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UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Evaluación de la respuesta inmune de salmón del
Atlántico (Salmo salar) a complejos inmunes con
Piscirickettsia salmonis
Memoria para optar al título de Bioquímico
Patrocinante
Director de memoria
Dr. Dante Miranda
Dr. Beltrán Jaureguiberry
Departamento de Bioquímica y
Laboratorio de Investigación y Desarrollo
Biología Molecular
Veterquímica
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile
EDITH VERONICA SOTO LAMPE
Santiago de Chile, 2007
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mi tutor Dr. Beltrán Jaureguiberry, por darme la oportunidad de
acceder a un innovador campo de investigación y por confiar en mis capacidades.
A Claudia Acevedo, Susana Velásquez y Rubén Avendaño por sus valiosos
consejos y apoyo profesional.
A la Dra. Patricia Olivares por facilitarme el material necesario para realizar
mis estudios.
A Valeska Simon por su valiosa colaboración.
A Maggie, Carito, Natalia y Gloria, por compartir amablemente su
experiencia laboral y con ello facilitar el desarrollo de mi trabajo.
A mis compañeros del laboratorio de I+D, por su ayuda y los momentos
compartidos.
A mi familia y amigos que me han orientado y acompañado durante todas
las etapas de mi formación profesional.
Y a Pato por apoyarme (y soportarme) en las buenas y en las malas.
i
RESUMEN
“Evaluación de la respuesta inmune de salmón del Atlántico (Salmo salar) a
complejos inmunes con Piscirickettsia salmonis”
El desarrollo de la salmonicultura chilena ha sido acompañado por la
aparición de una serie de patologías. Actualmente, la enfermedad infecciosa
responsable de las mayores mortalidades y el consiguiente impacto económico en
la
industria,
es
la
Septicemia
Rickettsial
de
los
Salmónidos
(SRS)
o
piscirickettsiosis.
Debido a que los tratamientos con antibióticos no han proporcionado un
control eficaz de los brotes infecciosos, se han desarrollado vacunas como método
de prevención contra la enfermedad. Sin embargo, la eficacia de vacunas
comerciales basadas en bacterinas de Piscirickettsia salmonis, ha mostrado
resultados variables, y la información sobre la efectividad de formulaciones
experimentales basadas en proteínas recombinantes y en ácidos nucleicos en
pruebas experimentales y de campo es escasa, lo cual pone de manifiesto la
necesidad de investigar nuevas alternativas en el desarrollo de vacunas.
El objetivo central de este estudio fue comparar el efecto de una formulación
basada en complejos inmunes con P. salmonis inactivada con el de una formulación
preparada con la bacterina libre, sobre el sistema inmune de salmón del Atlántico
(Salmo salar). De esta forma, se evaluaron algunos parámetros de la respuesta
inmune innata como el estallido respiratorio de los leucocitos y la actividad de la
lisozima, los cuales no se habían estudiado previamente con este patógeno y en el
modelo animal empleado. Además, se evaluó la respuesta inmune humoral
adquirida, comparando el nivel de anticuerpos en peces inmunizados.
La inmunización con complejos inmunes tuvo un efecto positivo sobre los
mecanismos innatos, ya que indujo una mayor actividad de los leucocitos
comparado con la bacterina libre, lo cual fue demostrado por el aumento de la
actividad de la lisozima en suero, y la producción de ión superóxido. Por otro lado,
ii
no se detectaron diferencias significativas en la producción de anticuerpos entre los
grupos inmunizados y el grupo control, y la respuesta observada en este grupo
pudo deberse a la exposición previa de salmón del Atlántico a microorganismos que
comparten estructuras antigénicas con P. salmonis, lo cual fue demostrado en el
ensayo de aglutinación por la reactividad cruzada de los sueros con Arthrobacter
sp. y Flavobacterium psychrophilum. En general, bajo las condiciones del estudio, la
formulación con la bacterina libre mostró una tendencia a disminuir las respuestas
innatas y adquiridas, sugiriendo un efecto inmunosupresor de P. salmonis en
salmón del Atlántico.
La estimulación de leucocitos de salmón in vitro, no mostró diferencias
significativas entre los tratamientos con complejos inmunes y la bacterina libre. Sin
embargo sugirió una respuesta dependiente de la dosis agregada.
Para cumplir con los objetivos planteados fue necesario implementar una
serie de técnicas inmunológicas que permitirán, en próximos estudios, correlacionar
los resultados obtenidos en los distintos ensayos con el nivel de protección inducido
y su duración, de manera que aumentará nuestro conocimiento de la inmunología
de Salmo salar, y hará posible predecir la efectividad de vacunas experimentales en
etapas tempranas posteriores a la inmunización.
iii
ABSTRACT
“Evaluation of immune response of Atlantic salmon (Salmo salar) to immune
complexes derived from Piscirickettsia salmonis”
Development of Chilean salmon industry has been accompanied by the
appearance of a series of diseases. Today, the infectious disease responsible of the
highest mortalities and the resulting economic losses of the industry is salmonid
rickettsial septicemia (SRS) or piscirickettsiosis.
Because the antibiotic therapies have failed to provide an effective control
system of outbreaks, vaccines have been developed as a prevention method.
However, effectiveness of commercial vaccines based on P. salmonis bacterins, has
shown variable results, and there is a lack of information about the effectiveness of
experimental vaccines based on recombinant proteins or nucleic acids in laboratory
and field trials, which reveals the need of research on new approaches in the field of
vaccine development.
The central aim of this study was to compare the effect of a formulation
based in immune complexes of inactivated P. salmonis with the effect of another
one prepared with the free bacterin, on the immune system of Atlantic salmon
(Salmo salar) Therefore, some innate parameters as leucocyte respiratory burst and
lysozyme activity, where evaluated. This parameters had not been previously
studied with this pathogen and in the fish model employed. In addition, the adaptive
humoral immune response was evaluated by comparing the antibody levels in
immunized fish.
Immunization with immune complexes had a positive effect on innate
mechanisms, and led to a greater activity of leucocytes, which was shown by the
increased lysozyme activity in serum, and superoxide anion production. On the
other hand, statistically significant differences in antibody production were not
detected between immunized and control groups, and the observed response inside
iv
this group may be due to previous exposure of Atlantic salmon to microorganisms
that share antigenic structures with P. salmonis, which was shown by the crossreactivity of the assessed sera with Arthrobacter sp. and Flavobacterium
psychrophilum in the agglutination assay. Under the conditions of this study, the free
bacterin based formulation showed a tendency to diminish the innate and acquired
immune responses, suggesting an immunosuppressive effect of P. salmonis on
Atlantic salmon.
In vitro stimulation of salmon leucocytes didn’t show significant differences
between treatments with immune complexes or bacterin alone. However, it
suggested a dose-dependent response.
To achieve the aims of this study, it was necessary to develop several
immunological techniques which will allow, in future researches, make a correlation
between the obtained results of all this different assays with the induced protective
level and its duration, in such a way that will increase our knowledge of Salmo salar
immunology, and will allow the prediction of experimental vaccines effectiveness at
early stages after immunization.
v
INDICE GENERAL
AGRADECIMIENTOS
i
RESUMEN
ii
ABSTRACT
iv
ÍNDICE GENERAL
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
ix
ÍNDICE DE TABLAS
ix
ABREVIATURAS
x
1. INTRODUCCIÓN
1
1.1 Generalidades
1
1.2. Piscirickettsia salmonis
2
1.3. Prevención y tratamiento de la enfermedad
3
1.3.1. Medidas sanitarias
3
1.3.2. Quimioterapia
3
1.3.3. Vacunas
4
1.4. Sistema inmune en peces
5
1.4.1. Inmunidad Innata
6
1.4.2. Inmunidad Adquirida
8
1.4.3. Integración de las respuestas innata y adquirida
9
1.4.4. Receptores Fc en peces
11
1.4.5. Respuesta inmune frente a P. salmonis e interacción
P. salmonis-huésped
2. HIPÓTESIS
12
15
vi
3. OBJETIVOS
15
3.1. Objetivo General
15
3.2. Objetivos Específicos
15
4. MATERIALES
4.1. Material biológico
16
16
4.1.1. Aislados bacterianos
16
4.1.2. Animales
16
4.1.3. Anticuerpos
16
4.2. Reactivos
17
4.2.1. Medios de cultivo y suplementos de cultivo
17
4.2.3. Reactivos generales
17
5. MÉTODOS
18
5.1. Medios y condiciones de cultivo
18
5.2. Cuantificación de P. salmonis inactivada
18
5.3. Determinación proporción óptima antígeno-anticuerpo
19
5.4. Formulación de antígenos
20
5.5. Esquemas de Inmunización
20
5.5.1. Inmunización de conejos
20
5.5.2. Inmunización de salmones
21
5.6. Estudio de la respuesta inmune innata celular
5.6.1. Preparación de suspensión de microcarriers
21
21
5.6.2. Aislamiento de leucocitos de la cabeza del riñón de
salmón
22
5.6.3. Cuantificación de células
22
5.6.4. Estallido respiratorio de leucocitos de salmón
22
5.6.5. Medición del estallido respiratorio de salmones
Inmunizados
23
5.6.6. Estimulación de leucocitos de salmón in vitro
23
5.7 Estudios de la respuesta inmune humoral innata y adquirida
24
5.7.1. Muestras de suero para ensayos de ELISA y actividad
de lisozima
24
5.7.2. Ensayo de ELISA
25
vii
5.7.3. Ensayo de la lisozima
25
5.7.4. Ensayo de aglutinación
26
5.8. Análisis estadístico
6. RESULTADOS
6.1. Cuantificación de P. salmonis por citometría de flujo
26
27
27
6.2. Determinación de proporción óptima antígeno-anticuerpo
para formación de complejos inmunes con P. salmonis
29
6.3. Evaluación de la respuesta inmune innata de salmones del
Atlántico inmunizados con P. salmonis libre y complejada
33
6.3.1. Medición del estallido respiratorio
33
6.3.2. Medición de la actividad de la lisozima
35
6.4. Evaluación de la respuesta inmune humoral adaptativa
38
6.4.1. Medición de la producción de anticuerpos
38
6.4.2. Ensayo de aglutinación
40
6.5. Estallido respiratorio de leucocitos de salmón del Atlántico
estimulados in vitro con P. salmonis libre y complejada
41
7. DISCUSIÓN
43
8. CONCLUSIONES
51
9. PROYECCIONES
52
10. REFERENCIAS
53
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Interface entre la respuesta inmune innata y adquirida
9
Figura 2. Esquemas de ensayo del estallido respiratorio en placas de 24
y 96 pocillos
24
Figura 3. Cuantificación de P. salmonis por citometría de flujo
28
Figura 4. Citometría de flujo de complejos inmunes con P. salmonis
30
Figura 5. Determinación de la dilución óptima de antisuero para formar
complejos inmunes con P.salmonis
Figura 6. Curva de precipitación de complejos inmunes con P. salmonis
31
32
Figura 7. Reducción del NBT en macrófagos de la cabeza del riñón de
salmones inmunizados con P. salmonis libre y complejada
34
Figura 8. Efecto de la inmunización con formulaciones con P. salmonis
en la actividad de la lisozima de salmones
36
Figura 9. Niveles de anticuerpos en salmones incluidos en el ensayo de
Inmunización
38
Figura 10. Reducción del NBT por leucocitos de salmón del Atlántico
estimulados in vitro con P. salmonis libre y complejada
42
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diferencias estadísticas en la actividad de lisozima medida en
los grupos inmunizados y control, analizados individualmente
36
Tabla 2. Diferencias estadísticas en el nivel de anticuerpos medido en
los grupos inmunizados y control, analizados individualmente
39
Tabla 3. Ensayo de aglutinación de sueros de salmones inmunizados con
P. salmonis libre y complejada
41
ix
ABREVIATURAS
µg
microgramo
µL
microlitros
ADN
ácido desoxirribonucléico
ARNr:
ARN (ácido ribonucleico) ribosomal
BKD
Enfermedad bacteriana del riñón
BSA
albúmina de suero bovino
CI
complejos inmunes
cols.
colaboradores
DMSO
dimetilsulfóxido
dpi
dias post-inmunización
ELISA
(Enzyme
Linked
Inmunoabsorvent
Assay)
ensayo
inmunoenzimático
ERO
especies reactivas de oxígeno
EthD-1
homodímero de etidio-1
FITC
isotiocianato de fluoresceína
FSC
dispersión frontal de la luz
g/ grs
gramo/ gramos
h
hora/ horas
HRP
peroxidasa de Rábano
Ig
inmunoglobulina
IgG
inmunoglobulina tipo G
IgM
inmunoglobulina tipo M
LPS
lipopolisacárido
M
molar
mg
miligramo (s)
min
minutos
mM
milimolar
mL
mililitro
NBT
azul de nitrotetrazolio
x
nm
nanómetros
NI
no inmune
PBS
tampón fosfato salino
p.i.
post-inmunización
PRS
porcentaje relativo de supervivencia
psi
(pounds per square inch) libra por pulgada cuadrada
RA
riñón anterior
RFc
receptor para el dominio Fc
rpm
revoluciones por minuto
SFB
suero fetal bovino
SIi
suero inmune con el complemento inactivado
SNi
suero normal con el complemento inactivado
SRS
septicemia rickettsial de los salmónidos
SSC
dispersión ortogonal de la luz
T
temperatura
TCID50
dosis infectiva del 50% del cultivo celular
TMB
Tetrametilbencidina
TYE
medio de cultivo Agar triptona extracto de levadura
U
unidades
VEE
virus de la encefalitis equina venezolana
xi
1. INTRODUCCIÓN
1.1.
Generalidades
La industria salmonicultora se ha convertido en uno de los sectores más
exitosos de la economía nacional, siendo dominada por el cultivo de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch), trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y salmón del
Atlántico (Salmo salar), el cual ha llegado a ser la mayor especie cultivada a nivel
mundial (Luco, 2003; www.bibliotecnica.upc.es /bib280/cursmari/parte3.pdf). El
crecimiento de esta industria ha sido tal que en la actualidad Chile es el segundo
productor del mundo después de Noruega (Salmon Chile 2006).
El carácter intensivo de los cultivos ha favorecido la aparición de una serie
de enfermedades que han provocado importantes mortalidades y el consiguiente
impacto económico en la industria. Los agentes patógenos descritos en los
sistemas de cultivo normalmente están presentes en las poblaciones de peces
silvestres; sin embargo, en los ambientes naturales rara vez provocan mortalidades
debido a la ausencia de condiciones estresantes como el manejo, transporte, alta
densidad poblacional y cambios en la calidad del agua, presentes en las
instalaciones de cultivo (Toranzo y cols., 2005).
Actualmente, la enfermedad infecciosa considerada como la principal causa
de mortalidades en la salmonicultura nacional es la Septicemia Rickettsial de los
Salmónidos (SRS) o piscirickettsiosis, provocando anualmente pérdidas superiores
a los cien millones de dólares (Bravo y Midtlyng, 2007).
El primer brote de piscirickettsiosis se describió en 1989, provocando altas
mortalidades en salmones coho cultivados en su fase de agua de mar. Poco tiempo
después se reportaron mortalidades en todas las demás especies de salmónidos
cultivadas bajo las mismas condiciones de crianza (Cvitanich y cols., 1991) y tanto
la enfermedad como su agente causal se identificaron en las especies susceptibles
en agua dulce (Bravo, 1994; Gaggero y cols., 1995). El patógeno aislado de peces
1
infectados fue identificado como una bacteria intracelular similar a rickettsia y se
denominó Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp. nov. (P. salmonis).
A partir del primer brote descrito en Chile, tanto la enfermedad como el
patógeno se han reportado en una amplia distribución geográfica. En Canadá la
piscirickettsiosis ha causado pérdidas en cultivos marinos de salmón Chinook
(Oncorhynchus tshawytscha), y salmón rosado (Oncorhynchus gorbusha). La
bacteria se ha aislado también a partir de salmones del Atlántico infectados en
Irlanda, Escocia y Noruega. En huéspedes no salmónidos, sólo se ha confirmado la
infección por P. salmonis en lubina blanca (Alractoscion nobilis) cultivada en
California, USA (Fryer y Hedrick, 2003). Sin embargo, las epizootías severas sólo
ocurren en las pisciculturas del sur de Chile.
1.2. Piscirickettsia salmonis
Esta especie, única integrante del género Piscirickettsia, pertenece a la
familia Piscirickettsiaceae dentro de las Gammaproteobacterias (Fryer y Hedrick,
2003). Es una bacteria acapsulada, Gram negativa, inmóvil, aeróbica, de diámetro
entre 0,5-1,5 µm. Es pleomórfica, predominantemente cocoide. Se multiplica por
fisión binaria en el interior de vacuolas citoplasmáticas dentro de las células de
huéspedes infectados (Yuksel y cols., 2006).
Desde su identificación, se ha considerado a P. salmonis como un patógeno
de peces intracelular obligado, que se cultiva en numerosas líneas celulares de
peces, como CHSE 214, donde su crecimiento es controlado por la aparición
gradual de efecto citopático (Almendras y Fuentealba, 1997). También se ha
cultivado con éxito en una línea celular de insecto (Birkbeck y cols., 2004).
Recientemente se informó el desarrollo de una metodología que permitió, por
primera vez, obtener aislamientos de la bacteria en medio de cultivo artificial
(www.aquagestion.cl/areas/diagnostico/nsrs.htm). El potencial carácter extracelular
de la bacteria se había sugerido previamente en un estudio con preparaciones
semipurificadas de la bacteria, donde se observó una mayor supervivencia de la
bacteria en agua salada, mientras que la bacteria no sobrevivió en suspensiones de
agua dulce (Lannan y Fryer., 1994).
2
1.3. Prevención y tratamiento de la enfermedad
1.3.1. Medidas sanitarias
Algunos centros de cultivo han implementado una serie de prácticas
sanitarias con el fin de disminuir las pérdidas ocasionadas por la infección con P.
salmonis. Estas medidas incluyen mantener bajas densidades poblacionales, no
ocupar ciertas áreas para el cultivo por un período para permitir su recuperación, y
prevenir la transmisión horizontal manteniendo sólo una clase de pez anual en un
sitio dado (sistema de cría todo dentro todo fuera) (Fryer y Hedrick, 2003).
1.3.2. Quimioterapia
El uso de drogas antimicrobianas ha sido el principal método de tratamiento
de casos de la enfermedad en curso. Ensayos in vitro han mostrado que la
replicación de P. salmonis es inhibida por estreptomicina, gentamicina, tetraciclina,
cloranfenicol, eritromicina, ácido oxolínico, claritromicina, y sarafloxacina, y que es
resistente a penicilina (Almendras y Fuentealba, 1997). Actualmente los antibióticos
más usados son flumequina, ácido oxolínico, florfenicol y oxitetraciclina,
administrados oralmente mezclándolos con el alimento de los peces. La
oxitetraciclina se administra también a través de inyección intraperitoneal (Bravo y
cols., 2005; www.fip.cl/prog_subprog/acuicultura.htm). Sin embargo, en muchos
casos la enfermedad no se ha controlado, asociándose la inconsistencia de estos
tratamientos al desarrollo de resistencia, así como también a que no se alcancen
concentraciones intracelulares suficientes de la droga para eliminar la bacteria
(Fryer y Hedrick, 2003).
Otras complicaciones asociadas a los antibióticos tienen relación con su uso
excesivo y poco controlado. Por ejemplo, se ha calculado que en la industria chilena
se usan entre 200-250 veces más antibióticos que en Noruega. La presencia de
grandes cantidades de antibióticos en las instalaciones de cultivo ha producido
alteraciones de la flora bacteriana en el entorno acuático induciendo la aparición de
bacterias resistentes, lo cual aumenta las posibilidades de transferencia de
resistencia a bacterias de animales terrestres y patógenos humanos, lo que podría
tener efectos perjudiciales para la salud animal, humana y el medioambiente
(Cabello, 2006).
3
1.3.3. Vacunas
La ausencia de tratamientos efectivos contra la piscirickettsiosis ha
acentuado la necesidad de desarrollar estrategias que prevengan la enfermedad.
Una alternativa es la vacunación, ya que este método ha permitido a la industria del
salmón controlar numerosas enfermedades con éxito (Sommerset y cols., 2005).
Los primeros estudios en el campo de la vacunación contra piscirickettsiosis
se desarrollaron utilizando preparaciones del patógeno completo inactivado con
formaldehído. En salmones coho pre-smolt vacunados intraperitonealmente con
una bacterina de P. salmonis usando diferentes protocolos de vacunación, y
posteriormente sometidos a un desafío natural, se observó una protección
significativa en los peces inyectados con la bacterina menos concentrada, mientras
que en los peces inyectados con la bacterina concentrada en coadyuvante las
mortalidades acumuladas fueron superiores a las del grupo control, sugiriendo que
bajo ciertas circunstancias las bacterinas de P. salmonis podrían tener efectos
inmunosupresores (Smith y cols., 1997). Posteriormente se describió una respuesta
dependiente de la dosis en salmones coho inmunizados con bacterinas en
coadyuvantes oleosos, obteniéndose un mayor porcentaje relativo de supervivencia
(PRS) en salmones coho inmunizados con la bacterina sin diluir (35% PRS),
mientras que con la bacterina más diluida se observó una exacerbación de la
enfermedad (Kuzyk y cols., 2001).
Los resultados obtenidos con preparaciones basadas en bacterinas de P.
salmonis han provocado un aumento de la investigación en torno al uso de vacunas
recombinantes. En salmones coho inmunizados con una vacuna preparada con una
lipoproteína externa de P. salmonis, OspA, se observó un alto nivel de protección
(59% PRS), que se incrementó al incluir epítopes de célula T de la toxina del tétano
y del virus del sarampión (83% PRS) (Kuzyk y cols., 2001). Otros candidatos
evaluados son las proteínas de choque térmico denominadas Hsp60 y Hsp70. La
formulación recombinante proporcionó un alto nivel de protección (89.6% PRS)
comparado con el grupo control. Además, en suero de salmones, se determinaron
altos títulos de anticuerpos contra ambas proteínas recombinantes tres meses
después de su vacunación (Wilhelm y cols., 2005). En un estudio reciente, una
formulación preparada con la subunidad FlgG de la estructura basal flagelar y las
4
chaperoninas Hsp60 y Hsp70 indujo una elevada protección (95% PRS) en
salmones del Atlántico, la cual coincidió con una elevada respuesta humoral contra
los componentes de la formulación, detectada hasta ocho meses después de la
vacunación, sugiriendo que el uso de más de un antígeno recombinante puede
potenciar la respuesta inmune. Sin embargo, los variados grados de protección
alcanzados por distintas formulaciones, hacen que la selección apropiada de los
antígenos sea crucial para lograr una protección exitosa (Wilhelm y cols., 2006).
La aplicación de una vacuna basada en ácidos nucleicos, también ha sido
estudiada como una alternativa para el control de la piscirickettsiosis. En salmones
coho inmunizados con ADN de P. salmonis, se detectó una respuesta humoral
específica y significativamente superior a la del grupo control. Sin embargo, se
observó un bajo nivel de protección atribuido, en parte, a que la elevada
complejidad de una biblioteca genómica puede incluir una concentración muy baja
de los genes hipotéticamente efectivos. Así, la obtención de un producto eficaz
implica la realización de inmunizaciones y desafíos sucesivos con grupos de menor
complejidad para identificar a los genes responsables de la protección (Miquel y
cols., 2003).
Desde 1999 hasta el 2003 la vacunación contra piscirickettsiosis
aparentemente disminuyó. El motivo principal de este descenso tendría relación con
las dudas sobre la eficacia de las vacunas comercialmente disponibles ya que, a
diferencia de lo observado en otras enfermedades bacterianas, su aplicación no ha
reducido el uso de antibióticos (Bravo y Midtlyng, 2007). Además, la información
sobre la eficacia de estas vacunas en condiciones experimentales y de campo es
escasa.
1.4. Sistema inmune en peces
En teleósteos, el timo, el bazo y el riñón son los principales órganos
hematopoyéticos, siendo este último funcionalmente equivalente a la médula ósea
de los mamíferos. En estos órganos se originan y diferencian numerosas células del
sistema inmune, como linfocitos T y B, granulocitos y monocitos/macrófagos, cuya
actividad da cuenta de la inmunocompetencia de los peces (Zapata y cols., 2006).
En salmónidos como trucha y salmón del Atlántico, estas poblaciones celulares se
5
han identificado (Pettersen y cols., 2000; Kollner y cols., 2001; Jansson y cols.,
2003), y al igual que en vertebrados superiores, son responsables de la ejecución
de la respuesta inmune innata y adquirida frente a la invasión de microorganismos
patógenos.
1.4.1. Inmunidad Innata
La mayor importancia de la respuesta innata de los peces, reside en su
capacidad de desencadenar una serie de mecanismos en un corto lapso, frente a
una amplia gama de microorganismos a través del reconocimiento de
características altamente conservadas en su superficie, como el LPS, las cuales
son conocidas colectivamente como Patrones Moleculares Asociadas a Patógenos
(PAMPs) (Magnadottir, 2006). Además, cumple un rol muy importante en la
iniciación y dirección del tipo de respuesta inmune adquirida (Dixon y Stet, 2001).
La inmunidad innata de los peces está conformada por barreras físicas
como mucus, escamas y superficies mucosas (epidermis, branquias, intestinos),
que bloquean la entrada de los patógenos invasores. En mucus y suero pueden
encontrarse componentes humorales como lectinas, pentraxinas, proteínas del
complemento, péptidos antibacterianos y lisozima (Magnadottir, 2006).
La lisozima es una enzima que rompe el enlace glucosídico β-1,4 entre el
ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina en la capa de peptidoglicano de la
pared celular bacteriana, conocida por provocar la lisis predominantemente de
bacterias Gram positivas y en menor grado, bajo condiciones como la presencia del
complemento, de algunas bacterias Gram negativas. Sin embargo, esta enzima
tiene la capacidad de neutralizar e interactuar potentemente con el lipopolisacárido
(LPS) bacteriano. Se ha reportado que lisozima purificada de trucha arcoiris
(Onchorhyncus mykiss) es capaz de inhibir el crecimiento de varias bacterias gram
negativas patógenas de peces en ausencia de complemento. En varias especies de
peces, se ha detectado lisozima en mucus, suero, ovas y órganos como el riñón,
asociados a un alto contenido de leucocitos. Lo anterior concuerda con la idea de
que monocitos/macrófagos y granulocitos son las principales fuentes de producción
de la enzima (Lie y cols., 1989). En salmónidos inyectados intraperitonealmente con
polisacáridos microbianos, se observó una actividad elevada de lisozima en suero;
estudios posteriores in vitro demostraron un aumento en la producción de lisozima
6
en macrófagos de la cabeza del riñón de salmón del Atlántico en presencia de βglucano de levadura y LPS bacteriano (Paulsen y cols., 2001). Además, varios
reportes dan cuenta de la actividad bactericida de lisozima aislada de suero y ovas
sobre patógenos de peces como A. salmonicida y A. hydrophila (Ellis, 1999).
La inmunidad innata cuenta también con un componente celular cuyas
funciones son fundamentales en la defensa contra microorganismos agresores
(Ellis, 2001). Si la bacteria logra penetrar en los tejidos del pez, se desencadena
una respuesta inflamatoria que induce la afluencia de leucocitos como, neutrófilos y
monocitos/macrófagos, considerados tradicionalmente como las principales células
fagocíticas de los teleósteos. El rol fundamental de estas células es limitar la
diseminación inicial y/o el crecimiento de organismos infecciosos. Una vez
atrapado, son reclutadas otras células inmunes para ayudar a destruir al organismo
invasor; frecuentemente, el fagocito mismo es activado para destruirlo. Las células
fagocíticas
almacenan en gránulos y lisosomas
una serie de péptidos
antimicrobianos que se liberan en el fagolisosoma después de la ingestión de un
organismo extraño. La partícula fagocitada es degradada por enzimas como
proteasas, nucleasas, fosfatasas, esterasas y lipasas. Además, estas células
eliminan a los microorganismos fagocitados a través de un mecanismo dependiente
de oxígeno denominado “estallido respiratorio”, en el cual se producen especies
reactivas de oxígeno (ERO), como el anión superóxido (O2.-), el cual es
transformado posteriormente en peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y ácido
hipocloroso (Neumann y cols., 2001).
Numerosos estudios demuestran la capacidad de los fagocitos de peces
de producir ERO, a través del estallido respiratorio en respuesta a la exposición a
patógenos marinos o sus componentes. En macrófagos aislados de la cabeza del
riñón de salmón del Atlántico la estimulación in vitro con LPS de bacterias
patógenas y no patógenas de peces, indujo un aumento de la producción
intracelular de anión superóxido de un modo dependiente de la dosis agregada
(Dalmo y cols., 1995; Solem y cols., 1995). Igualmente, se ha demostrado la
activación del estallido respiratorio de macrófagos de salmón del Atlántico
estimulados con β-glucanos, componentes estructurales fundamentales de la pared
celular de levaduras, hongos y algas, cuya administración tanto in vivo como in vitro
7
ha resultado en un aumento de la resistencia frente a ciertos patógenos (Bridle y
cols., 2005; Brattgierd y cols., 1994; Jorgensen y cols., 1995). Además, este
mecanismo se ha estudiado in vitro e in vivo en distintos salmónidos mediante la
administración de importantes patógenos marinos vivos o inactivados, con una
considerable similitud de la respuesta microbicida bajo diversas condiciones tales
como el tipo de patógeno, la exposición a cepas virulentas y avirulentas o la
presencia de factores opsonizantes. En neutrófilos de salmón del Atlántico una
cepa avirulenta de A. salmonicida indujo una mayor producción de ERO comparada
con una cepa virulenta (Lamas y Ellis, 1994). Similarmente, macrófagos de trucha
arcoiris eliminaron efectivamente una cepa avirulenta de A. salmonicida pero no
una virulenta, sin embargo cuando los macrófagos se activaron in vivo, ambas
cepas fueron eliminadas efectivamente (Graham y cols., 1988). El rol de las ERO
en la eliminación del patógeno se comprobó en cultivos de macrófagos de la
cabeza del riñón sometidos a la presencia de inhibidores de componentes y
productos del estallido respiratorio, en los cuales se observó un incremento de la
supervivencia de la cepa avirulenta (Sharp y Secombes, 1993). Estudios con otro
patógeno Gram negativo de peces, V. anguillarum, demostraron la activación del
estallido respiratorio en macrófagos de truchas inmunizadas con bacterias
inactivadas con formaldehido (Kodama y cols., 1989). También se ha reportado la
activación in vitro del estallido respiratorio en presencia de la bacteria intracelular,
Gram positiva, R. salmoninarum. El patógeno inactivado con calor indujo un
estallido respiratorio mayor que el microorganismo vivo (Campos-Pérez y cols.
1997). Este patógeno es capaz de sobrevivir y multiplicarse en el interior de los
macrófagos de peces infectados, al parecer, por su capacidad de resistir los
mecanismos de degradación dentro de los macrógrafos (Bandin y cols., 1993).
1.4.2. Inmunidad Adquirida
El sistema inmune adquirido de los peces incluye mecanismos humorales
y mediados por células, a cargo de las poblaciones linfocitarias B y T,
respectivamente. Estas respuestas se desarrollan en un tiempo mayor que las
respuestas innatas y se activan por el reconocimiento de moléculas específicas de
los patógenos. Su rol principal es la generación de memoria inmunológica tras la
exposición sucesiva a un patógeno, lo que constituye la base del proceso de
vacunación (Shoemaker y cols., 2005).
8
La respuesta mediada por células depende de la presencia de células
accesorias, como los macrófagos, para presentar antígenos a los linfocitos T. El
procesamiento y presentación de antígenos son dirigidos por un sistema similar al
complejo principal de histocompatibilidad (CPH) de mamíferos (Vallejo y cols.,
1992), que difiere de éste en que los genes de clase I y II residen en grupos de
ligamiento distintos, por lo que una denominación más apropiada sería genes PH.
En salmónidos se han aislado y caracterizado genes de clase I y II, y se han
realizado estudios funcionales de su expresión frente a patógenos virales y
bacterianos (Hansen y cols., 1999; Grimholt y cols., 2003)
En teleósteos se ha descrito principalmente sólo una clase de
inmunoglobulina (Ig), correspondiente a una forma tetramérica de IgM, la cual
cumpliría con las diversas funciones encontradas en las otras clases de Ig de otros
vertebrados. Entre las funciones asociadas a las inmunoglobulinas (Igs) específicas
están la opsonización de bacterias, neutralización de toxinas o virus y una potente
participación en la activación del complemento (Shoemaker y cols., 2005). Estudios
sugieren la existencia de memoria inmunológica en los peces similar a la respuesta
anamnésica en vertebrados superiores. Sin embargo, existen discrepancias sobre
la capacidad de respuesta de los peces tras la inmunización, sosteniéndose que los
peces producirían anticuerpos con baja afinidad por el antígeno, que su respuesta
secundaria no sería igualmente pronunciada y que presentarían una baja
maduración por afinidad (Pilstrom, 2003).
1.4.3. Integración de las respuestas innata y adquirida
El suero de los peces contiene diferentes componentes, como el
complemento y las Igs, que opsonizan a los patógenos aumentando la fagocitosis y
posterior eliminación de éstos por diversas células especializadas del sistema
inmune. El reconocimiento de antígenos, sean estos bacterias o componentes de
las mismas, por anticuerpos específicos producidos por el pez, implica la
interacción entre las porciones hipervariables de los anticuerpos y epítopes del
antígeno conduciendo a la formación de los denominados complejos inmunes (CI),
los cuales pueden modular un amplio rango de mecanismos tanto innatos como
adquiridos (Fig. 1).
9
Fig. 1. Interface entre la respuesta inmune innata y adquirida. Células del
sistema inmune innato como monocitos/macrófagos pueden reconocer bacterias o
componentes de éstas en forma de complejos inmunes (CI) a través de receptores
Fc (RFc) presentes en su superficie. Estas células fagocitan a los CI para luego
eliminar a los patógenos mediante mecanismos como el estallido respiratorio, o
procesarlos dando origen a péptidos que luego son presentados por moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (CPH) en la superficie celular. Los
linfocitos T (LT) reconocen los antígenos así expuestos a través de receptores
específicos. La activación del receptor en el LT junto con otras señales
coestimuladoras, inician una cascada de eventos que conducirá a la generación de
células T de memoria. (Fuente: elaboración propia).
En neutrófilos de salmón se observó una mayor producción de ERO en
presencia de A. salmonicida opsonizada con suero normal (sin el complemento
inactivado) que con SNi (suero normal con el complemento inactivado) (Lamas y
Ellis, 1994). Sin embargo, se observó un aumento de la fagocitosis de éste
patógeno, así como también de la actividad bactericida frente al patógeno Gram
positivo L. garvieae, cuando macrófagos de trucha se incubaron con las bacterias
opsonizadas con SIi (suero inmune con el complemento inactivado), mientras que
esta actividad no se detectó al emplear SNi, demostrando que los efectos del
antisuero persisten en presencia de anticuerpos específicos (Michel y cols., 1991;
Barnes y cols., 2002). En contraste, aunque la fagocitosis de R. salmoninarum
opsonizada no fue diferente a la de la bacteria libre, su supervivencia al interior de
los macrófagos aumentó levemente en presencia de SIi, y fue potenciada cuando
se utilizó suero inmune, sugiriendo que en conjunto el complemento y los
10
anticuerpos ejercerían un cierto rol protector frente a la actividad bactericida contra
este patógeno (Bandin y cols., 1995).
Recientemente, un estudio demostró, in vitro e in vivo, una potente
actividad fagocítica y microbicida de células B de truchas expuestas a A. hydrophila,
indicando además un aumento notable de la fagocitosis de la bacteria opsonizada
con complemento o anticuerpos específicos. Dado que en vertebrados superiores
los linfocitos B carecen de actividad fagocítica, estas observaciones apoyan la idea
de que las células B evolucionaron de un tipo celular ancestral fagocítico y
proporciona evidencia que permite entender la cercana relación entre los linfocitos
B y los macrófagos de mamíferos sugiriendo un predecesor común con atributos de
ambos tipos celulares (Li y cols., 2006). Estos resultados concuerdan con los
obtenidos en un reporte anterior en el que CI preparados con gama globulina
humana y antisuero de salmón del Atlántico se unieron a leucocitos enriquecidos
con una población similar a los linfocitos B (O’Dowd y cols., 1999).
Por otro lado, las células accesorias cumplen un rol esencial en el
procesamiento y presentación antigénica. Estudios in vitro en bagre (Ictalarus
punctatus) han demostrado la función de células B y monocitos/macrófagos como
células presentadoras de antígenos, y la importancia de esta actividad en la
proliferación de leucocitos sanguíneos periféricos y producción de anticuerpos
(Vallejo y cols., 1992). En salmón del Atlántico se ha sugerido que la retención de
antígenos y la activación de macrófagos en agregados de melanomacrófagos en el
bazo son de vital importancia para lograr la generación de memoria inmunológica
contra la furunculosis (Press y cols., 1996). Asimismo, en carpas inmunizadas con
complejos inmunes preparados con gama globulina humana se indujo un mayor
nivel de anticuerpos que en peces inmunizados con el antígeno libre (Secombes y
Resink, 1984).
1.4.4. Receptores Fc en peces
Los estudios con patógenos en presencia de suero proporcionan
evidencia funcional de la presencia de receptores en la superficie de los fagocitos
de pez que interactúan con las Igs presentes en complejos bacteria-anticuerpo. En
efecto, se ha probado la existencia de receptores para el dominio Fc (RFc) en la
11
superficie de leucocitos de tiburón nodriza (Ginglymostoma cirratum). El rol del
dominio Fc de la Ig de tiburón en la mediación de la unión se demostró a través de
la disminución considerable de ésta cuando los leucocitos eran preincubados con
porciones Fc purificadas. (Haynes y cols., 1988). Un estudio del año 2003 describió
la capacidad opsonizante de antisuero de conejo, al comparar la neutralización del
virus de la anemia infecciosa de salmón (ISAV) por antisuero de pez y de conejo,
observándose que en el caso de la línea celular de pez similar a macrófago, TO, los
anticuerpos antivirales de conejo facilitaron la entrada del virus a las células,
sugiriendo que los macrófagos de teleósteos podrían tener receptores Fc para
inmunoglobulinas de mamífero (Joseph y cols., 2003). Este resultado se apoya en
el hecho de que un homólogo del receptor Fc para IgE (FcεRIγ) de mamífero se
identificó en carpa (Fujiki y cols., 2000); asimismo, recientemente se identificó en
bagre un RFc soluble relacionado filogenética y estructuralmente al RFc de
mamíferos. Secuencias genómicas relacionadas con este receptor se encontraron
en trucha y pez globo (Spheroides nephelus), y análisis funcionales preliminares
sugieren que podría unirse a Igs de pez como una proteína soluble en el suero o
como un receptor cuando se expresa en la superficie celular de ciertos leucocitos
(Stafford y cols., 2006).
1.4.5. Respuesta immune frente a P. salmonis e interacción P. salmonis –
huésped
Aunque P. salmonis fue el primer patógeno bacteriano intracelular Gram
negativo aislado de salmónidos afectados por grandes mortalidades, los
mecanismos de respuesta inmune inducidos por la bacteria no se han estudiado en
profundidad, limitándose principalmente al registro de mortalidades y nivel de
anticuerpos después de una infección experimental o tras la inmunización con la
bacteria inactivada o componentes de la misma en ensayos destinados a la
evaluación de potenciales vacunas.
La reproducción experimental de piscirickettsiosis en salmones Coho
infectados por diferentes vías, demostró que P. salmonis puede ingresar al pez a
través de la piel, intestino y branquias. La piel fue el sitio de entrada más eficiente y
por el que se indujo el mayor nivel de mortalidad. La infección podría iniciarse a
través de la unión del patógeno a la superficie de lesiones microscópicas, presentes
12
frecuentemente en salmones cultivados (Smith y cols., 2004). La comparación del
grado de virulencia ha permitido establecer diferencias biológicas significativas
entre aislados chilenos y de otros países, que presentan una baja variabilidad
genética. Ninguno de los aislados extranjeros ha demostrado ser tan virulento como
el primer aislado chileno (House y cols., 1999). La disminución de la virulencia
asociada a P. salmonis tras sucesivos pasajes de cultivo, se ha correlacionado con
variaciones del patrón proteico, sugiriendo que la naturaleza patogénica de una
cepa podría reflejarse en su patrón electroforético (Larenas y cols., 2006).
Mediante el análisis de microarreglo se estudió la interacción P. salmonishuésped, identificando una serie de biomarcadores moleculares generados en
respuesta a la exposición a P. salmonis en macrófagos infectados in vitro y tejido
hematopoyético del riñón de salmones del Atlántico infectados. Ambos tejidos
compartieron la disminución de la expresión de un mismo gen asociado a procesos
antioxidantes, pero en macrófagos infectados aumentó la expresión de al menos
otros diez genes involucrados en la respuesta al estrés oxidativo. Esto daría cuenta
de una regulación diferenciada de los factores de virulencia del patógeno en
diferentes tejidos del pez infectado, promoviendo su supervivencia al interior de los
macrófagos a través de la protección de la integridad frente al daño oxidativo
generado por mecanismos como el estallido respiratorio. Por el contrario, en el
tejido renal podría contribuir al daño tisular inducido por la infección. Este resultado
se reflejó en la baja expresión en riñón hematopoyético infectado, de transcritos
involucrados en la respuesta inmune adaptativa. Otro gen inducido en macrófagos
infectados fue el de IκBα, inhibidor endógeno de NF-κB, un factor nuclear sensible a
las variaciones del estado redox, usualmente activado en células infectadas. Este
factor de transcripción participa en la regulación de la expresión de numerosos
genes involucrados en la respuesta inmune innata y adquirida. Su inhibición podría
formar parte del mecanismo por el cual P. salmonis evade la respuesta inmune de
los macrófagos permitiendo la supervivencia intracelular del patógeno (Rise y cols.,
2004).
En un estudio reciente se analizaron diversas condiciones implicadas en la
supervivencia de P. salmonis en el interior de macrófagos de salmón del Atlántico.
Estas células fagocitaron a la bacteria más eficientemente que a esferas
13
fluorescentes. Además, se observó que macrófagos infectados con una cepa
virulenta permanecían viables por más tiempo que macrófagos infectados con una
cepa de baja virulencia, sugiriendo que esta última no escapó de los mecanismos
de defensa al interior del macrófago. Por último, en presencia de suero policlonal de
conejo, no se observó una inhibición de la entrada de P. salmonis a los distintos
tipos celulares, mientras que al mezclar la bacteria con antisuero obtenido de peces
inmunizados con el patógeno inactivado se detectó un efecto inhibitorio específico
del crecimiento de la bacteria en el interior de células CHSE (Bordevik, 2006).
Los antecedentes recopilados proporcionan evidencia que apoya el
desarrollo de una vacuna basada en complejos inmunes con P. salmonis, con el fin
de mejorar la presentación antigénica de este patógeno e inducir una respuesta
inmune innata que promueva una inmunidad adquirida más duradera. Además, el
uso de diversos métodos inmunológicos en la monitorización del desarrollo de la
respuesta inmune de salmón del Atlántico frente a vacunas experimentales,
permitirá profundizar en el conocimiento de la inmunología de esta especie y a
través de la correlación de diversos parámetros innatos y adquiridos, predecir
desde fases tempranas la eficacia de potenciales vacunas.
14
2. HIPÓTESIS
Complejos inmunes formados con Piscirickettsia salmonis inactivada y
anticuerpos policlonales anti Piscirickettsia salmonis inducen en salmón del
Atlántico (Salmo salar) una respuesta inmune innata y adquirida mayor que
Piscirickettsia salmonis inactivada libre.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo General
Comparar algunos parámetros de la respuesta inmune innata y adquirida de
salmón del Atlántico inducidos por complejos inmunes preparados con P. salmonis
inactivada y anticuerpos policlonales anti P. salmonis, con la respuesta inducida
por la bacterina libre.
3.2. Objetivos Específicos
1.
Determinar proporción óptima de antígeno-anticuerpo (P. salmonisanticuerpos policlonales de conejo) para preparar complejos inmunes.
2.
Evaluar parámetros de respuesta inmune innata y adquirida de salmones
inmunizados con complejos inmunes con P. salmonis inactivada y con la bacterina
libre.
3.
Comparar la respuesta in vitro de leucocitos de salmón expuestos a P.
salmonis libre y complejada.
15
4. MATERIALES
4.1. Material biológico
4.1.1. Aislados bacterianos
En todos los ensayos realizados en este estudio se utilizó una cepa de P.
salmonis denominada Huelmo, semipurificada e inactivada con formaldehído,
nombrada P. salmonis durante el estudio. La bacterina fue proporcionada por el
Depto. de Producción Biológicos de Veterquímica.
En el ensayo de aglutinación se utilizaron las siguientes bacterias:
Flavobacterium sp., obtenido de agua dulce de estanques en las instalaciones de
la piscicultura Australis; Pseudomonas sp., Sphingomona sp. y Arthrobacter sp.,
provenientes de ovas de salmón; Flavobacterium psychrophilum y Aeromonas
hydrophyla, aisladas de peces infectados.
Para realizar el ensayo de Lisozima se utilizó Micrococcus lysodeikticus
ATCC 4698 liofilizado de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EEUU).
4.1.2. Animales
Para la obtención de antisuero anti P. salmonis se utilizaron conejos
hembra de raza Neozelandesa de 1,5- 2 Kg.
Para los ensayos inmunológicos in vitro e in vivo se utilizó la especie de
peces Salmón del Atlántico (Salmo salar) de 20- 25 g.
4.1.3. Anticuerpos
Para realizar el ensayo de ELISA se utilizó un anticuerpo monoclonal anti
IgM de Trucha/Salmón producido en ratón, de Aquatic Diagnostic Ltda. (Stirling,
Escocia) y un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) anti IgG
(molécula completa) de ratón producido en conejo, de Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO, EEUU).
16
Para marcar los anticuerpos de conejo unidos a P. salmonis en los
complejos inmunes estudiados por citometría de flujo, se utilizó un anticuerpo anti
IgG (H+ L) de conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de Pierce
Biotechnology (Rockford, EEUU).
4.2. Reactivos
4.2.1. Medios de cultivo y suplementos de cultivo
Para ensayar el estallido respiratorio de los leucocitos de salmón se
utilizaron los siguientes medios de cultivo celular: medio L-15 de Leibovitz (L-15) y
R.P.M.I. 1640 (RPMI). Para recubrir las placas para el ensayo de ELISA se ocupó
poli-L-lisina, todos de GIBCO (Grand Island, NY, EEUU).
Los medios fueron suplementados con suero fetal bovino (SFB), de GIBCO
(Grand Island, NY, EEUU), penicilina y estreptomicina (producidos por Depto. de
Producción Biológicos de Veterquímica).
4.2.3. Reactivos generales
Acido cítrico, albúmina de suero bovino (BSA), fosfato disódico (Na2HPO4),
fosfato monosódico (NaH2PO4), hidróxido de potasio (KOH), Timerosal, Tris- Base,
de Merck, (Darmstadt, Alemania).
Azul de nitrotetrazolio (NBT), cloruro de sodio (NaCl), heparina, 3,3',5,5'Tetrametilbencidina (TMB), Tween 20, de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
EEUU).
Azul de tripán, de GIBCO (Grand Island, NY, EEUU).
Bicarbonato de sodio (NaHCO3), carbonato de sodio (Na2CO3), dimetil
sulfóxido (DMSO), Metanol (MeOH), de Winkler (Santiago de Chile).
Coadyuvante oleoso no mineral (facilitado por Depto. de Producción
Biológicos de Veterquímica).
Colorante homodímero de etidio–1 (EthD-1), de Molecular Probes Inc.
(Eugene, OR, EEUU)
Cytodex 3 (Microcarriers), de Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala,
Suecia).
17
5. MÉTODOS
5.1. Medios y condiciones de cultivo
La cepa de P. salmonis utilizada durante el estudio fue cultivada en
monocapas de la línea celular de pez CHSE-214 en medio mínimo esencial de
Eagle (MEM) sin antibiótico, suplementado con suero fetal bovino. Su crecimiento
se controló por la aparición de efecto citopático (ECP). Al cabo de un período en el
que se alcanzó el 80-90% de ECP, se calculó el título de la bacteria según el
método de Reed y Muench (1938). Posteriormente, la bacteria se inactivó con
formaldehido
y
fue
semipurificada
mediante
sucesivas
centrifugaciones
diferenciales.
Los aislados utilizados en el ensayo de aglutinación se cultivaron en agar
triptona extracto de levadura (agar TYE) a 20 ± 1ºC por 48 h, aproximadamente.
Posteriormente, las bacterias fueron inactivadas con formaldehído y mantenidas a
4ºC hasta su uso.
5.2. Cuantificación de P. salmonis inactivada
Para revisar el título de la bacteria utilizada, se cuantificó por citometría de
flujo, tiñéndola con el colorante EthD-1 y usando una suspensión de microesferas
de poliestireno de 6 µm como estándar de referencia para determinar el volumen
de la suspensión bacteriana analizada. El colorante empleado se une fuertemente
a los ácidos nucleicos y emite fluorescencia roja, además penetra sólo en células
cuya membrana ha perdido su integridad por lo que se usa para teñir
específicamente células muertas.
Un volumen de 1mL de una dilución 1:100 de P. salmonis en PBS, se
incubó con 4 µL de EthD-1 a temperatura ambiente, en oscuridad, por 20 min.
Luego se agregó 2 µL de la suspensión de microesferas de concentración 108
microesferas/mL (200.000 microesferas) y se analizó la muestra en un citómetro de
flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, Calif. EEUU), equipado con un
18
láser de excitación de Argón con una longitud de onda de 488 nm y un montaje
estándar de filtros. La adquisición y análisis de los datos se realizó con el programa
CELL Quest. Utilizando una muestra de bacterias teñidas, sin agregar
microesferas, se ajustó la amplificación de las señales de dispersión frontal (FSC)
y lateral (SSC) de la luz ubicando a las bacterias en el centro del espacio de
adquisición de datos. Los restos celulares y agregados fueron excluidos
electrónicamente sobre las bases de dispersión de la luz y emisión de
fluorescencia. Los parámetros del citómetro se ajustaron para obtener lecturas
óptimas y se mantuvieron constantes durante el estudio.
Después de ajustar el citómetro de flujo, se analizaron las muestras
experimentales (bacteria teñida más microesferas) definiendo dos regiones
correspondientes a bacterias y microesferas. En cada análisis se midió la
dispersión de la luz lateral versus la intensidad de fluorescencia a 520-560 nm
(FL3) de los eventos celulares enmarcados en la región definida para las bacterias
teñidas, adquiriéndose cada vez aproximadamente 10.000 eventos.
5.3. Determinación proporción óptima antígeno-anticuerpo
La proporción óptima de antígeno-anticuerpo para preparar complejos
inmunes (CI) para estimular los leucocitos de salmón in vitro e in vivo, se determinó
por citometría de flujo. Una dilución 1:100 de la suspensión de P. salmonis se
incubó con distintas diluciones de suero de conejo anti- P. salmonis en PBS en un
volumen final de 1 mL por 1h a 37ºC y luego toda la noche a 15ºC con agitación
moderada. Al día siguiente se precipitó los complejos antígeno-anticuerpo
centrifugando a 6.000 rpm por 8 min, se resuspendieron en 1 mL de PBS y se
marcaron las porciones de antígeno y anticuerpo para su posterior análisis en el
mismo equipo en que se cuantificó la bacteria. Un volumen de 0,5 mL de complejos
inmunes se incubó con 4 µL de EthD-1 por 20 min a temperatura ambiente para
teñir la bacteria, a continuación se incubó con 10 µL de anti-IgG de conejo
conjugada con FITC (anti-IgG-FITC) diluida 1:50 por aproximadamente 30 min-1h a
4ºC para marcar los anticuerpos unidos a la bacteria. La dilución del anticuerpo
secundario (anti-IgG-FITC) que permitiera obtener una mayor amplificación de la
señal se determinó como la mínima dilución que permitiera obtener un mayor índice
de fluorescencia sobre el control negativo. El valor de la media de la intensidad de
19
fluorescencia verde de una dilución 1:100 de la suspensión de P. salmonis teñida
con EthD-1 e incubada con el anticuerpo secundario conjugado con FITC en
ausencia de antisuero, se utilizó como control negativo.
El valor de la media de la intensidad de fluorescencia verde de las muestras
de complejos inmunes marcados se comparó con el valor medido para el control
negativo, adquiriéndose cada vez aproximadamente 15.000 eventos. La dilución
óptima de antisuero se definió como la dilución que produjo la mayor intensidad de
fluorescencia verde comparada con la fluorescencia del control negativo.
5.4. Formulación de antígenos
P. salmonis: para inmunizar conejos se utilizó una bacterina de P. salmonis
inactivada con formaldehído concentrada dos veces. Por otro lado, los peces se
inmunizaron con una formulación preparada con P. salmonis inactivada con
formaldehído lavada y resuspendida en PBS en una dilución 1:100, mezclada con
un coadyuvante oleoso no mineral (mencionado durante el resto del estudio como
coadyuvante) en una proporción antígeno: coadyuvante 3:7.
Complejos inmunes con P. salmonis: una dilución 1:100 de P. salmonis
inactivada con formaldehído y una dilución 1:5.000 de antisuero policlonal de
conejo, se incubó 1h a 37ºC y luego toda la noche a 15ºC con agitación moderada.
Al día siguiente se precipitó los complejos antígeno-anticuerpo centrifugando a
6.000 rpm por 8 min resuspendiéndolos posteriormente en PBS. Los complejos
inmunes
obtenidos
se
mezclaron
con
coadyuvante
en
una
proporción
antígeno:coadyuvante, 3:7.
5.5. Esquemas de Inmunización
5.5.1. Inmunización de conejos
Se inoculó conejos hembra neozelandeses de 1,5-2 Kg según el esquema
descrito por Sorensen y Larsen (1986), inyectando volúmenes crecientes de P.
salmonis inactivada con formaldehído (0,2; 0,4; 0,8; 1,6; y 3,2 mL) cada cuatro
días. Previo a la primera inmunización se recolectó suero pre-inmune. Una semana
después de la última inoculación se extrajo sangre de los conejos para la obtención
de suero. La sangre recién extraída se incubó a 37ºC por 2h y posteriormente toda
20
la noche a 4ºC. Al día siguiente, se recolectó el suero, se inactivó por 1h a 56ºC en
baño termoregulado y se guardó a -20º C hasta su uso.
5.5.2. Inmunización de salmones
Tres grupos de 50 peces mantenidos en agua dulce en estanques de 50 L
con un sistema de recirculación a una temperatura de 16 ± 1ºC, se inmunizaron
con distintas formulaciones del antígeno (descritas en “Formulación de antígenos”)
vía intraperitoneal. A cada pez se le inyectó 0,2 mL de la formulación
correspondiente. Los grupos y su tratamiento se indican a continuación:
Grupo 1 (G1): corresponde al grupo control, inyectado con PBS en coadyuvante
(proporción PBS:coadyuvante 3:7).
Grupo 2 (G2): inmunizado con formulación de bacterina libre (P. salmonis diluida
1:100) en coadyuvante (proporción antígeno:coadyuvante 3:7).
Grupo 3 (G3): inmunizado con formulación de CI (preparados con P. salmonis
diluida 1:100 y antisuero policlonal de conejo diluido 1:5.000) en coadyuvante
(proporción antígeno:coadyuvante 3:7).
5.6. Estudio de la respuesta inmune innata celular
5.6.1. Preparación de suspensión de microcarriers
Los microcarriers (microsoportes) empleados en este estudio, Cytodex 3,
son pequeñas esferas constituidas por una capa superficial de colágeno
desnaturalizado unida covalentemente a una matriz de dextrano entrecruzado. Se
incluyeron como parte de un método implementado para realizar el ensayo del
estallido respiratorio. Los pocillos de las placas de cultivo se recubrieron con un
volumen de microcarriers de manera tal que se formara una monocapa en el fondo
con el fin de facilitar la adhesión de los leucocitos de salmón. El procedimiento se
hizo según las indicaciones del fabricante, utilizando PBS libre de Ca2+ y Mg2+
(PBS). Los microcarriers secos se hidrataron en PBS (50-10 mL/g microcarriers) por
al menos 3 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y se lavaron por
unos pocos minutos con PBS fresco (30-50 mL/g microcarriers). El PBS se desechó
y reemplazó con PBS fresco (30-50 mL/g microcarriers) para esterilizarlos en
autoclave (115°C, 15 min, 15 psi). Antes de usarlos se permitió que los
microcarriers esterilizados se compactaran, se desechó el sobrenadante y se
enjuagaron brevemente. Finalmente, se resuspendieron en medio de cultivo L-15
21
suplementado con 100 U penicilina/mL y 0,1 mg estreptomicina/mL (20-50 mL/g
microcarriers), a temperatura ambiente y se transfirieron al recipiente de cultivo.
5.6.2. Aislamiento de leucocitos de la cabeza del riñón de salmón
Para obtener leucocitos del riñón anterior (RA) de salmón se siguió un
protocolo basado en el descrito por Secombes (1990). El pez sacrificado con un
exceso de benzocaína fue sangrado por la vena caudal. A continuación, se extrajo
la cabeza del riñón bajo condiciones de esterilidad y se disgregó presionándola con
una espátula contra una malla de nylon (poro de 100 µm) estéril sobre una placa
petri de 5 mL, mantenida en hielo, que contenía medio cL-15 (medio L-15
suplementado
con
estreptomicina/mL,
5
U
heparina/mL,
2% SFB).
100
U
penicilina/mL,
La suspensión celular
0,1
mg
obtenida se utilizó
directamente para ensayar el estallido respiratorio de los leucocitos.
5.6.3. Cuantificación de células
Las células de la suspensión de leucocitos de cabeza del riñón se contaron
al microscopio en cámara de Neubauer por el método de exclusión de azul de
tripán. Luego de mezclar 100 µL de suspensión celular con 100 µL de azul de
tripán, se agregó 10 µL de la mezcla en la cámara. Inmediatamente se contaron
las células viables (no teñidas).
5.6.4. Estallido respiratorio de leucocitos de salmón
Leucocitos de salmón aislados, según el protocolo descrito, se distribuyeron
en duplicado en placas de cultivo celular recubiertas con microcarriers. Las placas
se incubaron a 15ºC. Luego de la incubación, las células se lavaron dos veces con
medio RPMI y se incubaron con NBT 2 mg/mL preparado en medio RPMI a 15ºC.
Después de la incubación las células se lavaron con medio RPMI, se fijaron con
MeOH 100 % y se lavaron dos veces con MeOH 70%. El formazán producido por
la reducción del NBT se disolvió con KOH y DMSO, agitando enérgicamente el
contenido de los pocillos. Finalmente, se leyó la absorbancia a 600 nm. Los
resultados se expresaron como la absorbancia a 600 nm por 105 células.
22
5.6.5. Medición del estallido respiratorio de salmones inmunizados
La producción intracelular de anión superóxido (O2.-) de leucocitos de la
cabeza del riñón de salmones inmunizados con diferentes formulaciones fue
evaluada siguiendo el protocolo implementado para el ensayo del estallido
respiratorio en placa de 24 pocillos. El procedimiento se describe en detalle en la
figura 2.
5.6.6. Estimulación de leucocitos de salmón in vitro
La respuesta in vitro a P. salmonis libre y complejada se comparó midiendo
la producción intracelular de anión superóxido (O2.-) de leucocitos de la cabeza del
riñón de salmón en placa de 96 pocillos siguiendo el protocolo implementado para
el ensayo del estallido respiratorio. Los leucocitos aislados de tres salmones de 1520g fueron estimulados agregando volúmenes crecientes de una dilución 1:100 de
P. salmonis y de CI preparados con la misma cantidad de P. salmonis y antisuero
policlonal de conejo diluido 1:5.000 (proporción determinada por citometría de flujo).
Los volúmenes agregados de la bacterina libre y complejada fueron: 2,5 µL, 5 µL y
10 µL. Como control negativo se utilizó la lectura de absorbancia a 600 nm de
células que no fueron estimuladas. El procedimiento se describe en detalle en la
figura 2.
23
Placa 24 pocillos
Placa 96 pocillos
Recubrimiento con 200 µL/pocillo
de suspensión microcarriers
Recubrimiento con 25 µL/pocillo
de suspensión microcarriers
Suspensión celular de RA
en 4 mL de CL-15
Suspensión celular de RA
en 1.7 mL de CL-15
Distribución en duplicado
400 µL suspensión celular/pocillo
Distribución en duplicado
100 µL suspensión celular/pocillo
Incubación a 15ºC toda la noche
Incubación a 15ºC toda la noche
2 lavados con 500 µL RPMI/pocillo
2 lavados con 100 µL RPMI/pocillo
Incubación a 15ºC por 2 horas con
400 µL NBT 2mg/mL
Incubación a 15ºC por 2 horas con
vol. variables de P. salmonis y CI +
100 µL NBT 2mg/mL/ pocillo
1 lavado con 500 µL RPMI/pocillo
1 lavado con 100 µL RPMI/pocillo
Incubación a T ambiente por 5 min
con 400 µL MeOH 100%
Incubación a T ambiente por 5 min
con 100 µL MeOH 100%
2 lavados con 400 µL MeOH 70%/pocillo
2 lavados con 400 µL MeOH
70%/pocillo
Disolución de formazán con
200 µL de KOH + 200 µL de DMSO
Disolución de formazán con
120 µL de KOH + 140 µL de DMSO
Traspaso contenido pocillos a
tubos de microcentrífuga,
decantación de microcarriers.
Traspaso de sobrenadante a placa
de 96 pocillos (200 µL/ pocillo)
Lectura Absorbancia 600 nm
Lectura Absorbancia 600 nm
Fig. 2. Esquemas de ensayo del estallido respiratorio en placas de 24 y 96
pocillos. RA: riñón anterior.
5.7 Estudios de la respuesta inmune humoral innata y adquirida
5.7.1. Muestras de suero para ensayos de ELISA y actividad de lisozima
Previo a la inmunización se recolectó suero de peces para utilizarlo como
control en los ensayos de ELISA y lisozima. Después de la inmunización se
24
recolectó, a intervalos de días variables, el suero de tres peces por grupo. Los
sueros de peces de un mismo grupo no se mezclaron, y se mantuvieron a -20ºC.
5.7.2. Ensayo de ELISA
Placas de cultivo celular de 96 pocillos se recubrieron con poli-L-lisina (5
µg/mL) en una solución tampón de carbonato-bicarbonato (100 µL/pocillo)
incubándolas toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavó la placas con 400
µL/pocillo de una solución tampón de baja salinidad (Tris 20mM, NaCl 0,38 M,
timerosal 0,01%, Tween 20 0,05%) y se activaron con una suspensión de P.
salmonis inactivada con formaldehído, preparada en PBS en una dilución tal que
se agregó aproximadamente 107 bacterias/ pocillo (100 µL/pocillo), incubando toda
la noche a 4ºC. Al día siguiente las placas se lavaron 3 veces con la solución
tampón de baja salinidad, y se bloquearon con BSA 1% en PBS (200 µL/pocillo)
durante 3 h a 37ºC, lavándose posteriormente 5 veces con la solución tampón de
baja salinidad. Luego, se agregaron los sueros de peces no inmune e inmune, los
cuales se compararon a una dilución única (1:20) en PBS. Las placas se incubaron
a 15ºC por 3h, se lavaron 5 veces con una solución tampón de alta salinidad (Tris
20mM, NaCl 0,5M, timerosal 0,01%, Tween 20 0,1%), se incubaron a 15ºC por 1h
con un anticuerpo monoclonal (isotipo IgG 1) anti-IgM de salmón diluído 1:37,5 en
BSA 1% en PBS y se lavaron nuevamente 5 veces con la solución tampón de alta
salinidad. El anticuerpo monoclonal anti-IgM de salmón fue reconocido incubando
a 15º C por 1h con un tercer anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa
diluído 1:1.000 en tampón de conjugado (BSA 1% en solución tampón de baja
salinidad). Luego, se lavaron las placas 5 veces con la solución tampón de alta
salinidad. Las placas se revelaron incubándolas con una solución de TMB (100
µL/pocillo) por 10 min a 15ºC, la reacción se detuvo con H2SO4 2 M (50 µl/pocillo).
Finalmente, se leyó la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro Multiskan
MS (Labsystems).
5.7.3. Ensayo de la lisozima
La actividad de la lisozima se midió de acuerdo al protocolo desarrollado en
el Instituto de Acuicultura de la Universidad de Stirling, Escocia (comunicación
personal Dra. Kim D. Thompson), usando un ensayo turbidimétrico en placa de 96
pocillos en que se ocupó como sustrato 0,2 mg/mL de Micrococcus lysodeikticus
25
en solución tampón sodio fosfato 0,04 M (pH 5,8). Diez µL de suero de pez se
agregaron sobre 190 µL de suspensión bacteriana y se midió la disminución de la
absorbancia a 450 nm después de 1 min y 5 min de incubación a 22ºC. Una unidad
de actividad de lisozima se definió como la reducción de 0,001 en absorbancia por
minuto.
5.7.4. Ensayo de aglutinación
Con el fin de comparar la reactividad cruzada de los sueros con varios
microorganismos simultáneamente, el ensayo de aglutinación se realizó utilizando
una placa de vidrio para aglutinación. En cada cuadro se agregó un volumen de
antisuero de pez diluido 1:10. Luego se agregó un volumen igual de suspensión
bacteriana y se mezcló con movimientos circulares. La visualización del ensayo se
realizó a contraluz sobre una superficie oscura. Se asignó una cruz (+) cuando se
observó una aglutinación rápida y definida, un signo más/menos (±) para una
aglutinación débil y tardía, y un signo menos (-) cuando no se observó reacción. La
unión inespecífica o auto-aglutinación se controló mezclando por separado los
sueros y suspensiones bacterianas con PBS.
5.8. Análisis estadístico
Los gráficos representan los datos de uno de al menos dos experimentos
independientes.
Para determinar la significancia estadística de las diferencias entre los
promedios de los valores entre los distintos grupos comparados y dentro de cada
grupo, los datos de los ensayos realizados con los peces incluidos en la prueba de
inmunización se analizaron mediante el test t de student no pareado de dos colas.
Las diferencias se consideraron significativas cuando P< 0,01 y P< 0,05.
Los datos del ensayo del estallido respiratorio en salmones estimulados in
vitro se analizaron mediante el test t de student pareado de dos colas para
determinar la significancia estadística de los promedios de los valores comparados
con los valores del control. Las diferencias se consideraron significativas cuando
P< 0,05.
26
6. RESULTADOS
6.1. Cuantificación de P. salmonis por citometría de flujo
El título de la bacteria utilizada para realizar los estudios se revisó
cuantificándola por citometría de flujo.
Las propiedades de dispersión de la luz y emisión de fluorescencia de la
bacteria teñida, se utilizaron para definir una región de adquisición para las
bacterias. Debido a que las bacterias fueron inactivadas, su perfil a lo largo del eje
FSC fue muy bajo, por lo que su región de adquisición se definió a lo largo del eje
SSC. Además, se ha demostrado que en el equipo utilizado, las partículas
pequeñas (menores a 1 µm) son mejor resueltas sobre las bases de la dispersión
lateral de la luz (SSC) (Martz, 2000; www.bio.umass.edu/micro/immunology/ facs
542/facsprin.htm), lo cual resulta más apropiado para P. salmonis, cuyo rango de
tamaño varía entre 0,5 y 1,5 µm. Una segunda ventana de adquisición fue definida
para las microesferas de manera que se distinguieran fácilmente de las bacterias y
otros eventos. De esta forma, las bacterias presentes en las muestras
experimentales (P. salmonis teñida más microesferas estándar de 6 µm) se
identificaron por su complejidad y emisión de fluorescencia roja. Bajo estos
parámetros fueron incluidas partículas marcadas con un perfil elevado de SSC, las
cuales se consideraron como células muertas antes de ser inactivadas (Figura 3).
27
Fig. 3. Cuantificación de P. salmonis por citometría de flujo. En este gráfico de
SSC versus fluorescencia roja, las señales enmarcadas en la región R1
representan a la bacteria teñida con el colorante EThD-1; las señales enmarcadas
en la región R2 representan a las microesferas, usadas como estándar para estimar
el volumen de la muestra.
La concentración de bacterias en las muestras se calculó a partir de la
siguiente fórmula (basado en protocolo de CountBrightTM Absolute Counting Beads
*for flow cytometry* de Molecular ProbesTM Invitrogen)
A x C = células/ mL de muestra, donde:
B
D
A: número de eventos correspondientes a bacterias
B: número de eventos correspondientes a microesferas
C: número de microesferas agregado a la muestra (en este caso 200.000)
D: volumen de muestra (en este caso 1 mL)
Al multiplicar el valor obtenido por el factor de dilución correspondiente, en
este caso 100, se obtuvo la concentración de P. salmonis en la muestra original. En
dos cuantificaciones realizadas por separado se determinó un total de 8,5 * 107
bacterias/mL y 6,8 * 107 bacterias/mL, promediando alrededor de 7.5 * 107
bacterias/mL. Este valor resultó ser aproximadamente un orden de magnitud menor
que el título informado para la bacteria facilitada, correspondiente a 1,316 * 109
TCID50/mL (Dosis Infectiva del 50% del Cultivo Celular), el cual se determinó según
el método de Reed y Muench.
28
Los ensayos del estudio se realizaron trabajando con el promedio de los
valores de concentración de P. salmonis determinados por citometía de flujo.
6.2. Determinación de proporción óptima antígeno-anticuerpo para formación
de complejos inmunes con P. salmonis
La proporción óptima de antígeno-anticuerpo para la formación de complejos
inmunes con P. salmonis se determinó mediante citometría de flujo.
La formación de CI se monitoreó a través del desplazamiento de la
población doblemente marcada en el eje de las abscisas (Figura 4) el cual se
consideró proporcional a la cantidad de complejos formados, puesto que refleja la
unión del anticuerpo conjugado a FITC a anticuerpos asociados a la bacteria. Para
determinar la dilución óptima de antisuero necesaria para formar CI con la cantidad
de bacteria utilizada, se midió el valor del porcentaje de la media de la intensidad de
la fluorescencia verde de cada muestra y se calculó el índice de fluorescencia
correspondiente: % fluorescencia muestra experimental “x”
% fluorescencia control negativo.
Este valor fue aumentando conforme al aumento de la dilución del antisuero,
obteniéndose el mayor índice de fluorescencia para una dilución de antisuero
1:5.000. En la siguiente dilución de antisuero, 1:8.000, se observó una disminución
de la fluorescencia indicando una cantidad de anticuerpo inferior a la necesaria para
la formación de CI (Figuras 5 y 6).
29
Fig. 4. Citometría de flujo de complejos inmunes con P. salmonis. Los gráficos
(a-g) muestran el análisis de fluorescencia roja (eje y) versus verde (eje x) de CI
preparados con una dilución fija de P. salmonis y diluciones crecientes de antisuero.
La fluorescencia verde emitida por la bacteria teñida con EthD-1 sin antisuero e
incubada con anti- IgG - FITC se usó como control negativo (a). Las diluciones de
antisuero se indican a continuación: (b) antisuero 1:200, (c) antisuero 1:500, (d)
antisuero 1:1.000, (e) antisuero 1:2.000, (f) antisuero 1:5.000, (g) antisuero 1:8.000.
El desplazamiento de los eventos en el eje de las abscisas refleja la formación de
CI.
30
a
e
b
f
c
g
d
Fig. 5. Determinación de la dilución óptima de antisuero para formar
complejos inmunes con P.salmonis. Los gráficos (b)-(g) corresponden a los
histogramas de frecuencia de fluorescencia verde de CI preparados con una
dilución fija de P. salmonis y diluciones crecientes de antisuero policlonal de conejo.
El histograma (a) corresponde al control negativo. En el interior de cada histograma
se indica el valor del porcentaje de la media de la intensidad de la fluorescencia
verde. El mayor porcentaje de fluorescencia corresponde a la dilución óptima de
antisuero necesaria para formar los CI.
31
A
B
Fig. 6. Curva de precipitación de complejos inmunes con P. salmonis.
(A) La superposición de los histogramas muestra el progreso de la formación de CI
a partir del control negativo (a) que presenta la menor intensidad relativa de
fluorescencia verde, hasta la dilución óptima de antisuero (f) que registró el valor
más alto. Diluciones menores y mayores a ésta no fueron suficientes para
complejar la cantidad de bacteria utilizada. (B) Con los valores de los porcentajes
de la intensidad relativa de la fluorescencia verde se construyó una curva de
precipitina que muestra el comportamiento típico desde una cantidad excesiva de
anticuerpo (dil. 1:200) hasta una cantidad insuficiente de los mismos (dil 1:8.000).
32
6.3. Evaluación de la respuesta inmune innata de salmones del Atlántico
inmunizados con P. salmonis libre y complejada
6.3.1. Medición del estallido respiratorio
Uno de los principales objetivos de este trabajo fue la evaluación de algunos
parámetros de la inmunidad innata en salmones inmunizados con dos
formulaciones elaboradas con P. salmonis libre y formando parte de CI. Los
leucocitos fagocíticos de los peces constituyen la primera línea de defensa contra
los patógenos microbianos invasores, por esto, el estallido respiratorio de los
leucocitos es un ensayo que se emplea comúnmente para evaluar el efecto de
diversas sustancias y condiciones sobre la inmunidad innata de los peces.
Tras determinar la proporción óptima antígeno:anticuerpo para preparar los
CI con P. salmonis, se comparó la respuesta inmune celular innata de salmones
inmunizados con dos formulaciones elaboradas con P. salmonis libre y formando
parte de CI, midiendo la producción intracelular basal (sin agregar agentes
inductores de la respuesta) del anión superóxido (O2.-) en los leucocitos aislados del
riñón anterior de los peces de los grupos incluidos en el ensayo de inmunización,
mediante un ensayo colorimétrico en el que se mide espectrofotométricamente el
producto formazán de color azul originado por la reducción del compuesto azul de
nitrotetrazolio (NBT). Para realizar este ensayo se implementó un método que
incluyó el uso de microcarriers para facilitar la adhesión de los leucocitos, además,
no se incluyó una etapa de purificación de la suspensión celular para no descartar
el aporte de otras poblaciones celulares con potenciales propiedades fagocíticas
que pudieran encontrarse en el riñón anterior, pero se previno la contaminación con
glóbulos rojos sangrando previamente de forma exhaustiva a los peces y
controlando luego la suspensión celular por microscopía.
Las formulaciones utilizadas se prepararon en un coadyuvante oleoso
mineral, con el cual se combinó también el PBS inyectado al grupo control. Los
coadyuvantes son sustancias inmunomoduladoras que se incluyen habitualmente
en las formulaciones de vacunas para peces ya que poseen propiedades que
potencian la inmunogenicidad de las mismas y la respuesta de los animales durante
la inmunización experimental (Anderson, 1997). Entre los días 6 y 21 postinmunización (p.i.) se midió el estallido respiratorio de los leucocitos de tres peces
por grupo en forma individual. Aunque no se siguió la respuesta de peces no
33
inmunizados, el día 0 se midió la actividad del estallido respiratorio de salmones
escogidos al azar entre los tres grupos previo a ser inyectados con las
formulaciones probadas. Esta medición se realizó con el fin de confirmar el posible
efecto estimulante de las formulaciones (Figura 7).
Fig. 7. Reducción del NBT en macrófagos de la cabeza del riñón de salmones
inmunizados con P. salmonis libre y complejada. La producción intracelular
basal de anión O2.- de leucocitos del riñón anterior de salmones inmunizados con P.
salmonis libre (G2) y formando parte de CI (G3) fue comparada a los 6, 11,14 y 21
días post-inmunización (dpi) midiendo la reducción de NBT. Los resultados se
muestran como el promedio ± ES de la absorbancia a 600 nm medida en duplicado
para tres peces por grupo cada día. El grupo control (G1) corresponde a los peces
inyectados sólo con PBS en coadyuvante. El día 0 se midió la actividad del estallido
respiratorio en peces seleccionados al azar antes de iniciar el ensayo de
inmunización. Los valores de grupos diferentes agrupados entre corchetes
muestran diferencias significativas. Los valores significativamente diferentes dentro
de un grupo se agruparon entre corchetes segmentados.
(P < 0,01),
(P <
0,05).
Al día 6 p.i. se observó un aumento significativo del estallido respiratorio en
los peces inmunizados con CI (G3) comparado tanto con el grupo control (P < 0,01)
como con el grupo inmunizado con la bacterina libre (P < 0,05). Hasta el término del
ensayo, la respuesta del grupo 3 se mantuvo alta, y el leve descenso registrado el
día 14 p.i. no fue significativo.
34
El grupo control (G1) mostró una baja actividad del estallido respiratorio el
dia 6 p.i., idéntica a la detectada en peces no inmunizados (dia 0). El día 11 p.i.
alcanzó su mayor nivel de respuesta, siendo significativamente superior a la
actividad medida los días 6 y 14 p.i. Además, a partir de este día la respuesta fue
similar a la del grupo 3.
En el grupo inmunizado con la bacterina sin complejar (G2) se observó un
incremento significativo del estallido respiratorio (P < 0,05) comparado con el del
grupo control sólo el día 6 p.i. mostrando una tendencia a la disminución de la
respuesta, la cual se distinguió principalmente el dia 11 p.i. donde la respuesta de
este grupo fue significativamente inferior a la del grupo control (P < 0,05).
Al día 14 p.i. el grupo control sufrió, al igual que el grupo 2, un descenso
importante en su respuesta, sin embargo los niveles medidos no fueron
significativamente diferentes al nivel del grupo 3, aunque cabe señalar que la
respuesta del grupo 2 fue similar a la registrada en peces no inmunizados (día 0).
Al término del ensayo el nivel de respuesta de los tres grupos fue
comparable al medido el día 11 p.i., destacándose el nivel sostenido apreciado en
el grupo inmunizado con CI.
6.3.2. Medición de la actividad de la lisozima
La inmunidad innata humoral de los peces incluidos en el ensayo de
inmunización se estudió a través de la medición de la actividad de la lisozima. Entre
los días 6 y 21 p.i., se midió la actividad de la lisozima utilizando el suero de los
peces empleados en el ensayo del estallido respiratorio. Al igual que en el ensayo
del estallido respiratorio, en el día 0 se midió la actividad de la lisozima en salmones
escogidos al azar entre los tres grupos previo a ser inyectados con las
formulaciones probadas (Figura 8).
35
Fig. 8. Efecto de la inmunización con formulaciones con P. salmonis en la
actividad de la lisozima de salmones. El suero de los peces empleados en el
ensayo del estallido respiratorio se utilizó para medir la actividad de la lisozima
presente en el suero. Los resultados se muestran como el promedio ± ES de las
unidades enzimáticas calculadas para mediciones en triplicado de los sueros de los
peces ensayados individualmente. El día 0 se midió la actividad de la lisozima en
salmones escogidos al azar previo a la inmunización. Los valores de grupos
diferentes agrupados entre corchetes presentan diferencias significativas,
(P <
0,01), (P < 0,05)
Tabla 1. Diferencias estadísticas en la actividad de lisozima medida en los
grupos inmunizados y control, analizados individualmente
Grupo 1
d.p.i.
6
11
14
21
6
11
-
14
21
6
11
14
Grupo 2
d.p.i.
6
11
14
-
Grupo 3
d.p.i.
6
11
14
21
6
11
14
(P < 0,01),
(P < 0,05), d.p.i.: días post-inmunización, G1: grupo control, G2:
grupo inmunizado con bacterina libre, G3: grupo inmunizado con CI.
36
En el día 6 p.i. ambos grupos inmunizados con formulaciones de P. salmonis
(G2 y G3), alcanzaron una actividad de la lisozima semejante, la cual fue
significativamente mayor (P < 0,01) que la del grupo control. El grupo inmunizado
con CI alcanzó un valor máximo el día 11 p.i., significativamente superior a los
valores medidos en los otros días, mientras que el día 14 p.i., la actividad del grupo
disminuyó hasta un nivel idéntico al registrado en el día 6 p.i..La respuesta del
grupo aumentó nuevamente el día 21 p.i., pero de manera mucho menos
sobresaliente que el día 11 p.i. (tabla 1) A partir del día 11 p.i. la actividad del grupo
3 se mantuvo hasta el término del ensayo en un nivel significativamente mayor que
la actividad del grupo control y del grupo inmunizado con la bacterina sin complejar
(P < 0,01).
Entre los días 6 y 11 p.i., no se observaron diferencias significativas en la
actividad de la lisozima del grupo inmunizado con la bacterina libre. En el día 14
p.i., el nivel de enzima sufrió un descenso considerable, con un valor
significativamente inferior al medido en los días previos, que se mantuvo constante
hasta el término del ensayo (tabla 1). Cabe señalar que el nivel de lisozima medido
en el día 11 p.i. fue similar al del grupo control, y el día 14 p.i. fue significativamente
menor al nivel de este grupo (P < 0,05).
Al inicio del ensayo (día 6 p.i.), la respuesta del grupo control fue similar a la
de los peces evaluados el día 0 (previo a la inmunización). La respuesta alcanzó su
máximo nivel en el día 11 p.i.. En las mediciones posteriores, la actividad de la
lisozima en este grupo fue disminuyendo, hasta alcanzar en el día 21 un nivel
idéntico al de los peces analizados previo a la inmunización.
Resumiendo, la actividad de la lisozima inducida por los complejos inmunes
fue notablemente superior a la actividad inducida por la bacterina libre, la cual
tendió a disminuir en el tiempo. Por su parte, la actividad medida en los peces
inyectados con PBS en coadyuvante fue significativamente inferior en comparación
con la respuesta medida con complejos inmunes, sin embargo alcanzó niveles
similares a los registrados para la bacterina libre e incluso llegó a superarlos.
37
6.4. Evaluación de la respuesta inmune humoral adaptativa
6.4.1. Medición de la producción de anticuerpos
El desarrollo de la respuesta inmune humoral adquirida en los peces
incluidos en el ensayo de inmunización se evaluó mediante el ensayo de ELISA.
Los sueros de los diferentes grupos se testearon entre el día 36 y 79 postinmunización (p.i.) frente a la misma bacterina utilizada en la preparación de las
formulaciones inyectadas. Las lecturas obtenidas se consideraron positivas a una
absorbancia mayor o igual a 0,2 después de sustraer el valor promedio de muestras
de salmones no inmunizados. Los resultados se analizaron mediante la
comparación del nivel de anticuerpos dentro de un grupo y comparaciones entre los
diferentes grupos (Figura 9).
Fig. 9. Niveles de anticuerpos en salmones incluidos en el ensayo de
inmunización. A partir del día 36 p.i. se comparó la respuesta inmune humoral
adquirida de salmones inmunizados con P. salmonis libre (G2) y complejada (G3), y
del grupo control correspondiente a peces inyectados con PBS en adyuvante (G1),
a través de la medición de la producción de anticuerpos detectados mediante el
ensayo de ELISA. Los valores corresponden al promedio de la absorbancia a 492
nm ± ES de los sueros de tres peces por grupo probados individualmente a una
dilución 1:20 frente a P. salmonis.
38
Tabla 2. Diferencias estadísticas en el nivel de anticuerpos medido en los
grupos inmunizados y control, analizados individualmente
Grupo 1
d.p.i.
36
36
43
50
65
Grupo 2
d.p.i.
36
36
43
50
65
43
-
43
-
50
-
50
-
65
-
79
-
65
79
-
-
-
Grupo 3
d.p.i.
36
43
50
65
79
36
43
50
65
(P < 0,01),
(P < 0,05), d.p.i.: días post-inmunización, G1: grupo control, G2:
grupo inmunizado con bacterina libre, G3: grupo inmunizado con CI.
En el día 36 p.i. no se observaron diferencias entre los grupos, condición
que se mantuvo hasta el día 43 p.i. En el día 50 p.i. se observó un incremento
significativo del nivel de anticuerpos dentro de los grupos 1 y 3 (tabla 2), sin
embargo este incremento no fue significativo respecto al grupo 2. A partir de este
día, el nivel de anticuerpos de los grupos 1 y 3 se mantuvo constante hasta el
término del ensayo, con valores semejantes entre sí.
Por su parte, el grupo 2 sostuvo un nivel de anticuerpos equivalente entre
los días 36 y 50 p.i., que luego disminuyó significativamente en el día 65 p.i., en
comparación con los días 36 y 43 p.i. (tabla 2). En el día 79 p.i. el nivel de
anticuerpos de este grupo aumentó nuevamente y alcanzó valores similares a los
de los grupos 1 y 3.
En síntesis, los niveles de anticuerpos medidos tanto en los peces
inmunizados con CI como en el grupo control fueron prácticamente idénticos y pese
a que no se diferenciaron significativamente del grupo inmunizado con la bacterina
libre, mostraron una tendencia a persistir en el tiempo. La producción de
39
anticuerpos frente a la bacterina libre, en cambio, mostró una inclinación hacia la
disminución de la respuesta inmune humoral adaptativa.
6.4.2. Ensayo de aglutinación
Debido a los resultados obtenidos en el ensayo de ELISA, donde se observó
un considerable nivel de producción de anticuerpos en el grupo control, similar al
del grupo inmunizado con complejos inmunes, a través del ensayo de aglutinación
se evaluó la reactividad cruzada de los sueros de los grupos incluidos en la prueba
de inmunización frente a bacterias aisladas de diversas fuentes: Flavobacterium
sp., obtenido de agua dulce de estanques en las instalaciones de la piscicultura
Australis; Pseudomonas sp., Sphingomona sp. y Arthrobacter sp., aisladas de ovas
de salmón; Flavobacterium psychrophilum y Aeromonas hydrophyla, aisladas de
peces infectados.
Para realizar el ensayo se utilizaron los sueros de dos peces por grupo,
recolectados en los días 0 (suero no inmune), 65 y 79 p.i. Los resultados del
ensayo se resumen en la tabla 4. Ningún suero analizado reaccionó con
Flavobacterium sp., Sphingomona sp. y Aeromonas hydrophyla. Con los sueros de
todos los grupos incluidos en el ensayo de inmunización se detectó reacción
cruzada con Arthrobacter sp. y Flavobacterium psychrophilum. En los sueros no
inmunes (NI) se observaron diferentes grados de aglutinación frente a estos
antígenos, siendo el más pronunciado con Arthrobacter sp., mientras que con
Flavobacterium psychrophilum se observó una reacción débil. Frente a P. salmonis
ambos sueros reaccionaron débilmente, en tanto que con los sueros de los grupos
inmunizados con la bacterina libre y complejada, así como con el grupo control, se
observó una reacción positiva. Las reacciones de autoaglutinación fueron
descartadas enfrentando las muestras bacterianas a PBS, con el cual no se
produjo reacción alguna.
40
TABLA 3: Ensayo de aglutinación de sueros de salmones inmunizados con P.
salmonis libre y complejada
Día 65 p.i.
Día 79 p.i
Día 0
G1
G2
G3
G1
G2
G3
NI
Pseudomonas sp.
-
-
-
-
-
-
-
Flavobacterium sp.
-
-
-
-
-
-
-
Arthrobacter sp
+
+
+
+
+
+
+
Sphingomona sp.
-
-
-
-
-
-
-
Flavobacterium
psychrophilum
+
+
+
+
+
+
±
Aeromonas
hydrophyla
-
-
-
-
-
-
-
P. salmonis
+
+
+
+
+
+
±
+: aglutinación positiva, ±: aglutinación débil, -: aglutinación negativa, p.i.: postinmunización, G1: grupo control, G2: grupo inmunizado con bacterina libre, G3:
grupo inmunizado con CI, NI: suero de peces no inmunizados.
6.5. Estallido respiratorio de leucocitos de salmón del Atlántico estimulados
in vitro con P. salmonis libre y complejada
Aunque con el ensayo del estallido respiratorio implementado utilizando
placas de 24 pocillos se logró medir la activación de los leucocitos de salmón del
Atlántico estimulados in vivo a través de la inmunización con formulaciones de
P.salmonis, en este estudio se comparó también la producción intracelular del anión
superóxido (O2.-) en leucocitos aislados del riñón anterior de salmones estimulados
in vitro con P. salmonis libre y complejada. Este ensayo se realizó en placa de 96
pocillos e incluyó además otras variaciones (detalladas en la sección de métodos),
con el fin de optimizarlo en términos de materiales y tiempo empleado.
De acuerdo a los resultados obtenidos, en comparación con el grupo control,
no se determinaron diferencias significativas entre los tratamientos con la bacterina
libre o complejada. Sin embargo, en cada punto de comparación el nivel de
respuesta frente a la bacterina libre fue ligeramente superior tanto al del grupo
control como frente a los CI. La activación fue dependiente de la dosis,
41
registrándose el mayor nivel de activación cuando se agregaron 5 μL, tanto de
bacterina libre como complejada, mientras que tras agregar volúmenes inferiores
(2,5 μL) o superiores a éste (10 μL), el nivel de respuesta medido fue menor para
cada tratamiento (Figura 10).
Fig. 10. Reducción del NBT por leucocitos de salmón del Atlántico
estimulados in vitro con P. salmonis libre y complejada. La producción
intracelular de anión superóxido (O2.-) en leucocitos del riñón de salmones del
Atlántico fue comparada después de la estimulación con volúmenes crecientes de
la bacterina libre diluida 1:100 (P. salmonis) o con complejos inmunes preparados
con una dilución 1:100 de la bacterina y una dilución 1:5.000 de antisuero policlonal
de conejo (CI). Los resultados se muestran como el promedio ± ES de la
absorbancia a 600 nm medida en duplicado para tres peces sometidos a los
distintos tratamientos. El grupo control corresponde a células no estimuladas.
42
7. DISCUSIÓN
Al igual que en otros países, las enfermedades infecciosas son parte de los
factores más serios que afectan el desarrollo de la acuicultura. En Chile, la
piscirickettsiosis es considerada la principal causa de mortalidades en los cultivos
de salmónidos al sur del país, y los intentos por controlar los brotes de la
enfermedad mediante el uso de antibióticos han sido infructuosos. Además, las
vacunas comerciales disponibles preparadas a base de bacterinas con el patógeno
completo han tenido resultados variables y la documentación sobre su eficacia en
pruebas experimentales y de campo es escasa. A partir de esto, se planteó la idea
de desarrollar una formulación que incluyera a la bacteria completa formando parte
de complejos inmunes basándose, primariamente, en los resultados obtenidos en
diversos modelos que demuestran que la administración de antígenos microbianos
como complejos inmunes mejora la inmunidad a nivel de respuesta innata y
adquirida (Brady, 2005). Posteriormente, con los antecedentes recopilados a partir
de estudios realizados en salmónidos, se trazaron las directrices del estudio
enfocándolo en la comparación del efecto de una formulación basada en complejos
inmunes con P. salmonis inactivada con el de una formulación preparada con la
bacterina libre, sobre el sistema inmune de salmón del Atlántico. De esta forma, se
evaluaron parámetros de la inmunidad innata, como el estallido respiratorio de los
leucocitos y la actividad de la lisozima, los cuales no se habían medido previamente
en estudios con este patógeno y en el modelo animal empleado (salmón del
Atlántico). Además, se estudió el efecto de los complejos inmunes sobre la
respuesta inmune humoral adquirida, comparando el nivel de anticuerpos en los
peces inmunizados.
Para realizar los ensayos de este estudio se dispuso de una cepa de P.
salmonis cultivada en la línea celular CHSE-214 para la que se calculó, previo a su
inactivación con formaldehído, un título de 1,316 x 109 TCID50/mL (Dosis Infectiva
del 50% del Cultivo Celular) según el método de Reed y Muench (1938). La
concentración de bacteria calculada por citometría de flujo fue aproximadamente un
43
orden de magnitud menor (7,5 x 107 bacterias/mL). Esta disminución se atribuyó al
proceso de semipurificación, mediante centrifugaciones diferenciales sucesivas, al
que se sometió la suspensión bacteriana para separarla de los restos celulares que
pudieran haber sido incorporados durante su recolección, lo cual puede haber
contribuido a la pérdida de parte de las bacterias. La tinción de la bacteria con el
colorante fluorescente EthD-1 (homodímero de etidio- 1), permitió distinguirla
eficientemente del material remanente en la suspensión bacteriana. Las
características estructurales del colorante le permiten penetrar específicamente en
células muertas. Además, su fluorescencia aumenta más de 40 veces después de
unirse a los ácidos nucleicos, por los que tiene una afinidad mucho mayor que otros
colorantes como bromuro de etidio o yoduro de propidio, lo cual resulta en que
prácticamente no se produzca fluorescencia de fondo y no se requiera lavar las
células después de agregarlo, requiriendo pequeños volúmenes de muestra y
cortos tiempos de incubación (Haugland y cols., 1994). Asimismo, la suspensión de
microesferas funcionó eficientemente como estándar para estimar el volumen de
muestra analizado calculándose concentraciones bacterianas muy similares en
distintos ensayos. Los resultados obtenidos demuestran que esta técnica puede
emplearse como un método alternativo para cuantificar P. salmonis u otros
patógenos de peces cuyas condiciones de cultivo hacen que deban someterse a
procesos durante los cuales pueden verse afectadas por pérdidas. En efecto, el uso
de colorantes de ácidos nucleicos en conjunto con las técnicas de citometría de
flujo ha resultado muy útil para la cuantificación e identificación de virus en sistemas
acuáticos, permitiendo análisis más rápidos de poblaciones con diferente
morfología y contenido de ADN (Brussaard, 2004).
El principal aporte del método empleado es que permitió hacer una
estimación más acorde a las condiciones temporales de la suspensión bacteriana,
de manera mucho más simple y rápida que el método de Reed y Muench, utilizado
tradicionalmente.
Los resultados obtenidos con vacunas basadas en bacterinas de patógenos
inactivados con formaldehído han sido muy buenos en el caso de patologías como
la vibriosis, sin embargo en el caso de P. salmonis los resultados han sido menos
efectivos (Sommerset y cols., 2005), evidenciando la complejidad de la elaboración
de una vacuna contra este patógeno. Una de las principales desventajas atribuidas
44
a estas vacunas sería la disminución de la inmunogenicidad del patógeno inducida
por el tratamiento con formaldehído. Aunque según las observaciones de Mason y
O’Leary (1991) las proteínas fijadas conservarían la estructura secundaria presente
antes de la fijación, se sabe que el formaldehído interactúa con diversos grupos del
esqueleto aminoacídico pudiendo alterar la constitución o estructura de los
antígenos (Montero, 2003).
Por esto, con el fin de mejorar las propiedades de la bacterina como vacuna,
en este estudio se prepararon CIs con P. salmonis inactivada con formaldehído y
antisuero policlonal de conejo. La elección de utilizar antisuero de conejo se basó
en los antecedentes recopilados que sugieren que los leucocitos de salmónidos
pueden interactuar con las inmunoglobulinas del suero de conejo, lo cual presenta
varias ventajas. En primer lugar, pueden obtenerse volúmenes considerablemente
mayores que los obtenidos en salmón del Atlántico, en segundo lugar, los títulos de
estos sueros son también mucho mayores que los determinados en peces, y por
último, en nuestro laboratorio se observó en reiteradas ocasiones que al someter el
suero de salmones a las temperaturas mencionadas en la literatura para su
inactivación, se producía la gelificación de éstos, reflejando un proceso de
desnaturación proteica, por lo que el uso de suero de conejos tendría una ventaja
adicional en términos de su manejo, ya que su inactivación es un método
estandarizado y durante el estudio se utilizó sin problemas.
La determinación de la proporción óptima antígeno:anticuerpo fue compleja.
Ensayos preliminares para determinarla mediante inmunodifusión y cuantificación
de proteínas no funcionaron o llevaron a resultados erróneos. Debido a estos
resultados se optó por determinar la proporción óptima antígeno-anticuerpo a través
de citometría de flujo. Este método funcionó muy bien ya que la determinación se
hizo rápidamente y el marcaje doble de los complejos permitió diferenciar
claramente la bacterina libre de la bacterina complejada, similar a lo descrito por
Houston y cols. (1974), quienes a través de una modificación a una técnica de
radioinmunoanálisis lograron determinar exitosamente la zona de equivalencia entre
el virus inactivado de la encefalitis equina venezolana (VEE) e IgG específicas.
Dada la gran cantidad de especies y la distancia evolutiva entre distintas
familias de teleósteos, es importante tener en cuenta que la inmunología de peces
45
no puede considerarse como un sistema homogéneo. Por lo tanto, es probable que
especies distintas tengan diferencias importantes en la forma en que combaten a
los patógenos y también en su respuesta a las vacunas (Sommerset y cols., 2005).
Tradicionalmente, la mayoría de los estudios en el desarrollo de vacunas
contra pisciricketsiosis para salmón del Atlántico se han enfocado en la evaluación
del nivel de anticuerpos y el porcentaje relativo de supervivencia tras el desafío.
Aunque este último ensayo es esencial para evaluar la eficacia de una vacuna, la
monitorización de mecanismos de la respuesta inmune innata de los peces tras una
inmunización puede proporcionar valiosos datos acerca de la evolución de esta
respuesta. Además, como las especies en cultivo se exponen permanentemente a
numerosas condiciones estresantes, un mayor conocimiento de la inmunología de
las especies piscícolas mejora nuestra capacidad para desarrollar vacunas
efectivas
Uno de los objetivos de este estudio fue comparar el efecto de dos
formulaciones con P. salmonis libre y complejada en coadyuvante, sobre algunos
parámetros innatos celulares y humorales en salmones del Atlántico. Para medir el
estallido respiratorio de los leucocitos del riñón anterior a través de la reducción de
NBT, se implementó un método basado en el descrito por Secombes (1990) ya que
en experimentos preliminares no se reprodujo. Los resultados de estos ensayos se
asociaron a la dificultad para obtener un número suficiente de leucocitos durante la
etapa de purificación por centrifugación en gradiente, probablemente porque los
salmones empleados, eran de menor tamaño (20-25g) que los utilizados en los
estudios de referencia (>100g). Otra dificultad observada fue la incapacidad de
adhesión de los leucocitos de salmón a la superficie de las placas plásticas o a la
de portaobjetos de vidrio, por lo que en los lavados requeridos durante el ensayo se
perdía la mayoría de las células. El ensayo implementado, incluyó el uso del riñón
anterior completo, lo cual incrementó el número de células disponibles. Además, el
recubrimiento de los pocillos de las placas con microcarriers facilitó la adherencia
de los leucocitos, según se pudo observar por microscopía. Con estas
modificaciones, se logró medir efectivamente la producción basal de ión superóxido
en los salmones incluidos en el ensayo de inmunización. Sólo se observaron
diferencias significativas entre los grupos al día 6 p.i., destacándose una elevada
46
respuesta de los peces inmunizados con CI, y al día 11 p.i., en que el grupo control
presentó una respuesta mayor que el grupo inmunizado con la bacterina sin
complejar. En estudios en los que se ha evaluado el estallido respiratorio de
salmones
del
Atlántico
expuestos
in
vitro
e
in
vivo
a
compuestos
inmunoestimulantes o tras la infección experimental con algún patógeno, se ha
demostrado que la adición de PMA (forbol miristato acetato), un activador del
estallido respiratorio, a los cultivos celulares aumenta la producción de especies
radicales de oxígeno revelando diferencias significativas que no se detectaron en
los cultivos no tratados (Brattgjerd y cols., 1994, Gross y cols., 2005). En este
estudio no se logró determinar una concentración estimuladora óptima de PMA en
ensayos preliminares, por lo que no se pudo evaluar su efecto sobre las mediciones
obtenidas. Sin embargo, la estimulación de la respuesta in vivo mostró algunas
diferencias importantes entre los tratamientos y dentro de cada grupo. Una
observación interesante, fue que la respuesta del grupo inmunizado con CI se
mantuvo constante y prolongada en el tiempo, en comparación con la respuesta
observada para la bacterina libre que mostró una tendencia a la disminución,
sugiriendo un rol importante de la interacción de los CI con los receptores Fc
presentes en los leucocitos, lo cual puede favorecer la inducción de una mejor
respuesta inmune en salmón del Atlántico.
Bajo las condiciones de estimulación in vitro, no se logró establecer
diferencias significativas entre los tratamientos y el control. Estos resultados
tendrían relación con el tiempo de exposición a los antígenos probados, ya que en
estudios con Salmo salar se describen prolongados períodos de estimulación,
además del uso de PMA (Dalmo y cols., 1995; Bridle y cols., 2005). Sin embargo,
pese al carácter preliminar del ensayo, la estandarización de las condiciones de
trabajo permitirá optimizar el protocolo implementado para futuras investigaciones.
Los factores innatos humorales se vieron afectados positivamente por la
administración de CI. En el grupo inmunizado con CI la actividad de la lisozima fue
significativamente mayor que la del grupo control durante todo el ensayo, y a partir
del día 11, el aumento de la respuesta del grupo inmunizado con CI fue el doble o el
triple de la respuesta del grupo inmunizado con la bacterina libre, lo cual demuestra
47
una mejora importante de la respuesta inmune innata de los salmones frente a P.
salmonis.
En comparación con la activación del estallido respiratorio, en el ensayo
de la actividad de la lisozima las diferencias significativas se distinguieron
notoriamente. Por otro lado, la activación del estallido respiratorio al día 6 y 11 p.i.
fue similar a la estimulación de la producción de lisozima en los días 11 y 14 p.i,
respectivamente. Los resultados de estos ensayos concuerdan en parte con el
trabajo de Paulsen y cols. (2001), quienes estudiaron la producción de lisozima in
vitro en cultivos de macrófagos del riñón anterior de salmón del Atlántico tratados
con LPS y β- glucano de levadura, sugiriendo que este órgano al cumplir una
función hematopoyética probablemente representa a una población de células en
diferentes estados de maduración, donde la producción de lisozima refleja una
combinación de activación y maduración de los macrófagos. De este modo, aunque
no se sabe si los altos niveles de lisozima observados en los salmones inmunizados
con CI protegen efectivamente al pez, los resultados del presente trabajo sugieren
que en salmón del Atlántico los mecanismos estudiados son regulados
diferencialmente en el tiempo, y son afectados distintamente según la forma de
administración de P. salmonis. La bacterina libre induciría una activación temprana
de respuestas innatas que luego van disminuyendo en el tiempo, teniendo incluso
efectos inmunosupresores que no fueron abolidos por la inactivación de la bacteria.
Los CI, en cambio, inducirían en una primera etapa una activación potente de las
funciones de defensa innata celulares en el riñón anterior, el cual posteriormente
daría origen a monocitos que una vez en el torrente sanguíneo se encargarían de la
producción de factores microbicidas como la lisozima.
Debido a la descripción de P. salmonis como un microorganismo intracelular
estricto, se ha asignado un rol secundario a la repuesta inmune humoral adquirida
de los salmónidos frente a este patógeno (Kuzyk y cols., 1996). Sin embargo, se ha
demostrado para numerosos patógenos intracelulares, la capacidad de los
anticuerpos de modificar el curso de la infección en beneficio del huésped
(Casadevall, 2003). En este estudio se evaluó la cinética de la producción de
anticuerpos contra P. salmonis en el suero de salmones del Atlántico incluidos en el
ensayo de inmunización. Dada la alta variabilidad registrada, no fue posible
48
determinar diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Sin
embargo, dentro de cada grupo se observaron tendencias en el desarrollo de la
respuesta destacando que al igual que en los ensayos de la inmunidad innata, el
grupo inmunizado con la bacterina libre experimentó una tendencia a la disminución
de su respuesta, siendo en el día 65 p.i., significativamente menor que en los días
36 y 43 p.i. Esto concuerda con las observaciones de Smith y cols. (1997), quienes
evaluaron la respuesta inmune humoral adquirida de salmones coho inmunizados
con diversas formulaciones preparadas con distintas concentraciones de la
bacterina. Aunque no se proporcionaron mayores detalles, después del día 60 p.i. la
magnitud de la respuesta disminuyó constantemente tanto en el grupo inmunizado
con la formulación sin coadyuvante como en la que lo contenía, lo cual sugiere que
la presencia de éste no suprime los efectos inmunosupresores aparentemente
presentes en la bacterina, siendo incluso perjudicial si se considera el hecho de que
una de las propiedades de los coadyuvantes consiste en la liberación lenta de
pequeñas cantidades del antígeno, sometiendo al pez a una exposición prolongada
a los factores inmunosupresores del patógeno.
La respuesta observada en el grupo control, cuyo nivel de anticuerpos igualó
durante gran parte del ensayo al del grupo inmunizado con CI, sugirió la exposición
previa de los peces a microorganismos que poseen estructuras antigénicas
similares a antígenos de P. salmonis. El ensayo de aglutinación aclaró en parte
estas observaciones al mostrar la reacción positiva de los sueros de todos los
grupos y también de sueros de individuos no inmunizados con Arthrobacter aislada
de ovas de salmón. La reacción cruzada de antígenos de P. salmonis con
anticuerpos policlonales de conejo anti-Arthrobacter se ha descrito previamente a
través de ensayos de Western blot que determinaron una fuerte afinidad de estos
anticuerpos por ciertas proteínas de P. salmonis. Estos experimentos demostraron
que ciertas proteínas de ambas bacterias presentan reactividad cruzada, indicando
que aquellas proteínas de Arthrobacter pueden estimular al sistema inmune a
producir anticuerpos potencialmente capaces de reconocer y proteger contra cepas
virulentas de P. salmonis (Salonius, 2005). Por otro lado, la reacción observada
frente a Flavobacterium psychrophilum demostró la probable exposición previa a
este patógeno. Estas observaciones sugieren que podría compartir estructuras
antigénicas con P. salmonis, las cuales, en estudios con vacunas polivalentes, se
49
han asociado a la presencia de epítopes comunes dentro del LPS (Nikoskelainen y
cols., 2007). Estos resultados demuestran que la medición del nivel de anticuerpos
frente a P. salmonis puede verse fuertemente afectada por la exposición previa a
microorganismos con los que podría compartir estructuras antigénicas, lo cual es
una condición muy probable bajo las condiciones de cultivo intensivo de salmones.
50
8. CONCLUSIONES
 La utilización de técnicas de citometría de flujo en conjunto con colorantes
fluorescentes de ácidos nucleicos, permitió optimizar la cuantificación de P.
salmonis inactivada sometida a procesos de semipurificación. Asimismo,
facilitó la determinación de la proporción óptima de bacterina y antisuero,
necesaria para preparar
complejos inmunes,
requiriendo pequeñas
cantidades de muestra y cortos tiempos de incubación.
 La inmunización con complejos inmunes con P. salmonis mejoró la
respuesta inmune innata en salmón del Atlántico ya que indujo una mayor
actividad de los leucocitos comparado con la bacterina libre, lo cual fue
demostrado por el aumento de la actividad de la lisozima en suero, y la
producción de ión superóxido.
 No se determinaron diferencias estadísticamente significativas en el nivel de
anticuerpos entre el grupo control y los grupos inmunizados con P. salmonis
libre y complejada, detectándose además una respuesta semejante entre el
grupo control y el grupo inmunizado con complejos inmunes. Los resultados
del ensayo de aglutinación sugirieron la exposición previa de los peces a
microorganismos que pueden compartir estructuras antigénicas con P.
salmonis.
 Bajo las condiciones del estudio, la formulación de P. salmonis inactivada
preparada en coadyuvante produjo efectos inmunosupresores en salmón del
Atlántico.
 No se determinaron diferencias significativas en la actividad del estallido
respiratorio de leucocitos de salmón tratados in vitro con complejos inmunes
o con la bacterina libre. La respuesta inducida por ambos tratamientos fue
similar y sugirió una dependencia de la dosis agregada.
51
9. PROYECCIONES
 Debido al impacto negativo de la piscirickettsiosis en la salmonicultura
nacional y la gran importancia del salmón del Atlántico para esta industria,
con los resultados obtenidos en este estudio, se espera contribuir a la
profundización en el conocimiento de la respuesta inmune de esta especie
frente a P. salmonis. Por otro lado, aportar herramientas metodológicas para
futuras investigaciones que estudien, la correlación entre el nivel de
protección inducido y su duración, con la evaluación de la inmunidad innata
y adquirida, de manera que sea posible predecir la efectividad de vacunas
experimentales en etapas tempranas luego de la inmunización.
 Los resultados obtenidos en este estudio proporcionan evidencia preliminar
sobre la aplicación de complejos inmunes en el campo de la vacunación de
Salmo salar contra la piscirickettsiosis. Esto ha permitido proyectar nuevas
investigaciones con el fin de desarrollar una vacuna que otorgue una
protección duradera que cubra el ciclo de vida productivo del salmón del
Atlántico.
52
10. REFERENCIAS
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