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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA
“Determinación de Escherichia coli y Escherichia coli O157:H7 en leches obtenidas artesanalmente
y distribuidas en 15 lecherías de la cabecera departamental de Chiquimula”
Jackeline Reneé Olivet España
QUÍMICA BIÓLOGA
Guatemala, agosto de 2,008
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA
“Determinación de Escherichia coli y Escherichia coli O157:H7 en leches obtenidas artesanalmente
y distribuidas en 15 lecherías de la cabecera departamental de Chiquimula”
Informe Final de Tesis
Presentado por
Jackeline Reneé Olivet España
Para optar al título de
Química Bióloga
Guatemala, agosto de 2,008
INDICE
Página
I.
Resumen
1
II.
Introducción
2
III.
Antecedentes
A. Generalidades
4
B. Características de la bacteria
6
C. Reservorios y fuentes
8
D. Alimentos implicados y transmisión
10
E. Patogénesis
11
F. Epidemiología
12
G. Leche
1. Conceptos
15
2. Composición
15
3. La leche como vehículo de transmisión de agentes infecciosos
16
4. Zonas y locales destinados a la producción de leche
16
5. Ordeño
16
6. Almacenamiento y transporte de la leche
18
7. El sector lácteo en el municipio de Chiquimula
18
IV.
Justificación
21
V.
Objetivos
23
VI.
Hipótesis
24
VII.
Materiales y Métodos
A. Universo
25
B. Muestra
25
C. Materiales
25
D. Procedimiento
26
E. Diseño estadístico
28
VIII.
Resultados
29
IX.
Discusión de Resultados
35
X.
Conclusiones
38
XI.
Recomendaciones
39
XII.
Referencias
40
1
I.
RESUMEN
Se analizaron 30 leches obtenidas de manera artesanal provenientes de la
cabecera departamental de Chiquimula, a las que se le realizó la determinación
de Escherichia coli para comprobar si las leches analizadas eran aptas para el
consumo humano. Además, se determinó si Escherichia coli O157:H7 se
encontraba presente en la leche cruda analizada.
E. coli O157:H7 se encuentra típicamente en el ganado vacuno saludable,
lo que hace difícil el control de este. Los bovinos parecen constituir la fuente
principal de este agente patógeno, que es transmitido al hombre por el
consumo de alimentos contaminados que derivan de esos, principalmente
carne no cocida adecuadamente o leche cruda. Esta razón motivó a realizar el
análisis de este patógeno en leche cruda obtenida artesanalmente en la
cabecera departamental de Chiquimula, ya que en este lugar todavía se
consume la leche en esa forma.
Las 30 muestras obtenidas se analizaron en dos fases o muestreos, en el
primer muestreo se obtuvo 10/15 (67%) muestras no aptas para consumo
humano ya que presentan E. coli, determinada por medio del método de tubos
múltiples. En el segundo muestreo se comprobó que 14/15 (93%) muestras
presentan E. coli, por lo que no son aptas para el consumo humano. A través
del método de fermentación de sorbitol propuesto en el Manual de Análisis
Bacteriológicos (BAM) se realizó la determinación de Escherichia coli O157:H7
en las muestras recolectadas en los dos muestreos, en las cuales no se
encontró dicha bacteria. Los resultados obtenidos en el análisis de 30 muestras
de leche artesanal, comprueban que 10/15 lecherías del municipio de
Chiquimula, que representa un 67% de las lecherías analizadas, distribuyen
leche no apta para consumo humano ya que presenta Escherichia coli en los
dos muestreos realizados, aunque no presenten Escherichia coli O157:H7 (42).
2
II.
INTRODUCCION
En la cabecera departamental de Chiquimula la leche de vaca obtenida
artesanalmente, es uno de los principales alimentos que forman parte de la dieta
de la población, siendo los niños y ancianos quienes la consumen mayormente.
A través de múltiples estudios se ha encontrado que algunas cepas de
Escherichia coli causan enfermedades gastrointestinales que van desde diarrea
leve y acuosa hasta un cuadro de diarrea sanguinolenta (1-7).
Entre
las
cepas
de
Escherichia
coli
que
causan
enfermedades
gastrointestinales en el ser humano se encuentra Escherichia coli O157:H7 (1-2,
8). Esta cepa se encuentra asociada principalmente a diarrea sanguinolenta con
dolor abdominal y es la cepa de Escherichia coli que se transmite en una mayor
proporción por el consumo de alimentos o agua contaminada. La leche es un
alimento al cual se le asocia en la transmisión de esta bacteria (9-12).
En Guatemala se han realizado estudios buscando la presencia de Escherichia
coli O157:H7, uno de ellos estudió la prevalencia de esta bacteria en carne de
ventas callejeras de la zona 4 del departamento de Guatemala (13); y el otro
posteriormente, realizó una identificación de la bacteria mencionada en frutas y
verduras congeladas para exportación (14). En ninguno de estos estudios se
encontró Escherichia coli O157:H7 (13-14). No se han reportado aún, en
Guatemala, datos que indiquen si la leche artesanal es apta para el consumo
humano, utilizando como parámetro de evaluación recuentos de microorganismos
indicadores de contaminación fecal.
Solamente existe un estudio en Guatemala que indica la prevalencia de
Escherichia coli O157:H7, en muestras de heces, realizado en el Instituto
Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS) zona 7, en donde fueron cultivas 2210
muestras y se obtuvo un total de 257 positivos, por lo que podría suponerse que
en los alimentos existiera una prevalencia parecida (2, 15).
3
La finalidad de este estudio fue dar a conocer si Escherichia coli O157:H7 se
presenta en leches artesanales distribuidas en la cabecera departamental de
Chiquimula y además identificar si estas son aptas para el consumo humano por
medio de la determinación de Escherichia coli como indicador de contaminación
fecal.
La determinación de Escherichia coli se realizó por la técnica de Tubos
Múltiples o Número Más Probable y Escherichia coli O157:H7 por el método oficial
para aislamiento de esta bacteria en alimentos, publicado en el Manual de
Procedimientos Bacteriológicos (BAM), de la Administración de Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos de América (16-19).
4
III.
ANTECEDENTES
A. Generalidades de Escherichia coli
Escherichia coli es una de las especies bacterianas mejor
estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino
también como sujeto y modelo de investigaciones metabólicas,
genéticas, poblacionales y de diversa índole. Forma parte de la familia
Enterobacteriaceae, la cual está integrada por bacilos gram negativo no
esporulados, móviles con flagelos perítricos o inmóviles, aerobiosanaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en
medios simples con o sin agregado de cloruro de sodio (NaCl),
fermentadores
y
oxidativos
en
medios
con
glucosa
u
otros
carbohidratos, catalasa positivo, oxidasa negativo, reductores de nitratos
a nitritos.
Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia
distribución en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales.
En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patología humana
puede
cuantificarse
constatando
que
constituyen
el
50%
aproximadamente de todos los aislamientos clínicamente significativos
en los laboratorios microbiológicos, y hasta el 80% de todos los bacilos
gran negativo identificados (1-2, 13, 15, 20-23).
Escherichia coli es miembro del género Escherichia. Incluye
microorganismos generalmente móviles, que producen ácido y gas a
partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros
azúcares. Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de
Vogues-Proskauer. Son inhibidos por cianuro de potasio (KCN) e
incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono
y energía, pero sí en caldo acetato. Son ácido sulfhídrico (H2S), ureasa y
fenilalanina
negativos,
pero
en
general
son
indol
positivos
y
5
decarboxilan la lisina. Se clasifican en más de 170 serogrupos O según
las características antigénicas de sus lipoproteínas, y en serotipos por la
combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes
en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados
para su clasificación o identificación (5,6).
E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del
recién nacido, y establece con el hospedero una relación estable de
mutuo beneficio. Como integrante de la microbiota normal del intestino
del hombre y de muchos animales, se le considera un microorganismo
indicador de contaminación fecal cuando está presente en el ambiente,
agua y alimentos, junto con otros relacionados bajo la denominación de
bacterias coliformes. Estas son enterobacterias que pertenecen al
género Escherichia y a otros como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter
o Serratia, y que tienen en común la capacidad de fermentar la lactosa
en un lapso no mayor de 48 horas, con producción de ácido y gas. Son
microorganismos de gran ubicuidad y capacidad de proliferación, y a la
vez de fácil cultivo e identificación, y por lo tanto muy útiles como
indicadores de contaminación, pero no son enteropatógenos como
grupo (como tampoco lo es E.coli), y por lo tanto su presencia en
alimentos, ambiente o pacientes no certifica la etiología de una infección
intestinal o un brote de enfermedad transmitida por alimentos (ETA) (9,
23).
La bacteria Escherichia coli puede ser causa de enfermedad
endógena en pacientes debilitados o en situación de alteración de la
pared intestinal (peritonitis, sepsis, etc.), pero las infecciones entéricas
provocadas por esta bacteria no son causadas por las cepas que
habitan normalmente el intestino, sino por patógenos que se transmiten
6
por vía feco-oral de persona a persona o a través del agua y alimentos
(24, 25).
Existen cepas de E. coli capaces de producir un amplio espectro de
enfermedades, como infección urinaria, septicemia, meningitis o
enfermedad diarreica. Los tipos causantes de diarrea se clasifican en:
enterotoxigénico (ETEC), enteropatogénico (EPEC), enteroagregativo
(EAggEC), enterohemorrágico (EHEC), enteroinvasivo (EIEC) y de
adherencia difusa (DAEC) (4, 24, 26-28).
B. Características de Escherichia coli O157:H7
Su nombre se origina del antígeno somático (O) e identificado como
157 y el séptimo antígeno flagelar (H) identificado. El antígeno (O) se
deriva de la pared celular y el (H) del flagelo, que se encuentra
solamente en especies móviles (4, 6-7).
E.coli O157:H7 ó E.coli O157 no móvil, pertenece al grupo de E.coli
enterohemorrágicas, sin constituir la única variedad serológica que
integra el grupo. Otras enterohemorrágicas que han afectado a
personas en varios países son las serovariedades O26:H11, O111:H8,
O103:H2, O113:H21 y O104:H21 (4, 25, 28).
Estudios dirigidos hacia la caracterización de E. coli serotipo
O157:H7 revelan que los marcadores bioquímicos de dicho patógeno
son significativamente diferentes a los de E. coli genérico. E. coli
O157:H7 es diferente a otros tipos de E.coli, no solo desde el punto de
vista clínico y epidemiológico sino que en algunas características
bacteriológicas. Una combinación de las reacciones a ß-glucoronidasa,
sorbitol, rafinosa y dulcitol puede separar preliminarmente este serotipo
7
del resto de los E. coli (25).
Estos análisis incluyen una reacción
negativa para la ß-glucoronidasa y sorbitol, y una reacción positiva para
el análisis de rafinosa y dulcitol. La fermentación de sucrosa fue
observada en el 87% de las cepas de E. coli O157:H7, en contraste a
las de E. coli que solo fermentaron un 42-54%. La mayoría de las cepas
(87%) fermentan dulcitol y sucrosa en un periodo de 24 horas, mientras
que el 89% no fermentaron ramnosa en este periodo de tiempo (6, 28).
Se ha reportado que E. coli es un bacilo gram negativo que fermenta
lactosa, que tiene la capacidad de producir ß-glucoronidasa, y cerca del
96% producen esta enzima. E. coli O157:H7 es la excepción ya que ésta
no fermenta sorbitol. Desde este punto de vista, el sorbitol puede
utilizarse como agente en un medio diferencial para la detección de
otros patógenos como Escherichia hermannii. Ésta no solo es ßglucoronidasa negativo sino que es incapaz de fermentar sorbitol como
E. coli O157:H7. En adición esta cepa ha reaccionado con el antisuero
O157, lo que puede llevar fácilmente a confundir con el serotipo
O157:H7. La diferencia entre ambos tipos de E. coli es que en medios
de cultivos diferenciales de sorbitol como el antisuero-sorbitol H7 y
sorbitol-MacConkey arrojan resultados de coloración diferente, siendo
las colonias de E. hermanii de color amarillo y colonias típicas de E. coli
O157:H7 de color rosa pálido (25).
E. coli O157:H7 produce factores citotóxicos a células Vero las
cuales se les han nombrado Verotoxinas o toxinas Shiga, esto por su
similaridad a la toxina Shiga que produce Shigella dysenteriae tipo 1.
Este patógeno produce cantidades elevadas de dichas toxinas. Además
existen otros serogrupos de E. coli que producen Verotoxinas (25). Se
ha descubierto la existencia de al menos dos VT-I y VT-II, las cuales son
estructuralmente similares (29). Estudios sobre el efecto de la
temperatura en la producción de toxinas comprobaron que no hay efecto
8
alguno en la síntesis de la toxina. En otro estudio la producción de la
toxina ocurrió a temperaturas de 10°, 12° y 37°C. Por otra parte una
cantidad menor de toxina se detectó a una temperatura de 21°C.
Información
epidemiológica
indica
que
las
complicaciones
de
enfermedades tales como el Síndrome Urémico Hemolítico y la Púrpura
Trombótica
Trombocitopénica
son
mayormente
asociadas
a
la
Verotoxina tipo II. La producción de toxinas varía con el medio de
cultivo, tipo de alimento, temperatura, pH y concentración de oxígeno.
En adición a las verotoxinas, este patógeno tiene un plásmido de gran
tamaño, siendo esta característica de gran ayuda en la identificación de
la cepa patogénica. La presencia del patógeno en los bovinos al
momento de la matanza, marca una gran necesidad en incorporar
estrategias para minimizar estos problemas antes o durante este
proceso (30, 31).
Estudios han demostrado que E. coli O157:H7 crece en un amplio
rango de temperatura. El mismo puede sobrevivir a temperaturas de
congelación y rangos de pH desde 4.4 a 9. La temperatura óptima de
crecimiento del patógeno es 37°C, aunque se ha observado crecimiento
a temperaturas de 7 a 44.5° C. El proceso de pasteurización o cocción
adecuada del alimento a 70° C por 2 minutos elimina el patógeno (6,
10).
C. Reservorios y fuentes
El patógeno se encuentra típicamente en el ganado vacuno
saludable, lo que hace difícil el control de este. Se ha demostrado que el
75% del ganado lechero y el 63% de ganado vacuno de engorde son
positivo para E. coli O157:H7 (8, 27, 31).
9
La prevalencia del patógeno puede ser menor o mayor dependiendo
de la época del año. Se ha comprobado que la época de mayor
incidencia de enfermedades en humanos asociadas a este patógeno
ocurre durante los meses de verano, la misma época que la prevalencia
de E. coli O157:H7 en las heces del ganado bovino es mayor (32).
El tiempo promedio en el cual este patógeno se mantiene en el
sistema gastrointestinal de los rumiantes es de 30 días, aunque en
algunos animales la bacteria puede estar presente hasta un año o más.
Los factores que contribuyen a la presencia de la bacteria en rumiantes
se desconocen, pero se discute la habilidad de la misma al colonizar un
sitio en particular en el sistema gastrointestinal. Estudios han
demostrado que el colon es el lugar en el sistema gastrointestinal donde
principalmente se aloja el patógeno en rumiantes adultos (27).
La mayor incidencia de E. coli O157:H7 se encuentra en el ganado
vacuno joven, de acuerdo a una investigación realizada en Wisconsin en
1996 (33). El uso de antibióticos puede alterar la microbiota de bovinos y
permitir que el patógeno se multiplique en el tracto digestivo. Además de
permitir que E. coli O57:H7 adquiera resistencia a antibióticos tales
como la estreptomicina, sulfisoxazole y tetraciclina, permite que tenga
una ventaja competitiva sobre la microbiota normal. Se ha reportado un
aumento en E. coli O157:H7 resistentes a antibióticos en humanos (33).
Se ha comprobado que la administración de niveles subterapeúticos de
antibióticos en animales puede ser un factor que contribuya a la
resistencia de este patógeno a los medicamentos indicados en los
humanos (33).
Otro factor que puede ayudar a la distribución del patógeno en el
ambiente son las aves silvestres ya que durante el vuelo estas pueden
10
esparcir el patógeno a grandes distancias, al llevar partículas de heces
en las plumas o patas. Esto convierte estas aves en un peligroso
vehículo de transmisión (32). La dieta del animal y los cambios en la
misma son otros factores que pueden influir para que el patógeno
persista (33).
Los bovinos parecen constituir la fuente principal de este agente
patógeno, que es transmitido al hombre por el consumo de alimentos
contaminados, como carne, leche y los productos que de ellos se
derivan. La infección puede también resultar de una contaminación fecal
del agua y de varios alimentos, o de una contaminación cruzada durante
la preparación de los mismos (6, 10-11, 34).
D. Alimentos implicados y transmisión
Investigaciones de brotes han demostrado que E. coli O157:H7
puede ser transmitido por alimentos, agua o transmisión de persona a
persona, por la vía fecal-oral (35). Productos de origen bovino, tales
como carne no cocida adecuadamente o leche cruda han sido
asociados a este patógeno (9, 17, 20-21). La contaminación con dicho
patógeno
en
alimentos
no
asociados
a
este
puede
producir
contaminación cruzada con productos o superficies que contenían la
bacteria (12, 34).
También se ha documentado la infección vehiculada por carne de
pavo, salami, leche, yoghurt, mayonesa, ensaladas, vegetales crudos y
agua. La transmisión de persona a persona también ha sido demostrada
La dosis infectante mínima es baja; se estima entre 102 y 103 bacterias
por gramo o mililitro del alimento (36).
11
E. Patogénesis
Los factores implicados en la patogénesis de Escherichia coli O157:H7
son:
1.
Adherencia a los enterocitos del colon mediante una fimbria
específica, codificada por un plasmido de virulencia (37).
2.
Adherencia íntima, con alteración del citoesqueleto de la célula
hospedero, que está mediada por la proteína de membrana externa
intimina, codificada por genes cromosomales y el intercambio de
señales implicadas en este fenómeno (37).
3. Producción de citotoxinas, las cuales a nivel local producen inhibición
de la síntesis proteica y daño celular directo, lo que da como resultado
necrosis hemorrágica de las vellosidades intestinales, con escasa
infiltración de polimorfonucleares y que explica la diarrea con sangre.
Estas toxinas se traslocan a nivel de la mucosa hacia el torrente
sanguíneo, y puede unirse a receptores
GB3
presentes
en
la
membrana de glóbulos rojos, a nivel del endotelio renal, plaquetas y
Sistema Nervioso Central (SNC), produciendo daño sistémico que se
traduce clínicamente en el Síndrome Hemolítico Urémico (SHU), que se
caracteriza por anemia hemolítica microangiopática, fallo renal agudo y
trombocitopenia (30-31, 37).
4. Otros factores de virulencia: toxina EAST 1 (toxina termoestable de
cepas enteroagregativa), enterohemolisina, mecanismo de transporte
de hierro, LPS (lipopolisacárido) (37).
12
ECEH puede producir desde infecciones asintomáticas, cuadros de
diarrea acuosa (10% de los casos), hasta el cuadro clásico de diarrea
con sangre y moco (90% de los casos), la que es precedida por 1 a 2
días de deposiciones acuosas, dolor abdominal, fiebre de corta
evolución y vómitos. El periodo de incubación es de 3 a 4 días, y el
cuadro de diarrea con sangre se prolonga por 4 a 10 días. La excreción
bacteriana posterior a la resolución del episodio se mantiene por 17 a 20
días (31-32, 37).
Las complicaciones se presentan en un 5 a 10% de los casos , y
corresponden a prolapso rectal, apendicitis, intususpección, cistitis
hemorrágica, colecistitis, y alteraciones del SNC, siendo el SHU la
complicación más severa y que se observa hasta en un 7% de los casos
según lo observado en situaciones de un brote. La letalidad varía en
diferentes series entre 1 al 10%. El pronóstico se relaciona directamente
con la cuantía del daño intestinal, cuando este es más intenso se libera
una mayor cantidad de toxinas (diarrea con sangre) y se caracteriza por
iniciarse 2 a 14 días después del comienzo de la diarrea, con palidez de
piel y mucosas, oliguria y edema, y hemorragias cutáneas (2, 22, 30).
F. Epidemiología
Se ha descrito como un patógeno emergente, aunque no se sabe si
previamente había sido subdiagnosticada o es verdaderamente un
patógeno nuevo. Se describió por
primera
vez
en
un
brote
de
gastroenteritis en Estados Unidos de América, con presentación de
cuadros de diarrea con sangre y de SHU, a comienzo de los años 80.
En este brote, se demostró tanto en los pacientes como en la carne de
hamburguesas de una cadena de restaurantes de comida rápida, la
presencia de E. coli serogrupo O157, serotipo H7. Actualmente se han
13
descrito 10 serogrupos y 55 serotipos de ECEH, pero los más comunes
son O157:H7, O26:H11, O26:H32, O111:H8 y O111:H30 (38-40).
ECEH es una causa poco frecuente de diarrea en Latinoamérica (2 a
3% del total de episodios), pero es causa importante de diarrea con
sangre. Se presenta generalmente en forma de casos esporádicos, y
también pueden ocurrir brotes, lo cual se ha documentado mejor en
países industrializados que mantienen programas de vigilancia de estas
infecciones (23).
Tiene una incidencia estacional con un aumento de casos en
primavera y verano. En Chile es la primera causa de diarrea con sangre
en niños menores de 5 años (38%),y es el principal agente etiológico de
SHU (91%). La tasa de SHU en Chile es de 3.0 – 4.2 por 100.000 casos.
Argentina presenta la tasa más alta del mundo de SHU asociado a
ECEH, con 21.7 por 100.000 casos. En ambos países, a menudo los
serotipos más frecuentemente aislados en diarrea son diferentes a
O157:H7, pero éste es el que más se asocia a la aparición de SHU (3840).
La infección por E. coli verotoxigénica parece ser de distribución
universal, pero su prevalencia solamente se conoce con cierto detalle en
los Estados Unidos, Canadá, Argentina y Europa Occidental, ya que en
el resto de países no ha sido estudiada sistemáticamente (23, 38).
En Costa Rica, en febrero-marzo 1996, el Hospital Nacional de Niños
informó de cuatro casos de síndrome hemolítico urémico, en menores
de dos años de edad, con antecedentes de ingestión de carne de pollo,
hamburguesas y tortas de carne. Se aisló E. coli O157:H7. Los
pacientes no tenían vinculación entre si y residían en comunidades
alejadas unas de otras. No se ha registrado otros casos (23).
14
El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) estima que en
Estados Unidos de América se presentan cada año de 10,000 a 20,000
casos de diarreas por este agente, de 73,000 casos de infección se
reportan 61 muertes. Además reportó para el año 1996 una incidencia
de 2.7, para 1997 de 2.3, 1998 de 2.8, 1999 de 2.1 y 2.9 en el 2000.
Para el año 1999 reportó una incidencia de 4.57 por 100,000 en niños
de 1-4 años (23).
En Japón, desde finales de mayo, en Hiroshima y Oakayama, y más
recientemente en Sakay cerca de Osaka, se han presentado más de
5,000 casos con seis defunciones por E.coli O157:H7 (23).
No existen datos a cerca de la incidencia de Escherichia coli O157:H7
en alimentos en Guatemala, solamente existe un estudio que indica la
prevalencia de esta bacteria, en muestras de heces, realizado en el
Instituto Guatemalteco de Seguridad Social (IGSS) zona 7, en donde
fueron cultivadas 2210 muestras de heces y se obtuvo un total de 257
coprocultivos positivos (15).
En Guatemala no se han reportado datos de estudios que determinen
coliformes totales, fecales y Escherichia coli en leche de origen
artesanal (no pasteurizada). A nivel mundial, en Colombia, se han
realizado estudios en donde se utilizaron los recuentos de coliformes
como indicadores de calidad de leche cruda, encontrando que la
presencia de coliformes sirve como evaluador del grado de limpieza de
las manos de operarios, limpieza y desinfección de la piel de los
pezones y pezoneras (40).
15
G. Leche
1. Conceptos
a. Leche
Es el producto integro no adulterado ni alterado y sin calostro, del
ordeño regular higiénico, completo e interrumpido de las hembras
mamíferas.
b. Leche artesanal
Es la leche obtenida de manera artesanal y distribuida para su
consumo crudo.
c. Leche cruda
Leche que no ha sido llevada a una temperatura mayor de 40°C (41).
d. Sala de ordeño
Establecimiento destinado a la obtención de leche mediante
ordeño manual o mecánico (41).
2. Composición
Los principales componentes de la leche son agua, grasa,
proteína y lactosa (29). Del 80-85% de la proteína existente en la
leche se halla en forma de caseínas, el resto lo constituyen las
proteínas del suero de leche como lo son la beta-lactoglobulina y
alfa-lactalbúmina, y proteínas procedentes de la sangre tales como la
seroalbúmina y las inmunoglobulinas.
La composición de la leche varía de acuerdo a la raza de la vaca
de la cual proviene dicha leche (29). La leche posee constituyentes
antimicrobiales como la lactoferrina, conglutinina y el sistema de
16
lactoperoxidasa, además de bacteriocinas que producen otros
microorganismos presentes en la leche cruda (42).
3. La leche como vehículo de transmisión de agentes infecciosos
Su elevada actividad de agua, su pH mediano (6.4-6.6) y su
abundante aporte de nutrientes hacen de la leche un excelente medio
para el crecimiento microbiano (29).
4. Zonas y locales destinados a la producción de leche
Las zonas y locales destinados a la producción de leche son de dos
tipos, uno es en fincas en donde se tiene una cantidad grande de
cabezas de ganado bovino destinado a la producción de leche, y otro
son las viviendas en donde se tiene una cantidad mínima de cabezas de
ganado, que van desde una hasta diez aproximadamente (43).
5. Ordeño
Las instalaciones para el ordeño deben contar con condiciones
higiénico-sanitarias, estructura y equipo que permitan garantizar la
inocuidad de la leche y además cumplir con:
a. Los corrales de espera y las salas de ordeño deben tener piso
cementado de fácil limpieza con un desnivel no más del uno
por ciento (1%) hacia el drenaje que permita evacuar
excrementos y aguas de lavado.
b. Las salas de ordeño deben contar con paredes con un mínimo
de altura de un metro y medio (1.50 metros) de color claro.
Los techos, construidos de material que permita su limpieza y
17
que garantice la inocuidad de la leche. Deberán contar con
condiciones adecuadas de ventilación e iluminación.
c. Contar con agua potable o fuente de agua apta para consumo
humano, para realizar actividades de lavado y desinfección.
d. Contar con servicios sanitarios y duchas para el personal, los
cuales deberán estar separados de la sala de ordeño.
e. Contar con lavamanos en el servicio sanitario y en la sala de
ordeño.
f. Mantener un control de limpieza y desinfección del equipo de
ordeño, herramientas, utensilios y de protección personal.
g. El estiércol procedente de los corrales de espera y otras áreas
de la sala de ordeño debe ser removido y evitar ser colocado
en las cercanías de las instalaciones de la sala de ordeño. El
sistema empleado para el tratamiento y disposición del
mismo, deberá hacerse mediante un método físico, biológico,
y en caso de utilizar químicos, deben ser aprobados y que no
causen daño al medio ambiente.
h. Contar con un área específica para tarimas de material
inoxidable y de fácil limpieza para la colocación de los tambos
o bidones lavados y desinfectados que se utilizan para el
transporte de leche cruda.
i. Mantener registros actualizados de controles de buenas
prácticas de ordeño (44).
j. Mantener un programa de control de plagas.
k. Mantener implementado el manual de buenas prácticas
pecuarias y de ordeño.
l. Mantener control de limpieza y desinfección de equipo de
protección personal.
m. Mantener registros actualizados de la cantidad, fecha de
ingreso y egreso de leche de la sala de ordeño.
18
n. Mantener registros actualizados de control de las lecturas de
temperatura de la leche en los tanques térmicos.
o. Los recipientes y maquinaria utilizados en la recolección,
enfriamiento, filtración y almacenamiento de leche, deben ser
de acero inoxidable (44).
6. Almacenamiento y transporte de la leche
El área de almacenamiento de leche cruda debe cumplir con:
a. Independencia de otras áreas y uso exclusivo para este fin.
b. Piso cementado de fácil limpieza con un desnivel un
máximo del uno por ciento (1%) hacia el drenaje para
evacuar agua de limpieza y residuos de leche (44).
c. Paredes y techos construidos de material que permita su
limpieza y no sea fuente de contaminación de la leche, así
como
las
condiciones
adecuadas
de
ventilación
e
iluminación.
Para el transporte de la leche cruda debe contarse con:
a. Sistema de refrigeración que permita mantener la leche
cruda a una temperatura de 2 a 10 grados centígrados.
b. Cuando el medio de transporte no cuente con sistema
de refrigeración, es necesario que esté provisto de una
estructura que proteja el producto de cualquier fuente
de contaminación y de los rayos solares (44).
7. El sector lácteo en el municipio de Chiquimula.
El municipio de Chiquimula, limita al norte con el municipio de
Zacapa, al sur con los municipios de San José La Arada y San Jacinto;
al este con los municipios Jocotán, San Juan Ermita y San Jacinto y al
19
oeste con los municipios de San Diego y Cabañas, Zacapa. Su
extensión territorial es de 372 kilómetros cuadrados. La ciudad se
encuentra a una altura de 423.86 m.s.n.m. Latitud 14º 47' 58”, longitud
89º 32' 37”, su clima es tropical seco (45).
Según la Cámara de Productores de Leche de Guatemala, las
principales regiones productoras de este alimento en el país son la
Región Sur-Oriente (37%), Nor-Oriente (19%), Central (16%) y otras
regiones (28%), correspondiendo Chiquimula a la región Nor-oriente
(46).
En Guatemala el 92% del ganado bovino se encuentra en fincas y el
otro 8% en viviendas. En el departamento de Chiquimula, según el
censo agropecuario realizado en el año 2003 por el Ministerio de
Agricultura y Ganadería (MAGA), el 94% se encuentra en fincas y el 6%
en viviendas. Además, se estima que en este departamento hay
aproximadamente 50,000 cabezas de ganado bovino, de las cuales el
71% son hembras (47).
El ordeño en algunas lecherías en el municipio de Chiquimula se
lleva a cabo dos veces al día, por la mañana y por la noche. La
obtención de leche en establos se realiza de forma manual, ya que se
trata de una pequeña cantidad de bovinos. La temperatura oscila entre
20-30°C en invierno, y en verano puede llegar hasta 40°C. La leche
obtenida del ordeño matutino es distribuida en el día y la obtenida en el
ordeño nocturno es almacenada en la mayoría de lugares sin
refrigeración para distribuirla el día siguiente.
La leche es almacenada en recipientes de aluminio con tapadera
hasta su distribución. Esta leche se distribuye en los mismos recipientes
20
y transportada en automóvil hasta el lugar donde será distribuida al
consumidor 1 .
1
Datos obtenidos mediante observaciones realizadas por la tesista.
21
IV.
JUSTIFICACIÓN
En el departamento de Chiquimula, un gran porcentaje de la población
distribuye leche cruda, como fuente principal de ingresos; sin conocimiento de
buenas prácticas de manufactura, ni de procesos de pasteurización, lo que
incide en la mala calidad del producto, ya que no está sujeta a ningún tipo de
control de calidad representando un riesgo para la población que la consume
diariamente (9).
La leche es un producto accesible a los consumidores de bajos recursos, y
representa una fuente de proteínas relativamente barata, sin embargo, la mala
calidad higiénica de ésta expone a los consumidores a riesgos de infección
muy altos, debido a que es un excelente medio para el crecimiento bacteriano,
teniendo consecuencias dramáticas para la población al verse expuesta a
enfermedades ligadas a su situación de pobreza, lo que debilita sus defensas
naturales frente a estas infecciones (29).
A pesar de que la incidencia de Escherichia coli O157:H7 es muy baja, la
tasa de mortalidad que produce la bacteria en pacientes afectados es bastante
elevada (1-10%) (2,22,30), lo que aumenta la importancia de encontrar un
vehículo de transmisión de la bacteria en el municipio de Chiquimula.
En Guatemala existen datos que indican que Escherichia coli O157:H7 es
asociada a patologías gastrointestinales (15). Se han realizado investigaciones
en este país, que evalúan la presencia de esta bacteria en alimentos como
carne, frutas y vegetales, no habiéndose obtenido aún resultados positivos (1314).
Ya que Escherichia coli O157:H7 es un patógeno importante para la salud
pública y que las investigaciones que se han llevado a cabo para conocer el
vehículo transmisor de la misma no han tenido resultados positivos en este
22
país (13-14), es necesario realizar la determinación de la bacteria en leche
cruda, para conocer si este alimento es un vehículo transmisor de la misma en
el municipio de Chiquimula.
Además se hace necesario establecer la presencia de Escherichia coli
como indicador de la calidad sanitaria de la leche analizada en el mismo
municipio.
23
V.
OBJETIVOS
A. General
Determinar la presencia de Escherichia coli y Escherichia coli
O157:H7 en muestras de leche obtenidas artesanalmente y distribuidas
en 15 lecherías de la cabecera departamental de Chiquimula.
B. Específicos
1. Demostrar la presencia de E. coli O157:H7 en leche artesanal
proveniente del municipio de Chiquimula.
2. Comprobar a través de la presencia de E. coli y E. coli O157:H7 que
las leches muestreadas y distribuidas artesanalmente no son aptas
para el consumo humano.
24
VI.
HIPÓTESIS
Por ser un estudio descriptivo, transversal, no se formula hipótesis.
25
VII.
MATERIALES Y MÉTODOS
A. Universo
Leches de vaca obtenidas artesanalmente y distribuidas en la cabecera
departamental de Chiquimula.
B. Muestra
Treinta muestras de leche artesanal correspondientes a 15 lecherías de la
cabecera departamental de Chiquimula, analizando 2 muestras por lechería.
C. Materiales
1. Equipo
a. Asa de nicromo en argolla
b. Asa de nicromo en punta
c. Autoclave
d. Campana bacteriológica
e. Estufa
f. Hielera eléctrica
g. Horno
h. Incubadora 35-37°C
i. Mechero Bunsen
j. Pipeteador
k. Refrigeradora 2-5°C
2. Cristalería
a. Beakers de 100 y 250 mL
b. Erlenmeyers 100, 250, 500 mL
c. Frascos Masson estériles
d. Pipetas serológicas 1, 5 y 10 mL
e. Probetas de 10 y 100 mL
f. Tubos de ensayo con tapón de rosca de 10 cm de alto
26
3. Medios de Cultivo y Reactivos
a. Agua peptonada al 0.1%
b. Agar MacKonkey sorbitol, modificado con telurito de potasio y
cefixime (TC SMAC)
c. Agua destilada
d. Alcohol al 70%
e. Caldo bilis verde brillante
f. Caldo de enriquecimiento para E. coli enterohemorrágica
g. Caldo E. coli
h. Caldo lauril sulfato
i. Prueba de aglutinación en látex, para E. coli O157:H7
4. Otros
a. Cajas de petri plásticas simples estériles
b. Recipientes de plástico estériles
D. Procedimiento
1. Recolección de muestras
Se tomaron dos muestras de cada una de las 15 lecherías
según el plan de muestreo reconocido internacionalmente y
definido por la ICMSF (48). Se muestreó aproximadamente 250
mL de leche que fueron vertidos en un recipiente plástico estéril y
se transportó posteriormente en una refrigeradora eléctrica de
automóvil hacia la ciudad de Guatemala según norma CODEX
CAC/CRP 57-2004 (49).
La información a cerca de los locales, zonas, la forma
de obtención de la leche, además de la forma en que se
27
transporta y almacena, se obtuvo por medio de la observación en
diferentes lugares en donde se produce leche en el departamento
de Chiquimula.
2. Proceso analítico
a. De las dos muestras tomadas de cada lechería, una se llevó al
Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos, LAFYM,
en donde se realizó la determinación de Escherichia coli por el
método de tubos múltiples basado en el Manual de Análisis
Bacteriológicos (BAM) método recomendado para análisis
microbiológico de leche, según norma COGUANOR 34 046 h23
(16, 18).
b. La segunda muestra tomada de cada lechería se llevó a un
Laboratorio privado situado en el municipio de Chiquimula, para
la determinación de E. coli O157:H7 que se realizó de la siguiente
manera: se midió 25 mL de la leche y se mezclaron con 225 mL
del caldo de enriquecimiento para E. coli enterohemorrágica y se
incubó por 24 horas a 37±2°C (16).
c. Después de la incubación, se agregaron 0.1 mL del caldo que
contenía la muestra, sobre el agar Mackonkey sorbitol telurito
cefixime. Se sembró por duplicado.
d. Se incubaron las cajas por 16-24 hrs. A 35-37°C.
e. Se buscó colonias sorbitol negativo (color neutral o gris), con un
centro grisáceo y de 1-2 mm de diámetro.
f.
Se tomó una colonia sorbitol negativo y se colocar sobre una gota
de la prueba de látex de E. coli O157:H7.
g. Se mezcló por unos minutos, rotando la lámina.
28
h. Se observó la aglutinación para confirmar la presencia de
Escherichia coli O157:H7 (16, 17).
E. Diseño estadístico
1. Muestra
Treinta muestras de leche artesanal correspondientes a 15 lecherías
de la cabecera departamental de Chiquimula, analizando 2 muestras por
lechería con una diferencia en tiempo de una semana, aumentando así
la probabilidad de encontrar la bacteria sujeto de investigación. Las 15
lecherías fueron elegidas al azar.
2. Diseño del estudio
Descriptivo transversal por conveniencia.
3. Tipo de muestreo
No probabilístico
4. Variables de Interés
a. Determinación de E. coli
b. Determinación de E. coli O157:H7
5. Análisis de resultados
a. Porcentaje de leches muestreadas no aptas para el consumo
humano por presencia de E. coli.
b. Porcentaje
de
enterohemorrágica.
muestras
con
presencia
de
E.
coli
29
VIII.
RESULTADOS
En 10/15 muestras se comprobó la presencia de Escherichia coli, lo que
indica, que un 67% de las muestras analizadas no es apta para consumo
humano (tabla 1, gráfico 1), sin embargo en ninguna de las 15 muestras de
leche artesanal analizada se encontró Escherichia coli O157:H7.
Tabla No. 1 Resultados obtenidos durante el primer muestreo de la
investigación.
No. de
Recuento
Recuento
Recuento
Presencia/Ausencia
muestra
Coliformes
Coliformes
Escherichia
de Escherichia coli
Totales
Fecales
coli
O157:H7**
(NMP/mL)
(NMP/mL)
(NMP/mL)*
1
2,400
20
20
Ausente
2
2,400
2,400
2,400
Ausente
3
460
<3
<3
Ausente
4
2,400
2,400
2,400
Ausente
5
15
<3
<3
Ausente
6
43
<3
<3
Ausente
7
<3
<3
<3
Ausente
8
2,400
2,400
2,400
Ausente
9
2,400
2,400
2,400
Ausente
10
2,400
2,400
2,400
Ausente
11
1,100
28
28
Ausente
12
4
4
4
Ausente
13
<3
<3
<3
Ausente
14
15
9
9
Ausente
15
1,100
210
210
Ausente
*Resultados igual o mayor a 3 NMP/mL, indican presencia de Escherichia coli.
**Debe estar ausente por ser un microorganismo patógeno.
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
30
Gráfico No. 1 Porcentaje de muestras aptas y no aptas para consumo humano
por presencia de Escherichia coli, en el primer muestreo de la investigación.
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
En la segunda fase de la investigación, 14/15 muestras analizadas
presentan Escherichia coli, lo que indica que el 93% de estas muestras no son
aptas para el consumo humano (tabla 2, gráfico 2), no encontrándose
Escherichia coli O157:H7 en las muestras analizadas.
31
Tabla No. 2 Resultados obtenidos durante el segundo muestreo de la
investigación
No. de
Recuento
Recuento
Recuento
Presencia/Ausencia
muestra
Coliformes
Coliformes
Escherichia
de Escherichia coli
Totales
Fecales
coli
O157:H7**
(NMP/mL)
(NMP/mL)
(NMP/mL)*
1
2,000
1,000
1,000
Ausente
2
2,000
2,000
2,000
Ausente
3
2,000
2,000
2,000
Ausente
4
2,000
1,000
1,000
Ausente
5
2,000
20
20
Ausente
6
1,000
<3
<3
Ausente
7
2,000
200
200
Ausente
8
2,000
2,000
2,000
Ausente
9
2,000
2,000
2,000
Ausente
10
2,000
2,000
2,000
Ausente
11
1,000
500
500
Ausente
12
500
500
500
Ausente
13
9
9
4
Ausente
14
2,000
2,000
2,000
Ausente
15
2,000
2,000
2,000
Ausente
*Resultados igual o mayor 3 NMP/mL, indican presencia de Escherichia coli.
**Debe estar ausente por ser un microorganismo patógeno.
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
32
Gráfico No. 2 Porcentaje de muestras no aptas para consumo humano por
presentar Escherichia coli, en el segundo muestreo de la investigación.
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
De las 30 muestras analizadas en los dos muestreos, 24 presentaron
Escherichia coli, comprobando que el 80% de las muestras analizadas, no son
aptas para el consumo humano (tabla 1 y 2).
10/15 (67%) lecherías distribuyen leche artesanal no apta para el consumo
humano (tabla 3, gráfico 3).
33
Tabla No. 3 Número de muestras no aptas para el consumo humano por lechería
analizada.
No.
No. de Muestras
de Lechería
No Aptas
1
2
2
2
3
1
4
2
5
1
6
0
7
1
8
2
9
2
10
2
11
2
12
2
13
1
14
2
15
2
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
34
Gráfico No. 3 Porcentaje de lecherías que distribuyen leche artesanal no apta
para consumo humano por presentar Escherichia coli.
Fuente: Resultados obtenidos en el Laboratorio de Análisis Fisicoquímicos y Microbiológicos.
35
IX.
DISCUSION DE RESULTADOS
En el primer muestreo se comprobó, que 10/15 muestras no son aptas para
el consumo humano ya que poseen un valor mayor a 3 NMP/mL de Escherichia
coli. Según la FDA en el Bacteriological Analytical Manual, valores mayores a
3NMP/mL indican presencia de la bacteria analizada (tabla 1), lo que demuestra
que el 67% de las muestras se encuentran contaminadas con E. coli (gráfico 1).
En el segundo muestreo se obtuvo 14/15 leches contaminadas con E.coli , lo
que comprueba que el 93% por ciento de las leches analizadas no son aptas
para consumo (tabla 2, gráfico 2).
Los resultados obtenidos en el análisis de 30 muestras de leche artesanal
en dos muestreos realizados, comprueban que 10/15 lecherías del municipio de
Chiquimula, que representa un 67% de las analizadas, distribuyen leche no apta
para consumo humano ya que presentan Escherichia coli aunque no
Escherichia coli O157:H7. Según ANMAT en su Guía de interpretación de
resultados microbiológicos en alimentos (47), indica que un sitio distribuye
alimentos no aptos para el consumo, siempre y cuando se compruebe la
presencia del microorganismo indicador de contaminación fecal en dos
muestras obtenidas en el sitio a analizar. En la presente investigación se
comprobó un número mayor de muestras contaminadas durante el segundo
muestreo (tabla 3, gráfico 3, 42).
Calderón, A. et al. (40), expone que algunos coliformes son comunes en las
heces del hombre y otros animales, pero otros se encuentran comúnmente en el
suelo, agua y semillas; por lo que presentan poco o ningún valor para indicar la
calidad microbiológica de la leche, por esa razón se utiliza Escherichia coli como
indicador de contaminación fecal, debido a la asociación cercana de esta
bacteria con las heces fecales (2, 20, 26).
36
Según Hayes, M. et al. (26), si la leche cruda presenta Escherichia coli, no
debe de ser consumida, debido a que esta bacteria puede ser cualquiera de las
E. coli causantes de diarrea, por lo que el consumo de la leche contaminada con
cualquiera de estas bacterias causaría serios daños a la población consumidora
(20, 24, 28, 47).
Ellner, R. (9), indica que alrededor del mundo se utiliza como criterio para
indicar la calidad microbiológica de la leche cruda, el recuento de
microorganismos aerobios mesófilos (18, 34, 35). La Comisión del Codex
Alimentarius (46) establece que el recuento de aerobios es utilizado
principalmente para clasificar en categoría A, B y C la leche cruda, según los
valores que presenten en el análisis, y así poder distribuirla como materia prima,
para productos como yogurt y quesos (16). La razón por la que solamente se
utiliza este análisis para indicar calidad microbiológica a nivel mundial, es que
existen normas para el consumo humano de leche cruda que especifica que por
ninguna razón debe consumirse leche sin un tratamiento térmico previo (46).
Por tanto, no existe normativa que incluya los valores de Escherichia coli como
criterio para indicar calidad microbiológica de la leche a nivel mundial, sin
embargo, en el municipio de Chiquimula, esta leche cruda se consume
diariamente, por lo que se determina la necesidad, de que las normativas en
materia de alimentos que rigen nuestro país sean más estrictas en el consumo
del mismo.
Según los resultados obtenidos de las 30 muestras de leche analizadas
en el municipio de Chiquimula, no se demostró la presencia de Escherichia coli
O157:H7 (tabla 1 y 2). Según Hayes M, et al. (26), la ausencia del patógeno
en las muestras analizadas se debe a factores como constituyentes
antimicrobiales, entre los que se mencionan a la lactoferrina, conglutinina y el
sistema de lactoperoxidasa, que de manera individual o en conjunto pueden
contribuir a la eliminación de microorganismos en la leche cruda. Las
37
bacteriocinas, también, inhiben el crecimiento de E. coli O157:H7.
Este
compuesto es producido por algunos microorganismos que están presentes en
la leche cruda y que causan efectos letales o bioestáticos sobre otros
microorganismos.
Otro factor influyente en la ausencia de E. coli O157:H7, según Robinson,
K. (42), es su difícil aislamiento, debido a la baja incidencia del patógeno en
leche cruda.
No puede descartarse que la leche cruda es un vehículo de transmisión de
este patógeno en el municipio de Chiquimula, ya que se necesitaría realizar
estudios que contemplen el análisis de un número mayor de muestras, planteado
en base a probabilidades y producción lechera para incrementar entonces la
probabilidad de encontrar esta bacteria; sin embargo, en el municipio de
Chiquimula, no existen estudios a cerca de la producción de leche artesanal.
38
X.
CONCLUSIONES
1. En las leches muestreadas en el municipio de Chiquimula, no hay presencia
de Escherichia coli O157:H7.
2. Las leches artesanales analizadas
provenientes
del municipio de
Chiquimula, no son aptas para el consumo humano por presentar
Escherichia coli.
39
XI.
RECOMENDACIONES
1. Realizar estudios complementarios que identifiquen otros tipos de
Escherichia coli encontrada en las leches muestreadas.
2. Según los resultados obtenidos en esta investigación, es importante iniciar
la implementación de otros estudios de control microbiológico de la leche en
todo el departamento de Chiquimula.
3. Impartir capacitaciones sobre Buenas Prácticas de Manufactura al personal
implicado en la producción y distribución de la leche en el municipio de
Chiquimula.
4. Investigar la fuente de la cual proviene la Escherichia coli encontrada en las
leches analizadas.
40
XII.
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