conidios son inhalados en forma permanente por el hombre; pueden ser aislados de cualquier sustrato que contenga materia orgánica y humedad como por ejemplo del suelo, restos vegetales en descomposición, alimentos etc, por lo tanto puede afectar nuestro bienestar de diferentes formas: Como patógeno humano y animal Como productores de micotoxinas Como contaminantes de cultivos, productos alimenticios, cueros, tejidos, etc., produciendo una disminución del valor comercial de los mismos. A pesar de su ubicuidad sólo unas pocas especies están relacionadas con patologías en el hombre, independientemente del sexo, edad y raza, a saber: Aspergillus fumigatus Aspegillus flavus Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus nidulans CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA: Dominio: Eucarya Reino: Fungi División: Ascomycota Sub-División : Pezizomycotina Orden: Eurotiales Familia: Aspergillaceae Género: Aspergillus DEFINICIÓN Se define a la aspergilosis como a un conjunto de enfermedades producidas por hongos del género Aspegillus las cuales varían desde cuadros de tipo alérgico a infecciones generalizadas que ponen en peligro la vida del paciente. La gravedad de la aspergilosis depende de varios factores, aunque uno de los más determinantes es el estado del sistema inmune del enfermo. Los 1 Aspergilosis cuadros clínicos de aspergilosis no incluyen las micotoxicosis. Éstas son provocadas por metabolitos secundarios producidos durante el desarrollo fúngico, denominados “micotoxinas”, que son tóxicos para las células de mamíferos. La intoxicación es de origen alimentario, ya que los alimentos pueden estar contaminados con hongos productores de micotoxinas y/o con estos metabolitos, produciendo la enfermedad conocida como micotoxicosis. Las principales toxinas producidas Aspergillus, en particular A. flavus, A. parasiticus, y A. nomius, son conocidas como Aflatoxinas (AF). Éstas son consideradas como las de mayor toxigenicidad. Otras micotoxinas producidas por Aspergillus son: ochratoxina A; patulina, ácido tenuazónico y esterigmatocistina. A pesar que las micotoxinas pueden comprometer la salud humana o animal hasta la muerte, las micotoxicosis son abordadas por la micotoxicología (por lo que no serán tratadas este apunte). VIAS DE INGRESO AL ORGANISMO: Sitio de infección más frecuente: vías respiratorias 2 Aspergilosis CUADROS CLÍNICOS: Pueden ser alérgicos o patogénicos. La enfermedad alérgica se presenta por exposiciones repetidas, de un individuo sensibilizado, a los conidios o a los antígenos fúngicos inmunológicamente reactivos, en ausencia de invasión de micelio en el tejido pulmonar. Se pueden aislar formas fúngicas en los cultivos y los síntomas del paciente disminuyen con la administración de corticoides. Hay dos cuadros principales de aspergilosis alérgica: Aspergilosis Broncopulmonar Alérgica (ABPA) y la sinusitis alérgica. En la enfermedad patogénica, los agentes causales, hifas y propágulos fúngicos invaden y producen una inflamación de los tejidos infectados. Comprende la Aspergilosis Pulmonar Crónica y la Aspergilosis Invasiva. Además pueden ocurrir infecciones en otras localizaciones extra pulmonares como la cutánea, ótica y oftálmica. •ASPERGILOSIS PULMONAR INVASIVA •SINUSITIS INVASIVA •ASPERGILOSIS DEL SNC ASPERGILOSIS BRONCOPULMONAR ALÉRGICA (ABPA) Esta entidad clínica se desarrolla cuando existe alergia a las esporas de las especies de Aspergillus. Es un cuadro bastante común en asmáticos. La ABPA también es frecuente en enfermos con fibrosis quística, especialmente en la adolescencia y en la madurez. Los síntomas son similares a los de las crisis asmáticas y se caracterizan por episodios intermitentes de malestar general, tos y dificultad respiratoria. Algunos pacientes pueden presentar expectoración de pequeñas masas o tapones mucosos de color marrón. El diagnóstico se realiza por radiología, por análisis del esputo y pruebas diagnósticas sanguíneas. A largo plazo, si el paciente no recibe tratamiento, pueden producirse lesiones pulmonares permanentes, como la fibrosis de estos órganos. 3 Aspergilosis Existen 8 criterios que han sido sugeridos como indicativos de ABPA: Episodios de sibilancias (asma) Eosinofilia Test de sensibilidad inmediata positiva a antígenos de Aspergillus. Ac precipitantes (IgG) específicos para Aspergillus. Aumento de IgE total. Aumento de IgE específica para Aspergillus Bronquiectasias (dilatación de los bronquios) Historia de infiltrados pulmonares (por Rayos X) Si un paciente presenta los 8 criterios, es un diagnóstico de certeza de ABPA; si presenta asma, eosinofilia e infiltrados pulmonares es probable que tenga ABPA pero hay que confirmar el diagnóstico con las pruebas específicas. Sinusitis alérgica: Es la infección de los senos paranasales causadas por hongos. La enfermedad se caracteriza por congestión nasal de larga evolución, rinorrea, drenaje post nasal, cefaleas y aparición de pólipos nasales en algunos pacientes, sin invasión del tejido circundante al seno afectado. En el moco se observa un aumento marcado de los eosinófilos El exceso de mucosidad favorece la formación de tapones pudiéndose observar las hifas características y obtenerse desarrollo fúngico a partir de ellos. Los pacientes con sinusitis alérgica presentan reacciones cutáneas positivas, anticuerpos precipitantes específicos y un aumento marcado de IgG e IgE totales en sueros. El tratamiento varía dependiendo de los casos, incluyendo drenaje quirúrgico, extirpación de los pólipos, control de las infecciones bacterianas secundarias, esteroides locales y cortos periodos de terapia con esteroides orales y antifúngicos tópicos. ASPERGILOSIS PULMONAR CRÓNICA (APC) Es una infección pulmonar de larga evolución producida preferentemente por A. fumigatus. Los pacientes que sufren APC presentan un estado inmune conservado y en ciertas circunstancias pueden erradicar espontáneamente la infección. La APC raramente evolucionan a formas invasivas. Incluye 2 entidades clínicas: Aspergiloma El hongo crece dentro de una cavidad pulmonar preexistente, la cual se formó en el transcurso de una enfermedad pulmonar previa, como la tuberculosis o la sarcoidosis. Cualquier padecimiento que provoque la formación de cavidades pulmonares puede ser el origen del aspergiloma, ya que los conidios pueden penetrar en la cavidad, donde germinan, formando una “bola fúngica” en el interior de la misma. 4 Aspergilosis Aspergilosis pulmonar cavitaria crónica (APCC) El hongo produce una o más cavidades en el tejido pulmonar, que pueden o no tener una masa o bola fúngica dentro de las mismas. En ambos cuadros, los individuos afectados pueden permanecer asintomáticos, especialmente en las fases iniciales de la enfermedad o presentar como única sintomatología la tos, con períodos de leve mejoría. Cuando aparece la sintomatología, ésta se caracteriza por pérdida de peso, tos crónica, fatiga y debilidad. La emisión de esputos con sangre (hemoptisis) puede ocurrir hasta en un 50-85% de los pacientes debido a la liberación de enzimas proteolíticas que destruyen el parénquima pulmonar y a la fricción mecánica que provocan las masas fúngicas. En el estudio inmunológico de estos pacientes se observan títulos de IgE e IgG, y reacciones cutáneas (+). El diagnóstico es clínico (sintomatología), por imágenes (presencia de cavidades y bola fúngica) y estudios micológicos (cultivos, serología). Otras localizaciones extra pulmonares de estas “bolas fúngicas” son los senos paranasales. Las bolas fúngicas de los senos paranasales tienen características similares a los aspergilomas. En pacientes con un sistema inmune normal, los síntomas más frecuentes son congestión nasal, dolor de cabeza y molestias faciales. El drenaje quirúrgico de los senos suele ser curativo, salvo en los casos en los que Aspergillus haya profundizado y la bola fúngica se sitúe en el interior del cráneo. En estos enfermos el tratamiento quirúrgico debe asociarse a la terapia antifúngica. ASPERGILOSIS INVASIVA (AI) La aspergilosis invasiva o invasora es una entidad clínica que ha tomado importancia en años recientes. El hecho de contraer esta enfermedad depende de la susceptibilidad del huésped, principalmente en aquellos que poseen una marcada neutropenia o neutrófilos con funcionalidad deficiente, por alguna de los siguientes factores: Quimioterapia y radioterapia para el tratamiento del cáncer 5 Aspergilosis Trasplante de medula ósea por el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas (leucemia, linfoma) Uso de drogas inmunosupresoras por trasplantes Desórdenes genéticos como enfermedad granulomatosa crónica Uso prolongado de corticosteroides. Diabetes SIDA Otro factor importante que condiciona la infección por Aspergillus es la vía de entrada del hongo. Como es natural para un hongo que se encuentra en el aire, las partes del cuerpo más vulnerables son los pulmones y senos paranasales. La patogenicidad de Aspergillus está relacionado con el pequeño tamaño de las conidios, 2-5m, que al ser inhalados ingresan a los espacios alveolares. En los conidios de A. fumigatus se encuentra una sustancia de bajo PM capaz de inhibir la fagocitosis, y de resistir la acción lítica de los neutrófilos y células relacionadas, actuando como un verdadero factor de virulencia. Los conidios germinados y las hifas son menos susceptibles a la acción de esta barrera inmunológica. Las hifas pueden extenderse por el parénquima provocando desde una bronconeumonía necrotizante hasta un infarto hemorrágico. Desde allí, y a través de la vía hematógena se diseminan causando abscesos en diferentes órganos. Aspergilosis Pulmonar Invasiva (API): es la forma más grave y fatal. Se da frecuentemente en pacientes con alguna forma de inmunosupresión. La gravedad depende de la persistencia de la aplasia en el tiempo y/o la asociación con corticosteroides. Se presenta entre 5-15% de pacientes inmunocompetentes. Causa la muerte entre el 57 y 100% de los casos dependiendo de la celeridad en el diagnóstico y tratamiento, de la asociación de dos o más factores de riesgo, de la enfermedad de base y del tiempo y tipo de inmunosupresión. Se la puede definir como una neumonitis necrotizante con invasión de los vasos sanguíneos secundaria a la colonización del parénquima pulmonar. Se presenta con fiebre, nódulos o infiltrados pulmonares con mala respuesta al tratamiento antibacteriano. Las manifestaciones clínicas se observan de diferentes maneras: neumonía, bronconeumonía necrotizante, hemoptisis, infarto hemorrágico, abscesos pulmonares múltiples o únicos, invasión de las estructuras torácicas contiguas para posterior diseminación. La API suele presentarse a partir de la segunda semana en neutropénicos después del tratamiento de quimioterapia o trasplante de médula ósea (TMO) o entre el 1º y 2º mes en un trasplante de órgano sólido. 6 Aspergilosis La hemoptisis puede explicarse como la invasión de hifas en la capa elástica media de la pared de los vasos pulmonares y bronquiales dando como resultado un aneurisma que al romperse causa hemorragias que pueden resultar fatales. El hongo puede también diseminarse a través de la pleura hacia el espacio pleural, músculos intercostales o hacia pericardio y miocardio que puede llevar al infarto. En personas con graves alteraciones del sistema inmunológico, el hongo puede llegar al torrente sanguíneo desde los pulmones y diseminar al cerebro y a otros órganos, como ojos, corazón, riñones y piel. Normalmente, la diseminación tiene mal pronóstico, ya que suele conllevar una grave afectación del enfermo, con gran riesgo para su vida. En algunos casos, la afectación cutánea permite que el diagnóstico se realice antes, por lo que puede iniciarse un tratamiento específico de forma precoz. Sinusitis invasiva: en las personas con alteraciones del sistema inmunológico, por ejemplo en pacientes con leucemia o en trasplantados de médula ósea, la sinusitis por Aspergillus es una infección más grave. En estos enfermos, la sinusitis es una forma de aspergilosis invasora, cuyos síntomas incluyen fiebre, dolor facial, rinorrea y cefalea. El diagnóstico se realiza por el cultivo o visión del hongo en fluidos o tejidos procedentes de los senos. La cirugía suele ser útil en la mayoría de los casos, pero además se debe intentar corregir la causa de la inmunodepresión, ya que de otro modo es difícil erradicar el hongo. Aspergilosis del Sistema Nervioso Central (ASNC) Un blanco extra pulmonar en pacientes granulocitopénicos y/o con corticoterapia es el SNC, a través de la vía pulmonar o por contigüidad de los senos paranasales. La presencia de infiltrados pulmonares y el déficit neurológico en un paciente inmunocomprometido son indicios para sospechar una Aspergilosis del SNC siendo mucho más frecuente que otras patologías, como la candidiasis o la criptococosis. 7 Aspergilosis Diagnóstico de la AI: El diagnostico no es simple aunque actualmente, se están realizando muchos estudios esperanzadores para acelerar el diagnóstico de la aspergilosis invasiva y así mejorar su tratamiento. Primero se le deberá realizar al paciente una exhaustiva historia clínica, consignando los signos y síntomas. Dependiendo de esta historia se deberían realizar los siguientes estudios para completar el diagnóstico: Análisis de sangre. Radiografía o tomografía computada de tórax. Broncofibroscopía. Análisis micológico de esputo (seriado) o de lavado broncoalveolar (BAL). Análisis micológico de una muestra o biopsia de masa de tejido (si existe) de una cavidad pulmonar. Detección de anticuerpos contra Aspergillus en muestra de suero. Detección de Galactomanano en muestra de suero o BAL. LOCALIZACIONES EXTRAPULMONARES: -Aspergilosis cutánea Es una manifestación poco frecuente que puede presentarse en pacientes inmunocomprometidos que se encuentran en contacto con instrumental médico, apósitos contaminados, etc. El desarrollo es localizado y con necrosis del tejido adyacente, provocando una angio-invasión y trombosis. 8 Aspergilosis -Localización ótica Entre los factores predisponentes encontramos patologías auriculares, factores genéticos, traumatismos y factores climáticos. La especie más frecuentemente aislada es Aspergillus niger El desarrollo de esta especie fúngica puede causar la obstrucción del conducto auditivo, provocando molestias, irritación, prurito y una apariencia grisácea. En pacientes neutropénicos puede causar necrosis del conducto auditivo externo, siendo una complicación poco frecuente en los pacientes inmunocompetentes. -Localización oftálmica. Se la ha definido como el proceso inflamatorio que involucra la cavidad ocular y a las estructuras adyacentes. Puede adquirirse en forma exógena, generalmente asociado a un trauma con una astilla u otro elemento punzante o en forma endógena, como parte de una diseminación. La lesión inicialmente se manifiesta como un cuadro de conjuntivitis que se agrava, pudiendo ocasionar perforación de la córnea y pérdida del ojo afectado. La endoftalmitis aspergilar es menos frecuente que la candidiásica, resultando el A. fumigatus el agente más frecuentemente hallado, seguido por A. flavus, A. niger, A. terreus. 9 Aspergilosis DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL La presencia de focos pulmonares en pacientes granulocitopénicos sugiere la necesidad de realizar diagnóstico diferencial incluyendo a las neumonías producidas por bacterias resistentes, infecciones recientes con citomegalovirus y con otras micosis invasivas como las causadas por: Trichosporon asahii, Fusarium spp., Pseudoallescheria boydii y por Zygomycetes En los pacientes HIV(+) o tratados con corticoterapias debe diferenciarse de las patologías causadas por Mycobacterias atípicas, Nocardia asteroides, Pneumocistis jirovecii, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Coccidioides immitis, entre otros. INTERACCIÓN DE ASPERGILLUS CON EL HOSPEDERO El riesgo de desarrollar aspergilosis invasiva aumenta con el aumento de los niveles de deficiencia inmunológica. En cambio, el riesgo de la aspergilosis alérgica es mayor en las personas cuyo sistema inmunológico está hiperactivo-reactiva (atópica). DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO: -Examen directo y cultivos micológicos El análisis de los distintos materiales obtenidos de las zonas afectadas es de gran importancia para el diagnóstico de este amplio espectro de patologías. Así el estudio de esputos, lavado bronqueoalveolar (BAL), biopsia pulmonar o renal, raspados oftálmicos, secreciones óticas, biopsia o lavado de senos nasales, muestras oculares y de piel, revelan en el examen directo con KOH al 10% o con azul de lactofenol (Gueguén) la presencia de hifas anchas tabicadas y con ramificaciones dicotómicas en ángulo de 45°, de 10 Aspergilosis aproximadamente 2,5 a 4,5 μm de ancho (Foto Nº 1). El uso de la técnica de Calcofluor puede facilitar la observación de las formas fúngicas. Coloraciones como las de Gram Nicolle, Hematoxilina Eosina y Gomori-Grocott (Foto Nº 2) permiten una buena visualización de las hifas características. Foto Nº 1. Ex. Directo de material rinosinusal con de lactofenol: se observan hifas anchas tabicadas y con ramificaciones dicotómicas. Foto Nº 2: Extendido de absceso cerebral coloreado con Azul Gomori-Grocott: se observan hifas anchas tabicadas y con y ramificaciones dicotómicas. En los casos de aspergilomas, las muestras de esputos, la presencia de hifas y, en raros casos, la de elementos de fructificación, orienta a que la masa fúngica se encuentra alojada en una zona de aireación constante. Los medios de cultivos más utilizados son Sabouraud Glucosa y Czapek (crecen bien en estos medios generales) a los que podemos agregar antibióticos. Algunas cepas del género Aspergillus son sensibles a la cicloheximida por lo que no se recomienda el uso de medios de cultivo con este antibiótico (Mycosel). La temperatura también influye en el desarrollo de las especies involucradas, pero podemos considerar que la temperatura óptima es de aproximadamente 28 °C. La mayoría de los Aspergillus patógenos pueden desarrollar a 37 oC, inhibiendo así a la flora saprófita acompañante. A fumigatus es considerado una especie termotolerante, porque puede desarrollar a temperaturas de alrededor de 45 °C. El diagnóstico micológico se ve dificultado por la ubicuidad del género, por lo tanto su hallazgo en muestras aisladas de esputo, secreciones óticas e hisopados no tienen significado clínico, por lo que se recomienda para estos materiales el envío de MUESTRAS SERIADAS para su procesamiento, en las que debe hallarse crecimiento de igual género y especie del hongo en la mayoría de los medios de cultivo sembrados con el material. En piezas obtenidas por métodos quirúrgicos o por punciones (obtenidos de sitios estériles), la observación de las hifas características y desarrollo de hongos pertenecientes al género Aspergillus, tienen valor diagnóstico. El hallazgo de un resultado positivo en el tracto respiratorio tiene valor diagnóstico 11 Aspergilosis si va acompañado de síntomas y signos característicos de infección pulmonar o sinusal. Las muestras de lavado bronco alveolar (BAL) tienen baja sensibilidad, pero el aislamiento de Aspergillus es indicador de infección. Los hemocultivos son generalmente negativos para la aspergilosis. Para mejorar los aislamientos se deben tomar varias muestras en el episodio febril. La frecuencia relativa de las especies asociadas con aspergilosis invasiva es la siguiente: Aspergillus fumigatus (85-90%); Aspergillus flavus (10%); Aspergillus niger (3-7 %); Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus (1%). La identificación de estas y otras especies se realiza a través de estudios macro y micromorfológicos. CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA DEL GÉNERO ASPERGILLUS Taxonómicamente, al género Aspergillus se lo puede ubicar dentro de los hongos fialidados que poseen células de pie, pero estos elementos micromorfológicos son insuficientes para identificarlos ya que existen otros hongos como Penicillium que también los poseen. Raper y Fennel proponen que la presencia de células de pie es característica del género Aspergillus pero su ausencia no lo descarta. Gams et al. reclasificaron el género y lo dividieron en 7 subgéneros, cada uno de los cuales dividido a su vez en una o más secciones que se corresponden con los grupos descritos por Raper y Fennell. (Secciones Fumigati, Flavi, Nigri, Terrei, etc) El género Aspergillus incluye más de 250 especies. de las cualesa sólo 20 se les atribuyen infecciones oportunistas en el hombre (aunque a algunas de ellas solo ocasionalmente). Aspergillus lentulus es una especie recientemente descripta perteneciente a la sección Fumigati, morfológicamente parecido a A. fumigatus, del que se puede distinguir por su lenta esporulación en cultivo y por presentar un patrón de resistencia a los antifúngicos diferente, siendo A. lentulus más resistente in vitro a la anfotericina B. Para identificar una especie se analiza su estructura reproductiva cuyos constituyentes son: cabeza conidial, conidióforo, vesícula, fialide y conidios; células de Hülle, cleistotecios y esclerotes se ven sólo e nalgunas especies. Fig N° 1, 2 y 3 Cabeza conidial: Esta caracterizada por su color, tamaño y forma. El primero esta determinado por el color de los conidios; el segundo depende del tamaño de la vesícula y del largo de las cadenas de conidios. La forma varía desde columnares a radiadas y globosas, teniendo una relación directa con la forma en que se implantan las fialides. Conidióforo: Está compuesto por: célula de pie, el conidióforo propiamente dicho y la vesícula. Habitualmente no son ramificados ni tabicados, pero sus paredes pueden ser lisas o rugosas. Vesícula: Se presenta como un extremo dilatado del conidióforo que puede adoptar formas variadas: globosa, elíptica, clavada, semiesférica, y cuyo tamaño varia de 10 a 65m.. 12 Aspergilosis Fialide: es la célula conidiógena que da origen a los elementos de reproducción asexual denominados conidios. Se desarrollan sobre el área fértil de la vesícula y se pueden disponer en una sola hilera (uniseriada) o en doble hilera (biseriada) llamando a la primer hilera, esterigmas o métulas. Conidios: Son propágulos asexuados unicelulares que pueden ser uni o multinucleares y que se pueden presentar de formas y colores diversos y que se disponen en cadenas. Sus superficies pueden ser lisas o rugosas. Figura Nº 1: Estructuras reproductivas de especies del género Aspergillus. Células de Hülle: Son estructuras especializadas que se pueden observar en diferentes especies fúngicas. Presentan paredes gruesas y se disponen en forma terminal o intercalar en la hifa y son de formas variadas: globosa, subglobosa o elongada. Esclerotes: Algunas cepas fúngicas, como A. flavus; A. oryzae; producen masas fuertes, de formas, tamaños y colores diferentes, con células de paredes gruesas que semejan un parénquima. La producción de estas estructuras dependen de las condiciones del cultivo y su presencia o ausencia no es relevante para la taxonomía. Cleistotecios: son ascocarpos cerrados que incluyen elementos de la reproducción sexuada: esporos sexuados. Figura Nº2: Estructuras vegetativas y reproductivas del gênero Aspergillus Células de Hülle Esclerotes 13 Cleistotecios Aspergilosis Figura Nº3: Características micromorfológicas de especies de Aspergillus 14 Aspergilosis Otros Reproducción sexuada Reproducción asexuada Colonia Tabla Nº 1. Características macro y micromorfológicas de las especies de Aspergillus asociadas con patologías en humanos CARACTERISTICAS A.fumigatus A.flavus A.niger A.terreus A.nidulans Aspecto Plano, aterciopelado, algodonoso Pulverulento Punteado negro Aterciopelado, flocoso Plano, aterciopelado Color Verde botella, blancogrisáceo Verde amarillento Blanco amarillento Reverso Incoloro, Rojo amarillento Incoloro, café amarillento Incoloro, amarillento Conidióforo Corto, liso, incoloro, 300 m Regular, pared rugosa Largo, 1.5 – 3 mm Vesícula Mazo o domo Esfèrica Globosa Fialides Una serie, paralelas Una a dos series radiadas Dos series radiadas Conidios Globosos, equinulados, verdes Piriformes o globosos, verde amarillentos Globosos, negros Cleistotecios Globosos, amarillos 500 m --- --- --- Globosos, cafè (marròn) 130 m Ascosporas Globosos con crestas ecuatoriales --- --- --- Rojizas Células en avellana --- --- --- --- 20 m Esclerotes --- Blanco o negro --- --- --- Temperatura de desarrollo óptimo 37 a 50 ºC 37 ºC 37 ºC 37 ºC 30 a 37 ºC 15 Marrón amarillento Incoloro, beige Regular,hialino liso Subesférica Dos series Ligeramente colunnar Globosos, estriados, amarronados Verde amarillento Rojo púrpura Muy corto, liso, café (marrón), 600 m Hemiesfèrica Dos series, paralelas Globosos, equinulados, verdes Aspergilosis DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Los métodos serológicos son de gran ayuda diagnóstica, siendo la búsqueda de anticuerpos circulantes, una de las técnicas más frecuentemente usadas. La inmunodifusión (ID) es el ensayo inmunológico más frecuentemente realizado en el laboratorio de micología, obteniendo la presentación de 1 a 18 bandas cuando enfrentamos el suero problema con extractos metabólicos purificados de las diferentes especies del género Aspergillus. La presencia de Ac circulantes se observa entre el 75 al 100% de los casos de aspegiloma y entre el 66-100 % de los casos con ABPA, en los que también se ha reportado la presencia de IgE e IgG, pero en pacientes con AI pueden presentar 1 o ninguna banda de precipitación (debido a la inmunosupresión) por lo que se trató de avanzar en nuevas técnicas de serodiagnóstico. Rippon y col. sostienen que la prueba de ID aún es útil y que se puede correlacionar los patrones de bandas con patologías como por ejemplos: 1 banda débil se presenta en asmáticos, 4 ó más bandas en ABPA con colonización, hasta 18 bandas en aspergilomas y en AI se pueden detectar o no bandas (dependiendo del estado inmunológico del paciente). Dado que existe variabilidad antigénica entre las cepas de la misma especie, es recomendable preparar los extractos de antígenos con diferentes cepas y debidamente purificados con técnicas de producción de antígenos estandarizadas. Puesto que los procedimientos microbiológicos tradicionales para establecer el diagnóstico de la aspergilosis invasora son tardíos y de poca rentabilidad, se han desarrollado una serie de marcadores de enfermedad invasora por Aspergillus spp. que permiten realizar un diagnóstico de forma precoz que conlleva la posibilidad de establecer un tratamiento anticipado. ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA AI Diagnóstico de AI mediante detección de galactomanano (GM): Desde hace 20 años se conoce la presencia de más de 100 componentes antigénicos en el suero de enfermos con aspergilosis invasora, siendo el marcador de mayor utilidad diagnóstica el galactomanano. El galactomanano es un componente de la pared celular del género Aspergillus, siendo el principal exoantígeno liberado durante la angioinvasión. En enfermos con aspergilosis invasora el GM puede ser detectado en suero, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pericárdico/pleural y BAL. Las concentraciones de GM en suero son fluctuantes, y aunque no se conoce con exactitud su cinética, se sabe que en su aclaración intervienen las células de Kupffer. Actualmente se utiliza un ELISA doble sándwich que emplea un anticuerpo monoclonal de rata EBA–2 dirigido contra el GM de Aspergillus que es utilizado como captor y detector del 16 Aspergilosis antígeno. Esta prueba esta comercialmente disponible Platelia Aspergillus® (Bio-Rad, MarnesLa-Coquette, Francia). Es una técnica sencilla, reproducible y rápida (aproximadamente 4 horas) cuyo punto crítico radica en el tratamiento del suero con calor en presencia de EDTA, para disociar los inmunocomplejos y precipitar las proteínas séricas que podrían interferir con el ELISA. Definición de GM positivo: Se considera que la prueba es positiva cuando se obtienen al menos dos determinaciones consecutivas positivas, siendo el punto de corte en 0,5 ng/ml. El GM es de gran utilidad diagnóstica en pacientes neutropénicos adultos (<100 N/mm3 >3 semanas ó <500 N/mm3 >5 semanas), catalogados como de alto riesgo de desarrollar una AI. Aún no se ha establecido la utilidad diagnóstica del GM en población pediátrica, en pacientes receptores de trasplante de órgano sólido, SIDA, enfermedad granulomatosa crónica, neoplasias de órgano sólido y grandes quemados. A partir del año 2008, la detección del GM se ha introducido como Criterio Micológico en las definiciones de consenso de AI probable de la EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group), en plasma, suero, lavado broncoalveolar, o líquidos (pericárdico, cefalorraquídeo y pleural).(De Pauw et al. 2008) -Es recomendable hacer determinaciones seriadas (2 determinaciones/semana) para aumentar la especificidad y hacer un diagnóstico precoz. El éxito en el diagnóstico de AI, utilizando las técnicas de detección de Ag depende principalmente del correcto monitoreo de las muestras. Así el análisis de muestras seriadas aumenta la posibilidad de obtener resultados satisfactorios. Cuando el paciente recibe terapia antifúngica, el clearence de Ag se ve favorecido, y consecuentemente las pruebas resultaran negativas. Se han detectado falsos positivos en pacientes: tratados con ciclofosfamida, tratados con ATB (amoxicilina-clavulónico, piperacilina-tazobactam), con alimentación parenteral, con colonización intestinal conbifidobacterium, con mucositis (alteración barrera intestinal), con infección por Cryptococcus neoformas , Penicilium, Alternaria, Paecilomyces (reacción cruzada), que ingieren alimentos ricos en galactofuranosa (leche maternizada, cereales), con bacteriemia, con transfusiones. Y falsos negativos, en encapsulación de la infección, en la población no seleccionada. Diagnóstico de AI mediante detección de (1-3)-β-D-glucano (BG) El glucano es un componente de la pared celular fúngica formado por monómeros de glucosa unidos con enlaces (1-3)- β y (1-6)- β. El (1-3)-β-D-glucano se libera durante la infección y 17 Aspergilosis puede detectarse en el plasma de pacientes con varias micosis (candidiasis, aspergilosis y neumocistosis, pero no criptococosis y mucormicosis), ya que el ser humano carece de glucanasas para digerirlo y su eliminación es lenta. Por tanto, una prueba positiva puede utilizarse como marcador de infección fúngica, pero no permite identificar la especie. Las pruebas tradicionales para detectar BG pueden presentar falsos positivos en pacientes sometidos a hemodiálisis con aparatos que tengan membranas de acetato de celulosa, o en tratamiento con albúmina, inmunoglobulinas, algunos agentes anticancerosos y sulfamidas. Un estudio realizado por Pazos y col, sugiere que la detección de BG (Fungitell, Asoc. Cape Code, EU) es una herramienta diagnóstica de la aspergilosis invasora, con una S del 87,5%, una E de 89,6 % y que la positivización en el tiempo del BG era más temprana que con GM en relación a la aparición de fiebre, signos clínicos, imágenes radiológicas (tomografía computada). Según estos autores, la detección conjunta de ambos marcadores, realizadas en suero bisemanalmente, permite: 1aumentar la E y el valor predictivo (+) a un 100 %; 2- predecir la evolución en los enfermos con AI y 3- detectar los falsos positivos para ambos tests. A partir del año 2008, al igual que para el GM, la detección del BG se ha introducido como Criterio Micológico en las definiciones de consenso de AI probable de la EORTC/MSG*, en plasma o suero. (*European Organization for Research and Treatment of Cancer/ Mycoses Study Group. De Pauw et al. Definitions of Invasive Fungal disease, CID, 2008:46). La biología molecular ha aportado mucho para el diagnóstico de las Aspergilosis tanto en el diagnóstico en muestras clínicas como en los estudios taxonómicos de cepas. Los métodos basados en la PCR tienen una mayor sensibilidad que el cultivo y una especificidad comparable a éste. Esta técnica puede dar resultados falsos positivos debido a la ubicuidad del Aspergillus, por la contaminación del ambiente de trabajo, buffers y muestras. El uso de filtros de aire en el área de trabajo puede contribuir a evitar este riesgo. El mayor problema es que por el momento ninguna prueba has sido ampliamente evaluada como para que sea utilizada universalmente. La estandarización de los métodos de extracción y de detección del ADN, permitirá introducir estos métodos al laboratorio micológico de rutina. Desde 2010 un Comité Europeo [European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI), http://www.eapcri.eu] está trabajando en la estandarización de la prueba de PCR para el diagnóstico de AI, en sangre entera, suero y plasma. (White PL et al., 2012). La exclusión de los criterios EORTC/MSG no está relacionado con un rendimiento insatisfactorio, sino al hecho de la falta de estandarización y que hasta hace poco, las alternativas comerciales no estaban disponibles. Actualmente existe una prueba de diagnóstico in vitro, disponible comercialmente, denominada MycAssay Aspergillus (Myconostica, Ltd., Manchester, United Kingdom), que se desarrolló para la detección de ADN genómico de 15 especies diferentes de Aspergillus, incluyendo la 4 18 Aspergilosis más frecuente especies patógenas (es decir , A. fumigatus , A. flavus , A. terreus y A. niger ). Esta prueba consiste en una PCR en tiempo real que amplifica la subunidad 18S rRNA. Otros métodos comerciales para la detección de ADN para patógenos bacterianos y fúngicos son: Factores a tener en cuenta para la detección de ADN para el diagnóstico de la AI: Elección de la muestra óptima: Suero o sangre completa? BAL y plasma?? Método de extracción del ADN Especificidad de los cebadores Formato de la PCR Costo Interpretación de un (+): colonización o infección ???? INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Criterios a seguir para el diagnóstico de Aspergilosis: Aspergilosis ocular, Aspergilosis ótica, Aspergilosis de los senos paranasales: - Examen directo positivo (hifas hialinas) y - Cultivo positivo para Aspergillus Aspergilosis Pulmonar Crónica: - Examen directo positivo (hifas hialinas) y cultivo positivo para Aspergillus desde una muestra estéril, esputo seriado o BAL. Aspergilosis invasiva (API, ASNC): - Examen directo positivo (hifas hialinas) y cultivo positivo para Aspergillus desde una muestra estéril - Detección de antígenos y/o anticuerpos positivos. - BG (+) (Indica infección fúngica invasiva, confirmar etiología con otras pruebas específicas) BIBLIOGRAFÍA - Abarca et al. Identificación del Género Aspergillus. Rev. Iberoamericana de Micología. 2002. - Bonifaz A. 2012. Micología Médica Basica. Ed. MacGraw Hill. $º Ed, México DF. - De Pauw et al. Definitions of Invasive Fungal disease, CID, 2008:46. - Hogan L, Bruce K; Stuart L. Virulence factor of medically important fungi, 1996 Clinical Microbiology Reviews. 469- 488. 19 Aspergilosis - Kibbler, C; MacKenzie D W and Odds F C. Principles and practice of Clinical Mycology. 1996 England British Library. - Kwon Chung K and Bennete J. Medical Mycology. 1992. De Lea & Febyer. USA - Latgé JP. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev 1999; 12: 310-350. -Klich, M. A. 2006. 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