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PrioCHECK® CSFV Ab 2.0
ELISA para detección in vitro de anticuerpos contra el virus de la peste porcina clásica en suero y plasma porcino
5 placas para 450 muestras
©
Prionics AG
Instrucciones de uso
Versión 1.1_es
Introducción
El virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), también
conocido como virus de la peste porcina, pertenece al
género de los pestivirus (junto con el virus de la
diarrea viral bovina y el virus de la enfermedad de la
frontera) de la familia Flaviviridae. La CSF es una
enfermedad viral contagiosa que afecta a los cerdos
(lista A de la OIE). Sus brotes provocan graves pérdidas económicas en los países con producción porcina,
por lo que la rápida detección de un cerdo infectado
es esencial para evitar que el virus se extienda y
controlar la enfermedad.
El CSFV está muy relacionado con los pestivirus que
causan la diarrea viral bovina (BVD) y la enfermedad
de la frontera (BD). Especialmente en granjas porcinas próximas a ganado con BVD o BD, se pueden
producir reacciones cruzadas entre anticuerpos contra
BVDV o BDV que pueden ocasionar falsos positivos
en la ELISA. Para evitar estos falsos positivos, Prio®
CHECK CSFV Ab 2.0 detecta anticuerpos contra el
dominio A de la proteína E2 del CSFV (3). Se sabe
que este dominio es más específico para el CSFV que
los dominios B, C y D.
®
PrioCHECK CSFV Ab 2.0 detecta anticuerpos contra
cepas de CSFV de alta, moderada y leve virulencia
poco tiempo después de la infección. La detección de
los anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia es de suma importancia para trazar infecciones
subclínicas por CSFV.
®
PrioCHECK CSFV Ab 2.0 combina un procedimiento
práctico y sencillo con una alta sensibilidad y especificidad y es ideal para análisis a gran escala.
Principio del ensayo
®
El reactivo clave de PrioCHECK CSFV Ab 2.0 es un
anticuerpo monoclonal (MAb) dirigido contra un sitio
1
antigénico del dominio A de la proteína envoltura E2
(GP-55) del CSFV (3, 4). Se ha escogido el dominio A
ya que es más específico para el CSFV que los
dominios B, C y D de E2.
El diluyente y la muestra se colocan en los pocillos de
la placa y se incuban a 37±1°C. Luego, las placas se
lavan, se agrega Mab HRPO a los pocillos y se vuelve
a incubar a 37±1°C. Después de lavar las placas
nuevamente, se añade a los pocillos la Solución de
sustrato Cromógeno lista para usar. El desarrollo del
color se detiene después de incubar la placa a
22±3°C. La presencia o ausencia de anticuerpos
contra la peste porcina clásica se determina midiendo
el desarrollo del color a una longitud de onda de 450
nm.
Componentes del kit
Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de
vencimiento real. La vida útil de los componentes
diluidos, abiertos o reconstituidos figura a continuación. Tiene a su disposición los datos de los riesgos
químicos en la sección "Normas de seguridad y
declaraciones de I+S" (Apéndice II).
Componente 1
Placa de ensayo
Se suministran cinco placas de ensayo en bolsas
selladas con desecante.
Componente 2
Conjugado (30x)
(Concentrado 30X, diluir antes de usar).
Un vial con 2,5 ml de conjugado.
El conjugado diluido no es estable, por lo que debe
prepararse antes de ser utilizado.
Componente 3
Diluyente de conjugado (listo para usar)
Un vial con 60 ml de diluyente de conjugado
Componente 4
Líquido de lavado (200X)
(Concentrado 200X, diluir antes de usar).
Un vial con 60 ml de líquido de lavado.
Vida media de la solución de lavado: 1 semana a
22±3°C.
Componente 5
Diluyente de muestra (listo para usar)
Dos viales con 11,0 ml de diluyente de muestra listo
para usar.
Componente 6
Control positivo (listo para usar)
Un vial con 2,2 ml de control positivo.
Componente 7
Control positivo débil (listo para usar)
Un vial con 2,2 ml de control positivo débil.
Componente 8
Control negativo (listo para usar)
Un vial con 2,2 ml de control negativo.
Componente 9
Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar)
Un vial con 60 ml de Solución de sustrato Cromógeno.
Componente 10
Solución de frenado (lista para usar)
Un frasco con 60 ml de solución de frenado.
Contenido adicional del kit:
- Instrucciones de uso
- 10 selladores de placas
- Certificado de análisis
Material necesario adicional
General:
Equipo de laboratorio según las normas de seguridad
nacionales.
Incubación:
Incubador de micro-placas (que llegue hasta al menos
50°C).
Análisis de los resultados:
Lector de placas Multiscan EX o equivalente.
El lector debe tener un filtro apropiado para leer
placas a 450 nm.
Opcional:
Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray
Washer o equivalente.
Sólo para diagnóstico in vitro de uso veterinario
Guardar a 5±3°C
Nº de producto 7610600
Procedimiento del ensayo
Precauciones
Deben seguirse estrictamente todas las disposiciones
nacionales cuando se trabaja con muestras de anima®
les. PrioCHECK CSFV Ab 2.0 debe ser utilizado en
laboratorios adecuados para este propósito.
Las muestras tienen que considerarse siempre como
potencialmente infeccionas; y aquellos objetos que
entren en contacto con las muestras, deben manejarse como potencialmente contaminados.
Tiene a su disposición los de los riesgos químicos en
la sección "Normas de seguridad y declaraciones de
I+S" (Apéndice II).
Notas
®
Para lograr resultados óptimos con PrioCHECK
CSFV Ab 2.0, debe tenerse en cuenta lo siguiente:
El protocolo debe seguirse estrictamente
Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a
temperatura ambiente (22±3°C) antes de ser utilizados.
Las puntas de las pipetas deben cambiarse
luego de cada uso.
Cada reactivo debe colocarse en un recipiente
diferente.
Los componentes del kit no deben ser utilizados
si se observan cambios en su aspecto o luego
de su fecha de vencimiento.
No debe utilizar componentes con diferente
número de lote al mismo tiempo.
Se debe usar agua desmineralizada para el
ensayo.
SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS
Dilución del conjugado
Prepare la dilución del conjugado (30X; componente
2) 1/30 en diluyente de conjugado (Componente 3).
Por ejemplo, para realizar un ensayo con una placa,
prepare 12 ml de solución (agregue 0,4 ml de conjugado concentrado (30x) a 11,6 ml de diluyente de
conjugado).
Nota: Debe preparar la dilución de trabajo justo
antes de usarla.
Solución de lavado
El líquido de lavado (200x) (Componente 4) debe
diluirse 1/200 en agua desmineralizada y es suficiente
para un volumen final de 12 litros de solución de
lavado.
La solución de lavado puede almacenarse durante 1
semana a 22±3°C.
Nota: El mal lavado de las placas puede producir un fondo
alto. Es preferible utilizar un equipo automático para el lavado,
aunque puede también pueden usarse pipetas multicanal o
sumergir las placas de ensayo en solución de lavado diluida.
En cualquiera de estos casos, no es necesario remojar la placa
entre cada lavado. Se necesita un volumen mínimo de 200 µl
por pocillo para un lavado correcto de las placas.
INCUBACIÓN DEL SUERO
1.1
1.2
1.3
1.4
1
El Comité Internacional de Taxonomía de los Virus (ICTV, por sus siglas
en inglés) ha cambiado la designación para la proteína de la envoltura E1
(GP-55) del CSFV a E2 (Australia, septiembre, 1995).
Agregue 20 µl de diluyente de muestra
(Componente 5) a cada pocillo (Componente 1).
Agregue 80 µl de control negativo (Componente
8) a los pocillos A1 y B1.
Agregue 80 µl de control positivo débil (Componente 7) a los pocillos C1 y D1.
Agregue 80 µl de control positivo (Componente
6) a los pocillos E1 y F1.
PrioCHECK® CSFV Ab 2.0
1.5
1.6
1.7
1.8
Agregue 80 µl de muestra a uno (ensayo individual) o dos pocillos adyacentes (ensayo por duplicado) de la placa de ensayo.
Selle las placas con el sellador indicado.
Agite con suavidad las placas.
Incube las placas 60±5 minutos a 37±1°C.
INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO
2.1
2.2
2.3
2.4
Vacíe las placas y lávelas 6 veces con 200 a
300 µl de solución de lavado. Golpee bien las
placas (invertidas sobre papel absorbente) después del último ciclo de lavado.
Agregue 100 µl de conjugado diluido a cada
pocillo.
Selle las placas con el sellador indicado.
Incube las placas 30±1 minutos a 37±1°C.
INCUBACIÓN CON SUSTRATO CROMÓGENO
(TMB)
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
Vacíe las placas y lávelas 6 veces con 200 a
300 µl solución de lavado diluida por pocillo.
Golpee bien las placas después del último ciclo
de lavado.
Agregue 100 µl de la Solución de sustrato
Cromógeno (Componente 9) a cada pocillo.
Incube las placas 20 minutos a 22±3°C.
Agregue 100 µl de la solución de frenado
(Componente 10) a cada pocillo.
Mezcle el contenido de los pocillos de las
placas.
Nota: Añada la solución de frenado 20 minutos después de haber llenado el primer pocillo con la Solución
de sustrato Cromógeno.
Agregue la solución de frenado en el mismo orden y
lugar que la Solución de Sustrato Cromógeno.
LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS
RESULTADOS
4.1
4.2
4.3
Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a
450 nm, dentro de los 15 minutos siguientes a la
finalización del desarrollo del color.
Calcule la DO450 media del control negativo
(Pocillos A1 y B1). Éste es el valor máximo de la
DO450.
Calcule la inhibición porcentual (IP) del control
positivo débil, del control positivo y de las
muestras según la siguiente fórmula:
La DO450 de todas las muestras se expresa como la
inhibición porcentual (IP) relativa a la DO450 máx.
IP = 100 -
DO450 muestra
----------------------------DO450 máx.
Interpretación de la inhibición porcentual
IP = < 40 %
(negativo)
La muestra no contiene anticuerpos específicos para
CSFV.
IP = ≥ 40%
(positivo)
La muestra contiene anticuerpos específicos para
CSFV.
Apéndice I
Nota informativa
Este manual se considera completo y correcto en el
momento de su publicación. Prionics AG no asume
ninguna responsabilidad por daños fortuitos o consiguientes en relación con o tras el uso de este manual.
Responsabilidad
Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las
correspondientes especificaciones publicadas, siempre que se usen de acuerdo con las instrucciones
correspondientes que sean del caso y dentro de la
fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no
da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay
ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para
un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los
datos, especificaciones y descripciones de los productos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo
escrito explícito firmado por un representante autorizado de Prionics AG. Cualquier representación oral o
escrita en contradicción con esta garantía o con
dichas publicaciones no está autorizada y, si ha sido
dada no es de fiar.
En caso de incumplimiento de la garantía susodicha,
la única obligación de Prionics AG consistirá, a su
elección, en reparar o remplazar el producto en
cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente
notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora.
Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta
incapaz de reparar o restituir el producto o parte del
mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos
los efectivos pagados por el producto o la parte en
cuestión.
Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por
daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o
de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier
cliente como consecuencia del uso de sus productos.
Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas
certificadas ISO 9001:2000.
Apéndice II
x 100
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Criterios de validación
5.1 La DO450 media del control negativo (pocillos A1
y B1) debe ser > 1,0.
5.2 La inhibición porcentual del control positivo débil
debe ser >50%.
5.3 La inhibición porcentual del control positivo debe
ser >80%.
5.4 Si no se cumplen estos criterios, debe descartar
el/los resultado/s del ensayo.
Nota:
Si la DO450 de una muestra es superior a la
DO450 máxima, la inhibición porcentual puede interpretarse como 0%.
Si la DO450 media del control negativo es inferior
a 1,000, la solución de sustrato cromógeno
(TMB) puede estar demasiado fría. En ese caso,
caliente la solución hasta 22±3°C o incúbela durante 30 minutos.
Si la DO450 media del control negativo es superior a 2,000, se recomienda un periodo de incubación más corto de la solución cromógeno
(TMB) sustrato.
Normas de seguridad y declaraciones de I+S
1. Deben seguirse estrictamente las normas nacionales de seguridad.
Declaraciones I+S
Componente 1
Placa del ensayo
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 2
Conjugado (30x)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 3
Diluyente de conjugado
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 4
Solución de lavado (conc. 200x)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 5
Diluyente de muestra
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 6
Control positivo (listo para usar)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 7
Control positivo débil (listo para usar)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 8
Control negativo (listo para usar)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 9
Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las regulaciones de la UE.
Componente 10
Solución de Frenado
Código de riesgo:
R35: provoca quemaduras graves.
S26: en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante agua y concurrir a un medico
S36/37/39: utilizar indumentaria y guantes adecuados
y protección para los ojos/la cara.
S45: en caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).
Apéndice III
Bibliografía
1) Holm Jensen, M. Acta Vet. Scand. 22, 85-98, 1981.
2) Wensvoort, G., Bloemraad, M. and Terpstra, C.
Vet. Microb. 17, 129-140, 1988.
3) Wensvoort, G. J. Gen. Virol. 70, 2865-2876, 1989.
4) Wensvoort, G., Boonstra, J. and Bodzinga, B.G. J.
Gen. Virol. 71, 531-540, 1990.
5) Colijn, E., Bloemraad, M. and Wensvoort G. Vet.
Microbiol. 59, 15-25, 1997.
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