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 Bioindicadores de Contaminación Acuática en
Peces
Dr. Luis Alberto Romano
Centro de Biopatología Acuática Universidad Bar- Ilan
Tte. Gral J.D. Peron 2933 (1198), Buenos Aires (Argentina)
Introducción
Los peces viven en un medio con el que interaccionan en forma constante, se alimentan, crecen y se
reproducen en ese medio. Toda su estructura y fisiología ha evolucionado para el desarrollo en ese
hábitat, están incluidos en un bucle trófico que los hace imprescindibles para el desarrollo armónico
del ecosistema.
Los bioindicadores de contaminación fueron originalmente definidos como mediciones de fluidos
corporales, células, tejidos u otras variables biológicas que indiquen la presencia y magnitud de estrés
por variaciones en el medio acuático. Esta definición puede ampliarse y extenderse a organismos de
diferentes características, poblaciones o comunidades que sufren los cambios ambientales.
Los bioindicadores son indicadores puntuales y selectos de estrés ambiental en todos los niveles de
la organización biológica y pueden evaluar y predecir los efectos de las modificaciones ambientales
antes que el daño sea irreversible (McCarthy, 1990).
Basados en estos conceptos se puede deducir que los efectos del estrés por la presencia de
contaminantes o variaciones en el medio acuático se pueden observar en periodos tempranos,
dependiendo del nivel de complejidad biológica del o de los métodos que utilicemos. El estrés subletal
es generalmente expresado, primero en el ámbito molecular y bioquímico, como son las
modificaciones o alteraciones en la síntesis de diversas enzimas, los daños en estructuras celulares o
en el material genético. Todos estas alteraciones inducen, en los niveles de organización biológica
más altos, cambios estructurales y funcionales que se manifiestan como lesiones histológicas,
trastornos en la regulación hormonal, metabólica, osmorregulación y respuesta inmune (Heath, 1995).
Cuando se estudian peces que provienen de aguas contaminadas (ríos, lagos, mares y/o
establecimientos acuicultores) se evidencian patologías secundarias a esa situación, mientras los
bioindicadores que se analicen revelan alteraciones sustanciales. Las especies afectadas pueden sufrir
mortandades significativas. El estado en el que se encuentran los peces generalmente permite
presumir que cualquier desequilibrio relativamente agudo de la concentración de oxígeno, aumento de
temperatura del agua o modificaciones en la masa de agua pueden ocasionar dramáticas
consecuencias para la supervivencia de estos animales.
Varios métodos han sido utilizados para evaluar los efectos de la contaminación acuática sobre la
biología de los peces. Todos los esfuerzos están dirigidos a analizar y tratar de cuantificar los cambios
etológicos morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares ocasionados por el estrés que
generan las modificaciones ambientales (Hinton, 1990; Stegeman, 1992; Malins, 1994).
Un método útil es hacer un test de toxicidad aguda o crónica mediante bioensayos realizados en el
laboratorio. De esta forma se puede evaluar un tóxico en particular y evaluar uno o varios parámetros
como respuesta. El bioensayo debe hacerse en condiciones que permita posteriormente homologar los
resultados en animales capturados durante trabajo de campo (Rodriguez, 1994; Randi, 1996).
En este sentido y luego de varios años de investigación, en nuestro laboratorio hemos puesto a
punto, con una tecnología apropiada, bioindicadores que posteriormente fueron transferidos a la
industria (pesquera, acuicultora relacionada con la producción de peces para consumo humano o para
ornamentación) o a instituciones estatales o privadas que manejan recursos hídricos (ríos, lagos,
lagunas embalses) para evaluar el estado de situación cualitativa y cuantitativa del recurso (análisis
bioecológico), además de los estudios de caracterización de agua y sedimento estudiamos
bioindicadores histológicos, hematológicos, bioquímicos, e inmunológicos que permiten estimar el
impacto de la contaminación sobre la biota (Romano, 1988; Morvillo, 1998a; Morvillo, 1998b). En
este trabajo vamos a revisar los bioindicadores inmunológico de contaminación en peces.
Bioindicadores Inmunológicos de contaminación
Los peces se protegen de los agentes patógenos biológicos por medio de una respuesta inmune
similar al de los vertebrados superiores. El rápido desarrollo de la inmunología ha revelado la
complejidad del sistema inmune, el cual consiste en una multitud de defensas no especificas
mecánicas y químicas y un exquisito sistema inmune especifico (Anderson, 1974; Van Muiswinkel,
1985; Bernstein, 1998).
El estrés puede comprometer la eficacia del sistema inmune, alterando las vías fisiológicas tanto de
la respuesta inespecífica como de la especifica. De esta forma se pueden ver afectados mecanismos
fundamentales para obtener una buena respuesta inmune, entre otros, los más afectados son: la
respuesta inflamatoria inicial, el reconocimiento del antígeno, el transporte del antígeno a los órganos
centrales del sistema y la activación de células y moléculas efectoras (Anderson, 1989). Estos hechos,
en muchos casos se manifiestan de forma indirecta, como es el aumento de la sensibilidad a
microorganismos, los peces enferman aparentemente por una bacteria o un virus, pero en realidad el
problema de fondo es que se encuentra inmunodeprimido como consecuencia del estrés ambiental
(Anderson, 1990; Thompson, 1993).
Es estrés induce cambios fisiológicos que inhiben o retardan la respuesta inmune, algunos de estos
son los siguientes (Pickering, 1981):
Incremento en la concentración de corticoides sanguíneos, niveles altos de glucocorticoides
inhiben la producción de interleuquina I lo que dificulta la presentación del antígeno.
Incremento en la concentración sanguínea de catecolamina, estas hormonas aceleran los
mecanismos de inmunosupresión activando rápidamente moléculas y células supresoras de la
respuesta inmune.
Incremento en las síntesis de encefalinas que inhiben la respuesta inmune por mecanismos no
conocidos.
En la tabla I se pueden observar algunos métodos que se utilizan para evaluar la respuesta inmune,
su accesibilidad, sensibilidad y especificidad.
Tabla I: Métodos que se pueden utilizar para evaluar la respuesta inmune
Método
Accesibilidad
técnica
Sensibilidad
Especificidad
Utilización en
nuestro
laboratorio
Métodos no específicos
Hematocrito
Fácil
Baja
Ninguna
No
Recuento de
blancos
Fácil
Baja
Ninguna
No
Diferenciación
de poblaciones
celulares.
Linfocitos y
granulocitos
Regular
Baja
Ninguna
Si
Métodos no específicos utilizados in vivo o in vitro con estimulación antigénica
IF
Regular
Buena
Fagocitosis
Si
QL
Difícil
Excelente
Fagocitosis
Si
Blastogénesis de
linfocitos T y B
Regular
Bueno
Linfocitos
Si
Blastogénesis
por RIA
Difícil
Bueno
Linfocitos
No
Métodos específicos
Cuantificación
CMM
Moderado
Muy buena
Presentador de
antígeno
Si
Aglutinación
Fácil
Buena
Producción de
anticuerpos
Si
ELISA
Moderado
Excelente
Producción de
anticuerpos
Si
Dosaje de IgM
Difícil
Excelente
Producción de
anticuerpos
Nota: RIA: Radioinmunoensayo, IF: Indice de fagocitosis, QL: Quimioiluminiscencia, CMC: centros melanomacrófagos
La selección de in bioindicador inmunológico de estrés por contaminantes depende de muchos
factores, incluyendo los objetivos específicos que se buscan, el equipamiento disponible, el
entrenamiento de los profesionales y el número de ensayos necesarios para arribar a una conclusión.
Los más sofisticados como enzimoinmunoensayo (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), dosaje de
inmunoglobulina M (IgM) son costosos y requieren de personal bien entrenado. Sin embargo los tests
de aglutinación ya sea hemaglutinación o aglutinación con perlas de látex son de bajo costo, no
requieren gran entrenamiento profesional y se pueden realizar en un laboratorio simple.
Los bioindicadores Inmunológicos se pueden dividir en:
Inespecíficos:
Los indicadores inespecíficos de estrés brindan información sobre el estado
macroscópico, microscópico y celular de los órganos que participan en los
mecanismos de defensa. Por ejemplo, en los órganos del sistema hematopoyético
donde se puede establecer el tamaño y peso del bazo, evaluar la arquitectura
histológica del mismo y analizar las diferente progenies celulares.
Algunos parámetros sanguíneos como el hematocrito pueden arrojar algún indicio
de la presencia de un estresógeno ambiental. De la misma forma el recuento y
formula de células sanguíneas centrales (hematopoyéticas) o periféricas son de
utilidad (Campbell, 1990).
Métodos inespecíficos con o sin estimulación de antígenos:
Ciertos indicadores de mecanismos protectores en los peces son pausibles de ser
medidos en la respuesta inmune aferente. El índice de fagocitosis o la actividad
oxidativa de neutrófilos se pueden aumentar cuando los peces se encuentran bajo
los efectos del estrés ambiental.
Un incremente en el índice de fagocitosis indica que los leucocitos tienen un alto
potencial de fagocitar determinado antígeno o de participación en la respuesta
inmune. Células que fagocitan como los macrófagos fijos en diversos tejidos o los
monocitos circulante están comprometidos en los primeros pasos de la respuesta
inmune especialmente la presentación del antígeno (Ellis, 1976).
Los estudios realizados en peces capturados en cuerpos de agua contaminados
comparados con peces de la misma especie que habitan aguas libres de
contaminantes han demostrado un comportamiento diferente de sus macrófagos.
Frente a bacterias como Escherichia coli, la migración a través de una membrana
Millipore de los macrófagos pertenecientes a los animales de áreas polucionadas
fue sustancialmente menor que en los animales sin estrés ambiental (Weeks, 1986;
Dunier, 1991).
La quimioluminiscencia puede ser utilizada in vitro, en suspenciones de
macrófagos, como en in vivo, sobre tejidos como el bazo o pronefros. Por este
método se evalúa la liberación de especies reactiva del oxígeno fundamentalmente
radicales peróxido (O2-).
Este ensayo se utiliza para demostrar la actividad fagocítica en ciertas células de
peces contra inmunomoduladores, como por ejemplo, supresores o estimuladores
de la respuesta inmune. Utilizando este tipo de metodología se puede observar que
la respuesta de macrófagos es menos intensa cuando estas las células están
expuestas a cobre, aluminio o cadmio (Thuvander, 1987).
La cuantificación de la actividad mitógena de poblaciones celulares
inmunocomprometidas es un método que permite evaluar a estas células en la
complejidad de la respuesta inmune. La incorporación de timidina tritiada al ADN
es un indicador altamente sensible. En células provenientes de animales expuestos
a contaminantes la incorporación es sustancialmente menor que en animales no
expuestos (Macubbin, 1994).
Específicos:
Varios indicadores se utilizan para evaluar cada acción del sistema inmune desde
los pasos iniciales hasta la producción final de anticuerpos o células citotóxicas.
Unos de los fenómenos más importantes e la presentación del antígeno por
células especializadas denominadas presentadoras de antígeno.
Uno de los elementos celulares, que actúan como presentadores de antígenos en a
respuesta inmune de los peces, son los melanomacrófagos. En los teleósteos se
presentan como células aisladas o formando centros melanomacrofágicos (CMM)
usualmente nodulares con una delgada cápsula. Estas células contienen tres
pigmentos diferentes, lipofucsina relacionada al metabolismo de ácidos grasos
polinsaturados, hemosiderina como depósito del hierro metabólico y
fundamentalmente melanina.
La función que tiene la melanina es poco clara pero podría estar relacionada a la
captación de especies reactivas del de oxígeno (radicales libres) que se producen
durante la fagocitosis, evitando así el daño celular (Romano, 1998). Para algunos
autores estas estructuras pueden representar los centros germinales más primitivos
de los vertebrados (Angius, 1979a; Angius, 1979b). Algunas características que
adoptan estas células en cultivo, como la formación de complejos dendríticos,
indican que posiblemente tengan su origen en la cresta neural.
La cuantificación de estas células como indicadoras de la fase aferente de la
respuesta inmune ha sido bien documentada en nuestro laboratorio (Macchi et al
1992).
Tanto los melanomacrófagos del bazo o del pronefros pueden ser cuantificados.
Previamente se tiñen los cortes histológicos con Hematoxilina y Eosina, PAS, azul
de Prussian y Fontana Masson. Para la cuantificación las secciones histológicas se
analizan con el método descrito por Weibel. En los últimos años utilizamos un
analizador de imágenes compuesto por una cámara de vídeo, una tarjeta
digitalizadora Frame grabber, una computadora PC AT IBM compatible y por el
software Optimas 4.1 (Weibel, 1982; Romano, 1996).
En la tabla II se pueden observar algunos datos comparativos obtenidos en peces
capturados en cuerpos de agua polucionados y no polucionados.
Tabla II: Cuantificación de CMM por mm2 de tejido esplénico en diversos cuerpos de agua
Sitio de Captura
Bahía de Samborombón
(Río de la Plata, Argentina)
El Rincón
(Río de la Plata, Uruguay)
Laguna de Bragado
(Buenos Aires, Argentina)
Laguna La Salada
(Pehuajó, Argentina)
Lago San Roque
(Córdoba, Argentina)
Especie
N° de CMM/mm2 de tejido
esplénico expresados en
medias
Micropogonias furnieri
20,87
Micropogonias furnieri
6.54
Odontesthes bonaerensis
9.54
Odontesthes bonaerensis
Odontesthes bonaerensis
24.37
11,84
En rojo: En estos lugares se han llevado estudios Bioecológicos y han demostrado un alto
grado de contaminación.
En negro: En estos lugares se han llevado estudios Bioecológicos y han demostrado que no
existe contaminación
Por último de los métodos específicos que utilizamos en nuestro laboratorio es el análisis de uno de
los factores relevante del sistema inmune como la concentración de inmunoglobulina M (IgM) en los
peces (Mancini, 1965). Hemos demostrado que la concentración de IgM en la sangre de corvinas
(Micropogonias furnieri) colectadas en distintas áreas de distribución, presenta variaciones que están
en relación con las características de las masas de agua. Se ha observado que en el sector interno del
Río de la Plata los ejemplares presentan una disminución en la concentración de IgM, lo cual esta
marcando una depresión en la capacidad de respuesta inmunológica (Romano, 1999). Esta
inmunodepresión puede estar asociada al papel que juega el estrés por contaminantes (ver tabla III).
Tabla III: Análisis de la concentración sérica en Corvina Rubia (Micropogonias furnieri) en
Río de La Plata y Mar Argentino.
Estación de
muestreo
Latitud
Longitud
IgM sérica en
mg/ml
S
1
36º33'
56º33'
1.64
0.4
2
36º34'
59º37'
1.56
0.2
3
36º10'
56º38'
1.62
0.3
4
35º27'
56º48'
1.12
0.1
5
35º16'
56º44'
0.52
0.4
6
35º25'
56º21'
0.41
0.3
7
37º17'
56º24'
0.51
0.3
8
35º15'
56º04'
0.47
0.6
9
34º59'
55º49'
0.98
0.3
10
35º04'
55º01'
1.11
0.2
11
35º01'
54º31'
1.63
0.3
12
34º54'
54º08'
1.59
0.6
13
34º17'
53º11'
1.67
0.3
La variación en la concentración de IgM puede hallarse en un mismo cuerpo de agua en diferentes
especies. Este hecho demuestra que existen especies más susceptibles al estrés ambiental. En el
Gráfico I se puede observar las variaciones halladas entre Odontesthes bonaerensis y Cyprinus carpio
capturados en el Lago San Roque, un lago con alto grado de contaminación orgánica. La
contaminación parece afectar la inmunidad humoral de Odontesthes bonaerensis, pero no sucede lo
mismo con Cyprinus carpio.
Gráfico I: Diferencia de la concentración de IgM sérica entre C. carpio y B.
bonaerensis (en Lago San Roque).
Los organismos reguladores que emiten recomendaciones que la mayor parte de los países del
mundo adoptan como la Agencia de Protección Ambiental de Los Estados Unidos de Norteamérica
(Environmental Protection Agency – USEPA) establecen valores guías para diferentes contaminantes
en aguas superficiales. Por otra parte recomienda diferentes métodos para el análisis químico del agua.
El dato que suministra cualquier parámetro químico y que puede estar dentro del nivel de los valores
guías no necesariamente es inocuo para la biota. En el caso de algunos metales pesados, niveles que se
encuentran el 30% por debajo de los valores de referencia permitidos ya modifican sustancialmente la
respuesta inmune.
El Instituto Nacional de Investigaciones y Desarrollo Pesquero de la República Argentina ha
realizado estudios sobre las concentraciones de metales pesados en mamíferos acuáticos y peces de
nuestra plataforma marina. Estos estudios, en cuanto a peces, han arrojado resultados de interés, ya
que en tres especies de peces de alto consumo humano, proveniente de la laguna de Mar Chiquita P.
brasiliensis, O. bonariensis y M. brasiliensis, los valores de mercurio y plomo se encontraron por
encima de los permitidos por las instituciones de primer nivel internacional que controlan alimentos
para consumo humano como la Administración de Drogas y Alimentos de Los Estados Unidos de
Norteamérica (Food and Drug Administration –USFDA), mientras que en el agua la concentración de
dichos metales no superaba los valores guías recomendados por la EPA (Marcovecchio, 1986;
Marcovecchio, 1990; Gerpe, 1990).
La importancia de evaluar bioindicadores es la detección temprana de la presencia de contaminantes
y dependiendo de las alteraciones observadas se puede analizar retrospectivamente y/o
prospectivamente las modificaciones y el impacto de los contaminantes sobre el ambiente acuático.
Por ultimo en muchos casos de patologías fundamentalmente generada por bioagresores que hemos
estudiado en nuestro laboratorio, la causa aparente es el bioagresor, pero, cuando establecemos un
perfil inmunológico de los animales en cuestión encontramos que la inmunodepresión es la cuestión
básica que permite el desarrollo de la patología en curso. En estos casos recomendamos un estudio
integral del establecimiento acuicultor y generalmente hallamos causas ambientales (incluyendo el
manejo de los animales) y/o nutricionales que explican la falla en la respuesta inmune.
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Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 7, junio 1999