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Tierra Tropical (2011) 7 (1): 109-115
IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE CAUSAL DE LA MARCHITEZ
BACTERIANA DEL NACEDERO (Trichanthera gigantea)
G. Suchiapa, A. Valverde, F. Elango1
Universidad EARTH
Las Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica
Recibido 4 de diciembre 2010. Aceptado 15 de junio 2011.
RESUMEN
El nacedero (Trichanthera gigantea) es un arbusto de importancia para el ámbito de la nutrición
animal en muchas regiones de América tropical y algunos países asiáticos. Dado a su
importancia se han comenzado investigaciones sobre una enfermedad que está afectando al
cultivo, la cual su cuadro característico es un marchitamiento progresivo de la planta hasta que
alcanza la muerte. El objetivo principal de esta investigación fue identificar el agente causal de la
marchitez bacteriana de nacedero y determinar su relación con la marchitez bacteriana de las
solanáceas causada por Ralstonia solanacearum mediante ensayos de invernadero y pruebas de
laboratorio. Se determino que la bacteria causal de la marchitez del nacedero y la R.
solanacearum fueron morfológicamente similares en las pruebas de movilidad, hipersensibilidad
y la tinción de Gram. Sin embargo, la inoculación cruzada de plántulas de tomate con la bacteria
de nacedero y las plántulas de nacedero con R. solanacearum no marchitaron las plántulas
correspondientes, indicando que estas agentes causales eran diferentes. Un análisis BIOLOG
realizado en la UCR la identifico la bacteria del nacedero como R. picketti.
Palabras clave: inoculación cruzada, marchitez bacteriana, nacedero, Ralstonia solanacearum,
tomate, Trichanthera gigantea.
ABSTRACT
Nacedero (Trichanthera gigantea) is a shrubby forage crop of great importance in the diet of
farm animals in the tropical regions of Latin America and Asia. An unknown destructive disease
characterized by a progressive wilting and death of affected plants has been observed in Costa
Rica. The main objective of this research was to determine the causal agent of the disease and
establish its possible relationship to the bacterial wilt disease of Solanaceous plants caused by
Ralstonia solanacearum. Results showed many morphological similarities between the two
bacterial pathogens in colony characteristics, motility and hypersensitivity test as well as in the
Gram staining reaction. Cross-inoculation tests of tomato seedlings with the nacedero bacterium
and nacedero seedling with R. solanacearum did not produce any wilt symptoms, suggesting that
the two bacteria were different. A confirmatory BIOLOG test at the University of Costa Rica
identified the nacedero pathogen as R. pickettii.
Key words: cross inoculations, bacterial wilt, nacedero, Ralstonia solanacearum, tomato,
Trichanthera gigantea.
1
Contacto: Fritz Elango ([email protected])
ISSN: 1659-2751
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INTRODUCCIÓN
El nacedero (Trichanthera gigantea) pertenece al orden Tubiflorales y a la familia Acanthaceae,
comprendiendo cerca de 200 géneros y más de 2000 especies distribuidas en las regiones
tropicales y subtropicales. Es común en muchas zonas de Colombia (estribaciones de las tres
cordilleras, Sierra Nevada de Santa Marta) donde se le conoce con diferentes nombres como
cajeto, madre de agua, quiebrabarrigo, yátago, cenicero y aro. Este arbusto forrajero posee una
amplia zona de confort que va desde 0 m.s.n.m. a 2400 m.s.n.m y se desarrolla con
precipitaciones muy variables, que van desde 500 mm a 5000 mm anuales (Ríos, 2002).
Según Ríos (2002), el nacedero se utiliza en alimentación para animales y permite reemplazar
parte de los concentrados comerciales y reducir los costos de producción, de esta manera se
facilita la cría de animales en las fincas. En el contexto de fincas campesinas, esta posibilidad de
producir proteína animal a partir de recursos locales permite fortalecer la seguridad alimentaria.
Se han realizado muchos estudios enfocados a sus características y potenciales nutricionales
(Sarria, 1994; Ospina, 2002). Sin embargo, no existe mucha información con respecto a las
enfermedades que atente contra la especie.
En la Universidad EARTH, el nacedero existente en las diferentes fincas fue introducido desde el
CATIE, hace 15 años aproximadamente, debido a que es un suplemento forrajero con importante
contenido proteínico utilizado dentro de la dieta de los animales (cerdos, aves, caprinos, bovinos,
bufalinos y peces). Desde hace 15 años, se detecto una enfermedad bacteriana vascular, la cual
está provocando la muerte del forraje (Castro, 2005). Los síntomas que presenta esta enfermedad
se asemejan a aquellos que presentan plantas infectadas con raza 1 de Ralstonia solanacearum,
la cual es causante de la marchitez bacteriana de las solanáceas (tomate, tabaco, chile dulce,
berenjena, entre otras).
Esta investigación tuvo como objetivo determinar la causa de la bacteriosis de nacedero
mediante pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas y asimismo establecer la relación
entre los agentes causales de la bacteriosis de nacedero y la R. solanacearum. La información
permitiría a entes gubernamentales como el MAG y los productores de las solanáceas a combatir
esta enfermedad destructiva que podría afectar cultivos establecidos y de importancia económica,
dado a la similitud en sintomatología entre esta bacteriosis y la R. solanacearum en las
solanáceas. También, esa información ayudaría desarrollar medidas adecuadas de manejo.
MATERIALES Y MÉTODOS
El proyecto se realizó en la Universidad EARTH, la cual está ubicada en la provincia de Limón,
Costa Rica. Se realizó un proceso de aislamiento de la bacteria que causa la enfermedad de
nacedero y el aislamiento del patógeno causal (R. solanacearum) de las solanáceas, donde se
obtuvieron cultivos puros para realizar las pruebas de inoculación cruzada. De esta manera se
hizo la caracterización en laboratorio e invernadero.
Se tomaron trozos pequeños del tallo marchito de la base de la planta, las cuales fueron
desinfectadas en una solución de hipoclorito de sodio al 3 %. Después de este proceso, se
enjuagaron los trocitos de nacedero en agua destilada esterilizada. Al material se le hizo la
prueba de flujo con agua destilada esterilizada para posteriormente aislar las bacterias de los
tejidos vasculares. Con la suspensión de las bacterias obtenidas, se diluyo en agua destilada
esterilizada y se procedió a sembrar en placas por estría en medio Kelman más sal de tetrazolio y
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en medio de agar nutriente, para que mediante este método obtener cultivos puros en un lapso de
tiempo de 48 horas.
La suspensión de bacterias obtenidas mediante la prueba de flujo fue estriada en cajas de petri
estériles con medio de cultivo especializado para bacterias (agar nutriente), donde se dejo
incubar a temperatura ambiente (26 °C) por un periodo de dos días. Luego se tomaron las
colonias típicas y se fueron colocadas en medios inclinados de agar nutriente, para de esta
manera poder aislar las colonias de las dos bacterias asociadas con el nacedero y tomate,
respectivamente. Cada muestra que incubada de la misma manera, durante dos días y conservada
en el refrigerador a 4 °C.
Para activar las bacterias se utilizo caldo nutriente, que sirve como medio para la activación y
reproducción de bacterias del cultivo previamente separado. Posterior a la activación, se
multiplico con el respaldo del aparato orbit shaker durante 36 h a 500 rpm.
Para la fase de invernadero, se utilizaron plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) de cinco
semanas y yemas de nacedero enraizadas con anterioridad. El método utilizado para enraizar las
yemas de nacedero fue colocando las yemas en un recipiente limpio con agua del grifo, y
cambiándolo todos los días; estos como parte de los materiales para la de prueba de
patogenecidad de las bacterias aisladas en el laboratorio. Se utilizó un sustrato de granza de arroz
y carbón debidamente esterilizado, para prevenir cualquier tipo de contaminación externa.
Teniendo las bacterias del nacedero y R. solanacearum como cultivo puro, se hizo inoculación
de plántulas de tomate y plántulas enraizadas de nacedero (bacteria de nacedero infectando
plántulas de nacedero y bacteria de R. solanacearum infectando plántulas de tomate), para
comprobar la patogenecidad de las misma. Posteriormente, se trasplantaron en suelo esterilizado,
realizando de la misma forma la prueba con bolsitas plásticas. Cuatro días después se realizó la
prueba del flujo para comprobar la infección de la enfermedad.
Para el proceso de inoculación cruzada, se estableció en el invernadero un cultivo de plantas de
nacedero y tomate (solanáceas). Se utilizaron yemas sanas que tuvieran tres o más nudos
aproximadamente; éstas fueron obtenidas de las parcelas de la Finca Integrada Orgánica de la
universidad. Antes de este proceso de trasplante, se inocularon las plantas con una suspensión del
cultivo puro de la bacteria, mediante un corte parcial de raíces con tijeras esterilizadas con
alcohol al 95 % y la sumersión de las mismas en una suspensión bacteriana de 48 horas
previamente multiplicado en el caldo nutriente.
Este mismo proceso se realizó con las plantas de tomate, para así poder determinar la
patogenecidad de las bacterias por separado en ambos cultivos. Una vez que se estableció el
experimento, se procedió a realizar evaluaciones diarias para ver la evolución de la enfermedad.
Las evaluaciones respectivas fueron de carácter cualitativo, en donde se pretendía observar las
presencia de síntomas externos en la plantas. Durante el desarrollo del estudio se repitió la
inoculación de todas las plantas tres veces, para disminuir el margen de error en cuanto el efecto
de la enfermedad en las plantas de nacedero y tomate.
Se realizaron pruebas específicas para caracterizar las bacterias procedentes de las plantas de
nacedero enfermas. Estas pruebas fueron: tinción de gram, prueba de movilidad,
hipersensibilidad, color de las colonias de las bacterias en agar nutriente y agar Kelman más sal
de tetrazolio.
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La prueba de tinción de Gram facilitó la caracterización de las bacterias al separarlas en las
categorías de gram positiva y gram negativa. Para la prueba de motilidad, se usó un cultivo de la
bacteria de 24 h previamente inoculado en caldo nutriente. Se observó el comportamiento de la
bacteria con el microscopio.
La prueba o test de hipersensibilidad consiste en la inoculación del mesófilo de una hoja de una
planta con el objetivo de conocer si la bacteria inoculada es o no una bacteria fitopatógena. La
planta reconoce como patógena a la bacteria inoculada en su mesófilo produciendo una reacción
de hipersensibilidad y la zona inoculada se necrosa rápidamente, en 24 h a 48 h (Figura 1). Esta
prueba permite descartar a las bacterias no patógenas que puedan haber sido aisladas durante el
proceso de diagnóstico de una enfermedad, permitiendo agilizar el proceso de diagnóstico de las
enfermedades bacterianas, ya que nos permite descartar en forma rápida aquellas bacterias
contaminantes o saprófitas y saber cuál de los aislamientos que hemos hecho es la bacteria
fitopatógena con la cual seguiremos trabajando (Klement et al., 1990).
Figura 1. Prueba de hipersensibilidad en planta de tabaco.
El BIOLOG es una prueba de identificación de bacterias desconocidas basada en la utilización de
fuentes de carbono por las bacterias. Esta consiste en el uso de una cajita plástica, la cual tiene
noventa y seis hoyos, cuyo propósito es evaluar la habilidad que tiene la bacteria para utilizar
noventa y cinco tipos de diferentes de fuentes de carbono en la presencia de la tinción indicadora
y comparando resultados con un perfil según una base de datos y de esta manera obtener
similitudes. De esta manera, puede al menos identificar el género de la bacteria. Esta prueba se
realizó en el Laboratorio de Microbiología del Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA) de
la Universidad de Costa Rica (UCR).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como se muestra en el cuadro1., se presenta Se comparó las características de la bacteria
proveniente de las plantas de nacedero con la bacteria de las solanáceas conocida como
R. solanacearum (Cuadro 1). Ambas bacterias tenían la misma reacción de Gram y de
hipersensibilidad. La forma de ellos fueron igual, ambas tenían motilidad y en el agar nutriente
las colonias fueron de color blanco (Cuadro 1). Una de las características más importantes de
dicha comparación fue la presencia de un halo blanco alrededor de un centro rojo en la bacteria
de R. solanacearum, el cual es típico de la misma. En contraste a la bacteria analizada en la
planta de nacedero no presentó ese halo característico (Figuras 2 y 3).
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Cuadro 1. Caracterización de bacterias de nacedero y tomate.
Prueba
R. solanacearum
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Bacteria de nacedero
Reacción Gram
-
-
Forma de células
Bastón
Bastón
Agar nutriente (color)
Blanco
Blanco
Rojo con halo blanco
Rojo
Hipersensibilidad
+
+
Movilidad
+
+
Patogenicidad en plantas de tomate
+
No se presentó
No se presentó
+
Kelman + sal tetrazolio
Patogenicidad en plantas de nacedero
Figura 2. Bacteria de R. solanacearum con su típico halo blanco.
Figura 4. Bacteria de la planta de nacedero, sin el halo blanco característico de las
R. solanacearum.
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Se utilizo tres tipos de inoculación en la plantas de nacedero y de tomate, teniendo esta ultima
como representación de la familia de las solanáceas. La primera técnica fue la inoculación en la
axila de hojas propuesta por Fahy y Hayward (1983) y utilizado por Valbuena (2003). La
segunda fue el método de raíces que consistió en cortar parte del tejido radicular, para permitir la
entrada del patógeno en la planta. El último método fue la inoculación del suelo.
Se utilizaron estos tres métodos por su facilidad de aplicación y además, de dar resultados de una
manera más rápida en las plantas inoculadas. Según Klement et al. (1990), los resultados de
investigaciones que involucran inoculaciones en el sistema vascular de las plantas se pueden ver
afectadas por condiciones ambientales, climática, condiciones contrarias en lugar de trabajo y
tipo de tejido inoculado. Por eso, las condiciones del lugar de trabajo deben tener buenas
características de infraestructura y microclima (humedad relativa, temperatura).
Aunque se determinó que las bacterias causales de la marchitez del nacedero y la marchitez de
solanáceas fueron morfológicamente similares, no se logró comprobar la patogenecidad cruzada.
La bacteria de nacedero no infectó las plantas de tomate y la bacteria de R. solanacearum no
logró infectar las plántulas de nacedero (Cuadro 1). Debido a ese resultado, se sometió la
bacteria a un análisis de BIOLOG, realizado en la Universidad de Costa Rica. La prueba
BIOLOG identificó el agente causal del marchitamiento en el nacedero como R. pickettii.
CONCLUSIONES
Se determinó que las bacterias causales de la marchitez del nacedero y la marchitez de
solanáceas (R. solanacearum) fueron morfológicamente similares. Sin embargo, la bacteria de
nacedero no infectó las plantas de tomate y la bacteria de R. solanacearum no logró infectar las
plántulas de nacedero. Mediante el análisis de BIOLOG, el agente causal del marchitamiento en
el nacedero (fue identificado como R. picketti.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio se pudo realizar gracias al financiamiento brindado por la Administración
Académica y la Unidad de Investigación de la Universidad EARTH, Guácimo, Costa Rica.
LITERATURA CITADA
Castro, J. 2005. Etiología de la bacteriosis del nacedero (T. gigantea) y su posible relación con
la marchitez bacteriana (R. solanacearum). [Proyecto de Graduación Lic. Ing. Agr.].
Guácimo (CR) : Universidad EARTH. 39 p.
Fahy, PC. y Hayward, AC. 1983. Media and methods for isolation and diagnostic tests. In Fahy,
PC. y Persley, GJ. (eds.). Plant bacterial diseases a diagnostic guide. New South Wales
(AU) : Academic Press. p. 337-378.
Klement, Z.; Rudolph, K. y Sands DC. 1990. Methods in phytobacteriology–inoculation methods
for vascular wilts. Budapest (HU) : Akademiai Kiado. 568 p.
Ospina, SD. 2002. Establecimiento de la colección nacional de procedencias de Trichanthera
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Gray, y bore Alocasia macrorrhiza (Linneo.) Schott. Cali (CO) : CIPAV. p. 115-127. ISBN
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Ospina, SD. y Murgueitio, E. (eds.). Tres especies vegetales promisorias: nacedero
Trichanthera gigantea (H. & B.) Nees, botón de oro Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray, y
bore Alocasia macrorrhiza (Linneo.) Schott. Cali (CO) : CIPAV. p. 97-114. ISBN 958-938632-6.
Sarria, P. 1994. Efecto del nacedero (Trichanthera gigantea) como reemplazo parcial de la soya
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(CO) : CIPAV. [consultado 27 febrero 2010]. Disponible en el World Wide Web:
<http://www.lrrd.org/lrrd6/1/sarria1.htm>.
Valbuena, OE. 2003. Resistencia inducida en el control de la marchitez bacteriana (Ralstonia
Solanacearum) en tomate. [Proyecto de Graduación Lic. Ing. Agr.] Guácimo (CR) :
Universidad EARTH. 50 p.