Download La DVB (diarrea viral bovina) y la enfermedad de las mucosas (EM

la formación de burbujas en las cúpulas. Tras los tres lavados, pasar al punto siguiente.
5 – Añadir en cada pocillo utilizado 100µl de conjugado. Incubar la placa a 37°C
durante ½ hora.
6 – Escurrir la placa con la solución de lavado como se describe en el punto 4.
7 – Distribuir el TMB sobre la microplaca a razón de 100µl por pocillo. La solución
debe ser totalmente incolora. Si se hace visible una coloración azul, será índice de que
la solución está contaminada con peroxidasa. Si esto sucede, la solución debe ser
eliminada y se debe preparar una nueva mezcla con material limpio.
8 – Incubar durante 10 minutos a 21°C +/-3°C al abrigo de la luz. Este período de
tiempo se da a título indicativo puesto aue en algunos casos convendrá acortarlo o
alargarlo.
9 – Distribuir la solución de interrupción a razón de 50µl por pocillo.
10 – Registrar las densidades ópticas con un espectrofotómetro para placas utilizando
un filtro de 450 mm. Se deben registrar los resultados cuanto antes tras la aplicación
de la solución de interrupción. De hecho, en caso de una señal elevada, el
cromógeno puede cristalizar y desembocar en medidas erróneas.
BIO-X KIT ELISA SEROLÓGICO BVDV (BIO K 230)
(Test de competición del suero sanguíneo)
KIT PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BVDV A TRAVÉS DEL MÉTODO ELISA.
I - INTRODUCCIÓN
VI – CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Calcular las densidades ópticas medias de los sueros positivo y negativo (DO pos y DO
neg) así como las de todas las muestras (DO muestras).
Para cada muestra examinada y para el suero positivo, calcular el porcentaje de
inhibición (%inh) aplicando las fórmulas siguientes :
%inh muestra = [(DO neg – DO muestra) / DO neg]*100
%inh positivo = [(DO neg – DO pos) / DO neg]*100
VII – VALIDACIÓN DEL TEST
El test sólo se puede validar si se cumplen las dos condiciones siguientes:
-
DO neg – DO pos >0,7
%inh positivo >50%
VIII – INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Determinar el nivel de positividad de las muestras utilizando los valores de corte (bajo y
alto) recogidos en el control de calidad del kit.
Bio-X Diagnostics – Site du Complexe des Postes – 49, rue J. Wauters – 5580 Jemelle – Belgique
Tél : 0032(0)84.32.23.77 - Fax : 0032(0)84.31.52.63 E-mail : [email protected] (27/03/08)
La DVB (diarrea viral bovina) y la enfermedad de las mucosas (EM) son dos entidades
clínicas diferentes causadas por un mismo virus. La DVB es el resultado de una
infección aguda en animales susceptibles que puede sobrevenir a cualquier edad de la
vida post-natal. La mortalidad de la DVB es débil, puesto que la afección es de corta
duración. Opuestamente, la enfermedad de las mucosas es una afección de morbilidad
débil pero cuya mortalidad es muy significativa. Esta enfermedad de las mucosas se
desarrolla en animales virémicos contaminados in útero. La característica de esta
infección in útero es la existencia de una inmunotolerancia específica que impide que
los animales produzcan anticuerpos contra la cepa infectante pero no contra otra cepa
de DVB diferente antigénicamente. Estos animales infectados de manera persistenete
por el virus pueden no desarrollar signos clínicos durante un período muy largo de
tiempo y la única manera de decelerarlos es tener acceso a los tests de laboratorio. Si
bien el único método válido de detección en estos animales infectados de manera
persistente es la prueba del virus DVB, es posible acceder a un test serológico para
evitar la obligación de someter a todos los animales de una explotación a una prueba
del virus DVB a partir de leucocitos. De hecho, es entre los animales perfectamente
seronegativos que hay más probabilidad de encontrar animales infectados de manera
persistente. No obstante, no hay que olvidar que podemos encontrar igualmente en este
grupo animales que nunca han estado en contacto con el virus. Los tests serológicos
permiten igualmente seguir la evolución serológica de los animales en proceso de
vacunación e identificar a los animales contaminados por el virus DVB siguiendo su
seroconversión.
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II – PRINCIPIO DEL TEST
Las microplacas de 96 pocillos han sido sensibilizadas con un anticuerpo monoclonal
específico de la proteína NS3 del virus DVB (anteriormente P80). Este anticuerpo se
utiliza para purificar la proteína a partir de un lisado de células infectadas por el virus
DVB. El usuario del test deposita en las cúpulas de la microplaca los sueros sanguíneos
que van a ser examinados previamente diluídos. Tras una incubación de dos horas y
una etapa de aclarado, se añade el conjugado, un anticuerpo monoclonal específico de
la proteína NS3 del virus DVB unido a la peroxidasa. Tras la incubación y el lavado de
la preparación, se añade el substrato de la enzima, el peróxido de hidrógeno, así como
el cromógeno, la tetrametilbenzidina (TMB). Este cromógeno presenta la doble ventaja
de ser más sensible que los otros cromógenos de la peroxidasa y de no ser
carcinogénico. La intensidad de la coloración es inversamente proporcional a la
presencia sérica de la muestra. Se proporcinan los sueros de control positivo y negativo
con el kit de modo que sea posible establecer la validez de los resultados obtenidos.
III - COMPONENTES DEL KIT
Microplacas : 2 microplacas de 96 pocillos (12x8). La totalidad de las microplacas está
sensibilizada con la proteína viral.
Solución de lavado : 1 frasco de 100 ml de solución de lavado concentrada 20 veces.
La solución cristaliza espontáneamente al frío. En caso de utilización parcial de la
solución, llevar el frasco a 21°C +/-3°C de modo que desaparezcan todos los cristales ;
mezclar bien la solución y extraer el volumen necesario. Diluir 20 veces el tampón en
agua destilada o desmineralizada. Almacenar la solución diluída a 4°C.
Tampón de dilución : un frasco de 60 ml de tampón de dilución. Almacenar la
solución a 4°C. Si aparece un depósito en el fondo del frasco, filtrar la solución con un
papel filtro Whatman.
Conjugado : 1 frasco de 25 ml de conjugado anti-proteína NS3 del virus DVB :
(anticuerpo monoclonal anti-proteína NS3 del virus DVB junto a la peroxidasa de
rábano). El reactivo está listo para su uso.
Suero positivo : 1 frasco contiene el suero positivo. Reconstituir este suero con 0,5ml
de aguadestilada o desmineralizada. Tras su reconstitución, el suero se conserva a 20°C. Repartir este reactivo en varias fracciones antes de congelar para evitar los ciclos
de congelación-descongelación. Si se respetan estas precauciones el reactivo se puede
conservar durante varios meses.
Suero negativo : 1 frasco contiene el suero negativo. Reconstituir este suero con 0,5ml
de aguadestilada o desmineralizada. Tras su reconstitución, el suero se conserva a 20°C. Repartir este reactivo en varias fracciones antes de congelar para evitar los ciclos
de congelación-descongelación. Si se respetan estas precauciones el reactivo se puede
concervar durante varios meses.
Solución de TMB monocomponente: 1 frasco de 25 ml de cromógeno TMB
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(tetrametilbenzidina). Este reactivo se conserva a 4°C al abrigo de la luz. Está listo para
ser utilizado.
- Solución de interrupción: 1 frasco de 15ml de solución de interrupción contiene ácido
fosfórico 1 M.
IV – PRECAUCIONES DE USO
- Este test sólo puede ser utilizado para un diagnóstico “in vitro”. Uso con objetivos
estrictamente veterinarios.
- Los reactivos se deben conservar entre 4°C y 8°C. El conjugado se debe conservar a
4°C. Tras la reconstitución, los sueros de referencia se deben conservar a -20°C. Los
reactivos no están garantizados si la fecha de caducidad ya ha pasado y/o no se han
conservado en las condiciones descritas en este documento.
- No utilizar reactivos que provengan de otros kits.
- Es importante velar por la calidad del agua utilizada para preparar las diversas
soluciones del kit. Así, no se debe utilizar agua que pueda contener agentes oxidantes
(hipoclorito sódico) o sales de metales pesados puesto que podrían reaccionar con el
cromógeno.
- Descartar las soluciones contaminadas por bacterias u hongos.
- La solución de interrupción contiene ácido fosfórico 1 M. Manipular este producto
con precaución.
V – PROCEDIMIENTO
1 – Todos los componentes del kit deben ser llevados a 21°C +/-3°C al menos 30
minutos antes de su utilización.
2 – Retirar el embalaje de la microplaca. Diluir la solución de lavado concentrada 20x
en agua destilada. Comprobar que todos los cristales han desaparecido antes de diluir la
solución. Conservar la solución diluída a 4°C.
3 – Diluir a ½ los sueros sanguíneos en el tampón de dilución. Proceder de la misma
manera con los sueros de referencia (sueros positivo y negativo). Distribuir las
muestras diluídas a razón de 100µl por pocillo. Proceder de la misma manera con los
sueros de referencia (sueros positivo y negativo). Incubar 2 horas a 37°C.
4 – Enjuagar la placa con la solución de lavado preparada según las modalidades
definidas en el apartado « Componentes del kit ». Para ello, eliminar el contenido de la
microplaca girándola bruscamente sobre un fregadero. Escurrir la microplaca al revés
sobre una hoja de papel absorbente limpia de manera que el líquido quede eliminado.
Mediante una matraz de lavado o la inmersión en un recipiente de dimensión adecuada,
llenar las cúpulas utilizadas con la solución de lavado y luego vaciar de nuevo la placa
dándole otra vez la vuelta sobre un fregadero. Repetir dos veces la operación evitando
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