Download 2. Vida y muerte de los microorganismos

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
1
2. Vida y muerte de los
microorganismos
2.1. Crecimiento
Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la
duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la
biogénesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven
súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la
mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del
crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras
que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo
(1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo
unicelular .
Después de la inoculación de
una porción de medio con unas
pocas células, transcurre un
período de tiempo (fase de
latencia) antes de que se
establezca
una
velocidad
constante de crecimiento, debido
a que el microorganismo tiene
una intensa actividad metabólica
para adaptarse al nuevo medio
de cultivo antes de poder
duplicarse. Cuando el cultivo
alcanzó una velocidad constante
de crecimiento se dice que está
en la fase exponencial debido a
que el número de células se
puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación
experimentado por la población (3). Una bacteria originará cuatro células (2 2 ) después
de dos ciclos, dieciseis (24 ) después de cuatro ciclos, etc.
Cada célula de bacteria o levadura da, por escisión o gemación, dos células y el
número inicial X o de células (en el instante to=0) se convierte, después de n
generaciones en un tiempo t, en X = X o. 2n
Como n representa el número de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t,
el tiempo de generación g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln X o + t.ln 2/g *
El término ln 2/g es la velocidad específica de crecimiento (µ) de la población o sea µ
= 0,69/g
La ecuación * puede escribirse bajo la forma lnX
- lnX o = µ.t por lo tanto X = X o.eµt
y dX/dt = µX
En el curso de la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento alcanza su
valor más elevado (µmáx).
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En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede ser de 20
minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7
horas.
Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que
permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por
ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida,
más temprano o más tarde, por la fase de muerte (3).
En los estudios de la cinética del crecimiento individual de los microorganismos
pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observó que:
a) la velocidad de extensión de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las
mismas y a la velocidad específica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden
crecer exponencialmente;
b) cada ápice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad
de aumento de la biomasa;
c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas
por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificación) (4).
2.2. Tipos de nutrición
Los organismos fotosintéticos y los que obtienen energía por oxidación de
compuestos inorgánicos suelen usar generalmente CO2 como fuente única o principal
de carbono (autótrofos). Pero, la mayoría de los microorganismos del laboratorio son
heterotróficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgánico y nitrógeno asimilables,
así como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus
constituyentes celulares a partir de un único compuesto orgánico que sirve tanto de
fuente de carbono y de energía, y de una fuente inorgánica u orgánica de nitrógeno (1).
Metabolismo energético de los microorganismos (1)
tipo de organismos
dependientes de
fotótrofos
radiación solar
fotolitótrofos= autótrofos
dadores de electrones inorgánicos
fotoorganótrofos
dadores de electrones orgánicos
quimiótrofos
compuestos químicos
quimiolitótrofos= autótrofos
oxidación de compuestos inorgánicos
quimioorganótrofos= heterótrofos
oxidación o fermentación de compuestos
.
orgánicos
Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que
crece como simbionte en los nódulos de la raíz de leguminosas, así como
cianobacterias, pueden fijar el nitrógeno gaseoso de la atmósfera, es decir reducirlo
convirtiéndolo en nitrógeno orgánico. Por otra parte, las formas parásitas obligadas
obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5).
En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos,
los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayoría
de los microorganismos hace uso del amonio como fuente única o principal de
nitrógeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal
como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan también muchos otros
elementos, como fósforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre,
cinc y molibdeno (1)
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2.3. Factores de crecimiento
Son los compuestos, necesarios en pequeña cantidad, que debe suministrar el medio
para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que
requieren un determinado factor de crecimiento son auxotróficos para ese compuesto.
Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 µg/mL de
biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).
2.3.1. Factores orgánicos
Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminoácidos,
nucleótidos o vitaminas. Éstos son generalmente aportados por los extractos de
levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades
demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las
células de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no
excretan ácido glutámico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en
biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminoácidos,
por ejemplo Leuconostoc mesenteroides, pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6).
Vitaminas del grupo B
ácido nicotínico (niacina)
ácido pantoténico
riboflavina (B2 )
ácido fólico
biotina
cobalamina (B12 )
piridoxal- piridoxina (B6 )
tiamina (B1 )
Función (1)
precursor de piridín-nucleótidos (NAD y NADP)
“
“ coenzima A
“
“ flavín-nucleótidos (FMN, FAD)
participa en transferencia de grupos metilo
“
“ biosíntesis de ácidos grasos, fijación de CO2
“
“ síntesis de desoxirribosa y transferencia de
restos monocarbonados
“
“ transformaciones de aminoácidos y cetoácidos
“
“ α-descarboxilaciones
2.3.2. Factores minerales
La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos
los seres vivos, pero todo es cuestión de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un
cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiológicos. Algunos elementos
esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la
actividad de enzimas específicas (1). Además, algunos seres vivos tienen requerimientos
minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las
diatomeas (7).
2. 4. Transporte de solutos
El transporte de nutrientes a través de la membrana citoplasmática es específico
porque son captados por la célula solamente aquéllos para los cuales existe un sistema
transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los
procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K +) produciendo
alteraciones en el potencial electroquímico. Las fuerzas que intervienen son el
transporte de electrones respiratorio o fotosintético, o las bombas iónicas dependientes
del ATP o de la descarboxilación de metabolitos. El transporte secundario está guiado
por gradientes en el potencial electroquímico (9).
La difusión pasiva o simple esté gobernada por el tamaño molecular y las
propiedades lipofílicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares
y ciertos inhibidores. La difusión facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una
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permeasa específica para el substrato y depende de la concentración de substrato en el
medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la célula.
El transporte activo y la trasladación del grupo se parecen a la anterior en que
participan proteínas específicas y difieren en que necesitan la provisión de energía. El
nutriente puede ser acumulado dentro de la célula. En el transporte activo la molécula
liberada en el interior de la célula es idéntica a la del exterior, mientras que en la
trasladación del grupo la molécula fue modificada durante el transporte, por ejemplo
por fosforilación en el caso de un azúcar (9).
Se distinguen diferentes procesos de transporte activo según la vía por la cual se
dispone de la energía necesaria: potencial protón, ATP o fosfoenolpiruvato. El
transporte de muchas substancias (azúcares, iones inorgánicos y orgánicos) es
empujado por el potencial protón, La célula bacteriana mantiene dicho potencial por
bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen
proteínas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas proteínas
tiene una función específica. Por ejemplo, una proteína cataliza el transporte
simultáneo de una molécula de azúcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protón en la
misma dirección, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces más) substancias.
Otras
proteínas
catalizan el transporte
simultáneo de dos
substancias
en
direcciones opuestas,
por ejemplo un protón
y otro ión (Na+ o un
ácido orgánico), lo
que
se
llama
antiporte, como se
muestra en la figura 2.
En
las
células
procarióticas
la
entrada de azúcares a
la célula es favorecida
por
un
simporte
acoplado
a
H +,
mientras que en las
eucarióticas está casi
siempre acoplado a
Na+. Además de los
sistemas de transporte
que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP,
donde intervienen las proteínas del espacio periplásmico en las proteobacterias (8) .
Cuando el transporte ocurre mediante trasladación de grupos, la molécula
transportada es modificada químicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u
otro azúcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del
fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2).
En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentración del Fe+++ es a lo sumo 10 -18
moles/L pues se forma el hidróxido férrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias
excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++
que permitan transportado. Tales substancias se denominan sideróforos y son
compuestos fenólicos e hidroxamatos (9).
La levadura de cerveza posee distintos sistemas específicos para la captación de cada
ión metálico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a
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Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmática, luego interviene un sistema de
baja afinidad para su incorporación a las células con hierro, pero cuando hay una
deficiencia limitante del crecimiento actúa otro sistema de captación de alta afinidad.
La levadura también tiene dos sistemas de captación para la incorporación de
manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patógenas la virulencia depende de la
capacidad del microorganismo para obtener iones metálicos del hospedador.
El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captación de iones metálicos
de los microorganismos permite obtener vegetales transgénicos que aprovechan mejor
los nutrientes del suelo o secuestran metales tóxicos como, por ejemplo unas plantas
donde se había expresado un gen que les posibilitó convertir el Hg++ en Hgo (11).
2.5. Factores ambientales
El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es
uno de los sitios más dinámicos en interacciones biológicas de la naturaleza.
Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgánica
muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo
(12).
2.5.1. Agua y presión osmótica
La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en términos de
actividad del agua (aw), la que se define como la razón entre la presión de vapor de
agua del substrato o solución (p ) y la presión de vapor del agua pura (po) a la misma
temperatura, es decir, aw = p/p o
Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmósfera en equilibrio con el
sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100
La mayor parte de las bacterias no crecen a una a w por debajo de 0,91 mientras que los
mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores más bajos obtenidos para
arqueobacterias halófilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerófilos
(amantes de la sequedad) y las levaduras osmófilas (que prefieren presiones osmóticas
elevadas) se multiplican muy lentamente aún con valores de 0,65 y 0,60
respectivamente. Los límites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son más
amplios a la temperatura óptima de multiplicación. La capacidad de los organismos
para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce al aw . La
presencia de ciertos elementos nutritivos amplía los límites de aw dentro de los cuales
los organismos pueden sobrevivir (3).
La presión osmótica (θ) está relacionada con la actividad del agua a través una
expresión
θ = -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R ), la
temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el
volumen molar parcial del agua (v ) (3).
El potencial agua de un suelo ψ es la suma de los potenciales osmótico, matricial (o
capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo
es también una medida indirecta del potencial agua.
El potencial osmótico de la solución del suelo (π ) puede expresarse mediante la
π = -RT ρ υ m φ /109 donde ρ es la densidad del agua, υ los iones por
molécula de soluto, m la molalidad, φ el coeficiente osmótico a la molalidad m y la
temperatura T°K.
El potencial matricial (τ) está dado por la ecuación τ = (RT ρ ln p/p o) /106 M
donde M es el peso molecular del agua.
ecuación
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6
El término capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado
después de la saturación, cuando la velocidad de la pérdida de agua debida a la
gravedad es pequeña. No es una medida precisa (12).
Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y
están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión
osmótica interna (1). En contraposición a la diversidad de concentraciones de potasio y
sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una
concentración más elevada que la del medio externo. Además de neutralizar las cargas
negativas de la célula y de regular la función enzimática, el potasio actúa como un
soluto implicado en la regulación osmótica de algunos organismos Algunos
organismos halófilos que viven en ambientes de alta salinidad sódica, por ejemplo
Halobacterium, son la excepción a esta regla (10). Los organismos que son capaces de
crecer a elevadas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos.
Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden
distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua (ψ) óptimo y mínimo para
el crecimiento:
grupo 1. óptimo –0.1 MPa, mínimo alrededor de –2MPa; contiene algunos hongos y
una variedad de bacterias Gram-negativas;
grupo 2. óptimo alrededor de –1 MPa, mínimo alrededor –5MPa; contiene
principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos;
grupo 3. óptimo alrededor de –1MPa, mínimo –10 a –15 MPa; contiene una variedad de
ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram-positivas (12).
2.5.2. Tensión superficial
La tensión superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un
microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de
película o velo en los medios corrientes con una tensión superficial entre 57 y 63 dinas,
pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en
forma difusa (13). La humectabilidad es función de la tensión superficial. Las soluciones
de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeños e incluso hasta el
centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedaría por encima sin mostrar
penetración alguna.
2.5.3. pH
El pH del medio puede influir sobre la expresión de genes y regular el transporte de
protones, la degradación de los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o
básicas y aún la virulencia. Las células perciben los cambios del pH ambiente a través
de diferentes mecanismos. La protonacíón y desprotonación de los aminoácidos
inducida por el pH, puede alterar la estructura proteínica secundaria y por lo tanto la
función que señala el cambio. La célula puede responder sólo a una de las formas de las
moléculas de señal. Por ejemplo, los ácidos orgánicos atraviesan la membrana
citoplasmática solamente en la forma protonada y un aumento de la concentración
intracelular indicaría un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a
través de la membrana puede servir, por sí mismo, como un sensor para ajustar los
procesos dependientes de la energía (8).
El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crítico en el cual las proteínas
internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres
mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta
homeostática, la respuesta de tolerancia al ácido y la síntesis de proteínas de ‘shock’
acídico (14).
A pH ambiental mayor que 6,0 las células bacterianas ajustan su pH interno a través
de la respuesta homeostática modulando la actividad de las bombas de protones,
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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos
del citoplasma. El mecanismo homeostático es constitutivo y funciona en presencia de
inhibidores de la síntesis proteica.
La respuesta de tolerancia al ácido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este
mecanismo es sensible a los inhibidores de la síntesis proteica y puede mantener el pH
interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La pérdida de
la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los
inhibidores metabólicos, anula la respuesta de tolerancia al ácido pero no el mecanismo
homeostático. Esta respuesta también puede conferir protección cruzada frente a otros
agentes ambientales de estrés.
La síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico es la tercera vía por la que la célula regula
el pH interno. Esta síntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo
un conjunto de proteínas reguladoras distintas de las proteínas de la respuesta de
tolerancia al ácido.
Bacterias
Thiobacillus thiooxidans
Azotobacter sp.
Erwinia carotovora
Clorobium limicola
Thermus aquaticus
Nitrobacter spp.
Hongos
Aspergillus oryzae
Fusarium oxysporum
Penicillium italicum
Rhizoctonia solani
Botrytis cinerea
Aspergillus niger
Rango de pH para el crecimiento (2)
límite inferior
óptimo
0,5
2,0-3,5
5,5
7,0-7,5
5,6
7,1
6,0
6,8
6,0
7,5-7,8
6,6
7,6-8,6
1,6
1,8
1,9
2,5
<2,8
2,8
límite superior
6,0
8,5
9,3
7,0
9,5
10,0
9,3
11,1
9,3
8,5
7,4
8,8
Aunque para la mayoría de las bacterias el pH óptimo para el crecimiento se
encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidófilas (Thiobacillus), algunas son ácidotolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores,
rizobios, actinomicetos y bacterias ureolíticas). Por su parte, los hongos prefieren
valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un
medio de pH 5, pero no a pH 8 (15). Algunos organismos productores de ácidos no son
ácido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por
ejemplo ciertas enterobacterias (2).
2.5.4. Oxígeno
El metabolismo de los microorganismos está fuertemente influído por el oxígeno
molecular. Los organismos que dependen de la respiración aeróbica, para los cuales el
oxígeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aeróbicos estrictos. Un
ejemplo de éstos es la actinobacteria Streptomyces. Por el contrario para los organismos
anaeróbicos estrictos el oxígeno es generalmente tóxico. Las células somáticas de las
bacterias del género Clostridium son muy sensibles al oxígeno mientras que los
endosporos están protegidos de su efecto letal. Un grupo intermedio de organismos,
los anaeróbicos facultativos, pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno
molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su
energía tanto de la fermentación como de la respiración. Por otro lado están los
organismos que únicamente toleran al oxígeno, como algunas bacterias lácticas que
8
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
obtienen su energía exclusivamente de la fermentación sin ser dañadas por el oxígeno.
Ciertas bacterias aeróbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentración de
oxígeno es reducida y se las denomina microaerofílicas (14).
2.5.5 Potencial de reducción
El potencial de reducción de un substrato es aquel en que dicho substrato gana
electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se
crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV).
Cuanto más oxidada esté una substancia más positivo será su potencial eléctrico, y
cuanto más reducida el potencial será más negativo.
El potencial de reducción de un sistema se expresa con el símbolo Eo’. Los
microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores Eo’ positivos mientras que
los anaeróbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo’ negativo. Entre las
substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se
encuentran los aminoácidos con un grupo tiol (-SH) y los azúcares con un grupo
aldehído libre (15).
2.5.6. Temperatura
En muestras de agua recogidas en las proximidades inmediatas a las surgencias
termales se han hallado hasta 108 - 109 células bacterianas por mL. Las bacterias
adaptadas a elevadas presiones hidrostáticas (250–260 bares o sea 25-26 MPa) muestran
además una notable adaptación a las altas temperaturas, por ejemplo unas bacterias
metanogénicas tenían tiempos de duplicación entre 37 y 65 minutos a 100°C bajo tales
presiones (16).
Temperaturas cardinales en °C para microorganismos procarióticos (17)
grupo
mínima
óptima
máxima
termófilos
40-45
55-75
60-90
mesófilos
5-15
30-45
35-47
psicrotrofos
-5-+5
25-30
30-35
psicrófilos
-5-+5
12-15
15-20
Los valores de las temperaturas cardinales (mínima, óptima, máxima) varían
ampliamente entre las bacterias como se muestra en el cuadro siguiente, pero algunas
tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12
y 50°C. Los organismos aislados de ambientes fríos crecen a temperaturas por debajo
de 0°C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelación del medio (1).
Temperaturas en °C para el crecimiento de bacterias (1)
especie
mínima
óptima
máxima
Listeria monocytogenes
1
30-37
Pseudomonas maltophila
4
35
Escherichia coli
10
37
Clostridium kluyveri
19
35
Bacillus flavothermus
30
60
Thermus aquaticus
40
70-72
Sulfolobus acidocaldarius
70
75-85
Pyrobacterium brockii
80
102-105
45
41
45
37
72
79
90
115
Los mohos psicrotrofos pertenecen a los géneros Cladosporium, Fusarium, Penicillium,
Trichothecium y las levaduras a Candida, Cryptococcus, Torulopsis, Rhodotorula (18).
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Temperaturas cardinales de algunos hongos (18,19)
temperatura °C
grupo
mínima
óptima
Alternaria solani
2
27
Aspergillus fumigatus
12
35
Botrytis cinerea
0
20
Fusarium moniliforme
<5
25
Rhizoctonia solani
2
25-30
Trichothecium roseum
<10
30
9
máxima
45
55
30
35
35
35
La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y en los
rangos inferiores el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas. Los
microorganismos eucarióticos, por ejemplo protozoos, son más sensibles a las bajas
temperaturas que los procarióticos, y entre estos últimos los gram negativos son más
afectados que los gram positivos (17).
2.6. Medios de cultivo
El medio sirve de reservorio para los nutrientes. El componente dominante es casi
siempre el agua. También en el caso en el que los microorganismos se hallen sobre un
substrato sólido, por ejemplo cereales o forrajes, éste debe estar húmedo para permitir
la acción microbiana o enzimática.
Medios complejos para el enriquecimiento de bacterias heterótrofas (21)
base: extracto de levadura 1%, KH 2PO4 0,1%, MgSO4 0,02%
incubación: 30°C, en la obscuridad
fuente
condiciones
agregado
organismos
suelo
pH 7,0 - aerobiosis
--oxidantes de aminoácidos
"
pH 3,0 - anaerobiosis glucosa 2%
Sarcina sp.
suelo pasterizado pH 7,0 - aerobiosis
--Bacillus spp.
"
pH 7,0 - anaerobiosis --Clostridium fermentadores
de aminoácidos
"
pH 8,0 - aerobiosis
urea 5%
Bacillus pasteurii
"
pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%,
Clostridium fermentadores
CaCO3 2%
de azúcares
vegetales, leche,
pH 6,5 - anaerobiosis glucosa 2%
bacterias lácticas
frutas, cerveza
pH 6,0 - aerobiosis
etanol 4%
bacterias acéticas
suelo, agua
pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%,
bacterias coliformes
residual
CaCO3 2%
queso suizo
pH 7,0 - anaerobiosis lactato Na 2% bacterias propiónicas
Los microorganismos heterotróficos pueden utilizar azúcares, alcoholes y
aminoácidos como fuente de energía. Algunos son capaces de emplear polisacáridos,
como almidón y celulosa, al tener la posibilidad de hidrolizar estos compuestos hasta
azúcares sencillos. Loa aminoácidos y nucleótidos suelen constituir la fuente primaria
de nitrógeno y para obtenerlos, algunos organismos son capaces de degradar péptidos,
proteínas y polinucleótidos. También las grasas son utilizadas como fuente de energía,
aunque sólo un número relativamente pequeño de microorganismos las atacan (20).
Además del carbono, los nutrientes primordiales son nitrógeno y fósforo que se
incorporan como amonio o nitrato, y fosfato. Otros nutrientes, tales como vitaminas e
iones metálicos, se requieren en pequeña cantidad (micronutrientes) y suelen estar,
como contaminantes, en los componentes principales de los medios de cultivo e incluso
10
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en los recipientes de vidrio que los contienen. Cuando el oxígeno es necesario para el
metabolismo, la fuente usual de suministro es el aire filtrado (5).
La mayoría de los mohos, así como unas pocas bacterias y levaduras, cuando crecen
sin alteraciones, forman una película fuerte y contínua en la superficie del medio. En
cambio, si crecen bajo el efecto de una agitación vigorosa, originan bolitas de una pulpa
fibrosa dispersadas por todo el medio fluído (20).
Los requerimientos nutritivos de los mohos son muy parecidos a los de las levaduras,
salvo que los mohos presentan más diversidad en los tipos de substratos orgánicos que
pueden asimilar (5). En el laboratorio un medio corriente es el extracto de malta, con o
sin extracto de levadura y agar. Para el crecimiento de algunos mohos se utiliza un
medio definido constituído por sacarosa y sales minerales conocido como agar Czapek,
a veces adicionado de extracto de levadura. Cuando se desea aislar hongos osmófilos se
le agrega 20 a 50% de sacarosa (18).
Un medio con cloruro de amonio y otras sales, sin ninguna fuente de carbono, cuando
se incuba aeróbicamente tendrá disuelto CO2 atmosférico y en presencia de luz
permitirá el crecimiento de algas y cianobacterias. Pero si se incuba en la obscuridad
facilitará el desarrollo de bacterias que obtienen energía por oxidación del amonio (20).
Medios para el enriquecimiento de bacterias fotosíntetizantes (21)
base: NH 4 Cl 0,1%; K2 HPO 4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2
0,0002%; NaMoO4 0,0001%
incubación: 25 - 30°C, iluminación constante, sin aire
agregado
pH
organismos
Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5%
7,5
bacterias verdes del azufre
Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5%
8,0 - 8,5 bacterias purpúreas del azufre
Na malato 0,5% + ext de levadura 0,05% 7,0 - 7,5 bacterias purpúreas no del azufre
Medios sintéticos para el enriquecimiento de bacterias autotróficas (21)
base: K2 HPO4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%;
NaMoO4 0,0001%
incubación: 25 - 30°C, en la obscuridad
agregado
pH
atmósfera
organismos
NH4 Cl 0,15% + CaCO3 0,5%
8,5
aire
Nitrosomonas
NaNO2 0,3%
8,5
aire
Nitrobacter
NH4 Cl 0,1% + Na2 S2 O3 0,7%
7,0
aire
Thiobacillus
NH4 NO3 0,3% + Na 2 S 2 O3 0,7% + NaHCO3 0,5%
7,0
sin aire
T. denitrificans
NH4 Cl 0,1%
7,0
H 2 85%,
O2 10%,
bacterias
.
CO2 5%
del hidrógeno
Sea cual fuere la composición química del medio, es necesario que todos los
componentes estén perfectamente mezclados, de modo que el microorganismo tenga
acceso a todos los nutrientes. La mayoría de las bacterias y algunas levaduras crecen
comúnmente como células individuales o como agregados de varias de ellas, y
permanecen suspendidas en el medio. Cuando se trata de una población densa o las
células secretan polímeros, el medio fluído se vuelve viscoso y además, pueden formar
grandes agregados o crecer como una película mucosa sobre la superficie.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
11
2. 7 Esterilización
2.7.1. Acción del calor
Con el fin de evitar el crecimiento de microorganismos extraños introducidos por la
contaminación, se esterilizan con vapor de agua a presión todos los materiales que
integran el medio de cultivo. El vapor también se suele emplear para esterilizar
recipientes y otras superficies con las que el medio está en contacto (20).
Tiempo de destrucción de algunos endosporos bacterianos (2)
calor húmedo
minutos a
organismo
100
105
110
bact. termófilas
...
400 100-300
Bacillus anthracis
2-15
5-10
...
B. subtilis
horas ...
…
Clostridium tetani 5-90
5-25
…
C. perfringens
5-45
5-27
10-15
C. botulinum
300-530 40-120 32-90
C.sporogenes
150
45
12
calor seco
minutos a
organismo
120
130
bacilos termófilos
...
...
B. anthracis
...
...
C. botulinum
120
60
C.pefringens
50
15-35
C. tetani
…
20-40
115
40-110
...
40
…
4
10-40
...
120
11-35
...
…
…
1
4-20
...
125
4-8
...
…
…
…
...
...
130
3,5
...
…
…
…
...
...
1340 C
1
...
…
…
...
...
...
140
...
>180
15-60
5
5-15
150
180
60-120
25
…
30
160
30-90
9-90
20-25
…
12
170
15-60
1800 C
15
3
5-10
…
1
10-15
…
5
Los factores que afectan a la termodestrucción pertenecen a tres tipos generales:
(a) factores intrínsecos, por ejemplo diferencias entre cepas y especies, entre
endosporos y células somáticas;
(b) factores ambientales que ejercen su influencia durante el crecimiento y la
formación de las células o los endosporos, como edad, temperatura y medio de
cultivo;
(c) factores ambientales que actúan durante el tratamiento térmico de las células o los
endosporos, por ejemplo pH, aw , medio de suspensión, tipo de substrato, sales y
otros compuestos orgá nicos o inorgánicos.
Los endosporos bacterianos son muy resistentes a la temperatura, algunos pueden
incluso sobrevivir tratamientos de varios minutos a 120°C en ambiente húmedo.
Cuando se utiliza el calor para destruir los microorganismos presentes en una película
líquida es posible utilizar tratamientos muy cortos, pero la esterilización de algunos
sólidos exige horas debido a las dificultades impuestas por la penetración del calor (17).
El autoclave es un aparato cuyo funcionamiento se basa en que la temperatura de
ebullición del agua aumenta con la presión. Por consiguiente si la presión absoluta del
vapor en el recipiente cerrado se eleva a 2,02 kg/cm2 la temperatura subirá hasta 1200 C.
La presión absoluta es la suma de la presión atmosférica y la presión manométrica del
autoclave. La temperatura de una mezcla de vapor y aire a determinada presión es
inferior a la del vapor solo, por lo que debe evacuarse todo el aire de la cámara de
esterilización (1). Otra precaución importante es la de que el vapor se introduzca bien en
los materiales sometidos a esterilización. El tiempo de funcionamiento depende de la
naturaleza y volumen del material que se esteriliza, así como del tipo de envase.
12
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
El orden de la termodestrucción microbiana es logarítmico, lo que permite desarrollar
combinaciones de tiempo y temperatura que aseguren un efecto destructivo. La figura
3 muestra una recta típica de supervivencia microbiana obtenida representando, en
función del tiempo, el logaritmo del número de los supervivientes a la exposición a una
determinada temperatura. A partir de este gráfico se puede determinar el tiempo de
reducción, decimal (D) que es el número de minutos precisos para destruir el 90% de
una población. La línea recta se extiende teóricamente hasta la zona de logaritmos
negativos, por ejemplo log 10-3 = 1 célula por cada 1000 g (14).
La muerte de los microbios por una fuente
de calor, u otro agente letal, se expresan
mediante la ecuación cinética de primer
N = No .e-kt donde N es el número
de células (UFC/g), No el número inicial de
células, t el tiempo, k la constante de
velocidad, luego 2,3 log(N/No) = - (k∆t)
y entonces ∆t = - [2,3 log(N/N o)] / k
orden
El tiempo de reducción decimal es la
constante cinética usada con más frecuencia
en la industria de conservas vegetales e igual
a D = 2,3 / k estando D y k definidos para
una temperatura dada.
k y T está relacionada
con la energía de activación Ea mediante la
ecuación de Arrhenius k=s -Ea/RT donde s es
la constante de frecuencia, R la constante de
los gases ideales, T temperatura en grados
La interrelación entre
Kelvin.
D y T está dada por el valor z y está relacionado con E a por la
ecuación E a = [2,3 R. T1. T 2 / z]. 9/ 5 siendo T 1 la temperatura de referencia y T2 la
La interrelación entre
del ensayo, en grados Kelvin (14).
2.7.2. Acción de las radiaciones
La irradiación consiste en proyectar una cierta cantidad de energía sobre un cuerpo
para expulsar los electrones periféricos fuera de los átomos y producir de esta manera
iones. Estos ion es, así como los electrones expulsados, reaccionan a su vez con otros
átomos. El resultado es la rotura de enlaces entre los átomos y las moléculas que
constituyen la substancia tratada. En las células, la radiación afecta en primer lugar a
los ácidos nucleicos y las proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable.
Algunas de las alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido
nucleico son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la
citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de puentes entre
ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y por tanto de la
bacteria.
Se emplean tres formas de radiación: los rayos gamma, los electrones acelerados y los
rayos X. Los irradiadores de rayos gamma funcionan con cobalto 60, emitiendo estos
rayos con gran poder de penetración, de hasta varias decenas de centímetros, lo que
permite tratar productos a granel. La irradiación también inhibe la germinación de las
papas y las cebollas, prolongando el tiempo de almacenamiento, así como afecta a las
larvas y huevos de insectos en los cereales.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
13
El gray es la cantidad de energía absorbida correspondiente a un joule por kg de
substancia ionizada y reemplaza al rad (1 Gy = 100 rad) en el sistema internacional (22).
2.7.3. Acción de la luz ultravioleta
El rango de la radiación UV que más afecta a los microorganismos está entre 240 y
280 nm, y se utiliza para el tratamiento de superficies contaminadas pues tienen poco
poder de penetración. La radiación germicida (254 nm) es absorbido por el material
celular pero de manera más significativa por los ácidos nucleicos, a los que causa el
mayor daño. Los endosporos bacterianos son 7 a 50 veces más resistentes a la radiación
UV de 254 nm que las células vegetativas (23).
El principal efecto de la luz UV es causar la formación de dímeros, mediante enlaces
transversales, entre pirimidinas adyacentes, especialmente residuos de timina del
ADN. Estos residuos unidos por enlaces transversales, alteran el proceso normal de
replicación dando como resultado mutaciones. Muchas bacterias poseen un eficiente
mecanismo de fotorreactivación para reparar el daño causado por la radiación UV
cuando se exponen inmediatamente después a la luz visible (2).
2.7.4. Acción de las microondas
Las microondas son una parte del espectro de ondas electromagnéticas cuya banda se
extiende desde los 500 megahertz hasta los 10 gigahertz, es decir incluye ondas cuyas
frecuencias de oscilación van desde los 500 millones a los 10.000 millones de ciclos por
segundo, y se usan para generar calor interno en diversos productos (24).
Las moléculas de agua son dipolos eléctricos y cuando se aplica un campo de
microondas, se reorientan con cada cambio en la dirección del campo produciendo
calor por la fricción intermolecular. Las características físicas, térmicas, dieléctricas del
tejido biológico, su masa y la frecuencia de la radiación, causan un calentamiento
diferencial de los distintos constituyentes. Esta falta de uniformidad térmica ha
limitado el uso de las microondas para la inactivación microbiana, pues el
calentamiento heterogéneo puede dejar puntos donde sobrevivan microorganismos,
aunque teóricamente estas células son calentadas específicamente dentro de la matriz
del producto que las contiene. La frecuencia comúnmente usada, por distintas razones,
es 2,45 GHz y no parece ser la más conveniente (23).
2.7.5. Acción del ultrasonido
Las ondas sonoras de alta frecuencia (ultrasonido) también se usan para desintegrar
células microbianas y eliminar microorganismos de un equipo (2). Se ha usado para
productos líquidos un proceso combinado de inactivación microbiana que incluye calor
(112ºC) y ultrasonido (20kHz) bajo una presión de 300 kPa (23).
2.7.6. Separación por filtración
Las preparaciones que contienen productos sensibles al calor se esterilizan mejor por
filtración. El material filtrante se prepara con un éster de celulosa u otros polímeros con
poros de tamaño preciso y uniforme. Es muy delgado, con un espesor de unos 150 µm
y por eso se le denomina membrana filtrante. Los filtros más usados tienen un
diámetro de poro de 0,2 µm ó de 0,45 µm. Para su uso se suele colocar la membrana
preesterilizada sobre el disco que la soporta en la unidad de filtración estéril.
Los filtros de aire de elevada eficiencia (HEPA) permiten suministrar aire libre de
polvo y microorganismos a una cámara de siembra, y están acoplados a un sistema de
flujo laminar (2).
2. 8. Desinfección
Los desinfectantes son substancias químicas que matan a las células somáticas
adheridas a las superficies inanimadas, pero no necesariamente a las formas
14
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
esporuladas. Los antisépticos destruyen o inhiben el crecimiento y la actividad de los
microorganismos que están sobre los tejidos vivos (1).
Se llama bactericida a la substancia que mata las células bacterianas y bacteriostático a
la que impide el crecimiento y multiplicación de las mismas. Un agente antimicrobiano
interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microorganismos y cuando se refiere
a grupos específicos se usan los términos antibacteriano o antifúngico (2).
Varios factores influyen sobre la velocidad con que son inhibidos o destruídos los
microorganismos. A medida que aumenta la concentración del agente las células
mueren más rápido, por ejemplo 4,25 g de fenol/L requieren unas 10 horas para
obtener el mismo resultado que una concentración de 6,04 g/L en 1,5 horas. Un ligero
aumento de la temperatura permite aumentar grandemente la efectividad de un
desinfectante por ejemplo, para una solución de fenol de 4,62 g/L, un incremento de 30
a 42°C permite obtener el mismo resultado en un tiempo diez veces menor (2).
Las especies de microorganismos difieren en la sensibilidad a los diversos agentes
antimicrobianos. Los endosporos bacterianos son las células más resistentes por su
capacidad de sobrevivir a las condiciones químicas adversas. La presencia de materia
orgánica puede reducir significativamente la efectividad de un antimicrobiano,
inactivándolo por combinación con el mismo o protegiendo al microorganismo al
dificultar el contacto con el desinfectante. Cuando están en un ambiente con un pH
ácido los microorganismos son destruídos a temperatura más baja y en menor tiempo
que en un medio ligeramente alcalino (1).
Los compuestos fenólicos pueden ser bactericidas o bacteriostáticos según la
concentración usada, pero algunos son fungicidas. La actividad es reducida por un pH
alcalino o la presencia de materia orgánica. El alcohol etílico en concentraciones de 50 a
70% v/v es efectivo contra células somáticas. Los productos que contienen 5 a 7% de
hipoclorito de sodio se usan para higienizar diversos equipos, pero es muy afectado
por la presencia de materia orgánica.
Los detergentes disminuyen la tensión superficial y no son afectados por las aguas
“duras”. Los agentes que al ionizarse tienen la propiedad detergente en el anión son
conocidos como detergentes aniónicos, por ejemplo el lauril sulfato sódico o los
jabones. Producen la eliminación mecánica de los microorganismos al atraparlos en la
espuma. Los que tienen la propiedad detergente en el catión son llamados catiónicos,
por ejemplo los cloruros de amonio cuaternario. Son bactericidas frente a las
grampositivas pero tienen poca acción contra las gramnegativas (2).
El formaldehído es un gas que se comercializa como una solución acuosa (formol o
formalina) que contiene entre 37 y 40 % de formaldehído. Se emplea en soluciones del 3
al 8%. Tiene una alta actividad microbicida. Se lo suele usar para esterilizar ambientes
cerrados bajo c ondiciones apropiadas pues los vapores son nocivos (2).
2. 9. Interacciones microbianas
2.9.1. Antibiosis
Un microorganismo puede producir metabolitos que hagan el ambiente desfavorable
para el desarrollo de otros o que perturben su metabolismo hasta el punto de que
mueran o sean incapaces de reproducirse. El fenómero recibe el nombre de antibiosis o
antagonismo.
Los antibióticos constituyen un grupo heterogéneo de moléculas orgánicas
relativamente pequeñas, producidas por unos microorganismos para inhibir a otros a
una concentración muy baja. La mayoría de los microorganismos notoriamente
productores de antibióticos se alojan en el suelo (8).
Otro grupo se moléculas antagonistas son las bacteriocinas. Constituyen un grupo
relativamente heterogéneo de pequeñas proteínas sintetizadas en los ribosomas
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
15
microbianos. Actúan sobre bacterias estrechamente relacionadas al agente productor
pero no afectan a éste. Algunas bacteriocinas son: nisina producida por Lactococcus
Iactis, subtilina por B. subtilis, colicinas por E. coIi, pediocina por Pediococcus acidilactici
(26).
Productos metabólicos microbianos que actúan como antibióticos (1, 25)
antibacterianos
producido por
modo de acción
aminoglucósidos
estreptomicina Streptomyces griseus
induce síntesis anormal de proteínas
neomicina
Streptomyces fradiae
“
“
“
“
cefalosporinas
Acremonium cephalosporium inhiben síntesis de pared celular
cloranfenicol
Streptomyces venezuelae
“
“
“
“
eritromicina
Saccharopolyspora erythraea interfiere con síntesis de proteínas
lincomicina
Streptomyces lincolnensis
“
“
“
“
penicilinas
Penicillium chrysogenum
inhiben síntesis de pared celular
polipéptidos
polimixinas
BaciIIus polymyxa
deterioro de membrana celular
bacitracina
BaciIIus subtilis
inhibe formación de pared celular
rifamicinas
Amycolatopsis mediterranei
interfiere con síntesis de proteínas
tetraciclinas
Streptomyces spp.
“
“
“
“
vancomicina
Arnycolatopsis orientalis
“
“
“
“
viomicina
Streptomyces griseus
“
“
“
“
antifúngicos
anfotericina B
Streptomyces nodosus
interfiere con función de membrana
griseofulvina
PeniciIIium griseofulvum
daña la membrana celular
lipopéptidos
iturina A
BaciIIus subtilis
interfiere con función de membrana
surfactina
BaciIIus subtilis
“
“
“
“
nistatina
Streptomyces noursei
daña la membrana celular
2.9.2. Mutualismo y simbiosis
Los microorganismos que habitan en un ecosistema presentan varios tipos de
asociaciones e interacciones entre las especies. A veces se asocian diferentes especies
bacterianas, o bien bacterias y otra clase de organismos, como levaduras, mohos, algas,
protozoos e incluso plantas, u hongos con plantas como en el caso de las micorrizas. En
muchos casos, el crecimiento y la reproducción son más vigorosos en asociaciones
favorables de dos tipos de organismos que en cultivos de una sola especie (9).
El mutualismo es la vida en común de dos o más organismos asociados en beneficio
mutuo pero no implica necesariamente el contacto físico. Simbiosis es una asociación
específica entre dos tipos de organismos que están en contacto físico. Generalmente el
de menor tamaño (simbionte) vive dentro o está adherido a la superficie del mayor
(hospedador). La simbiosis no siempre implica mutualismo. El hospedador es siempre
un organismo eucariótico y puede mantener al simbionte (eubacteria, actinomiceto,
hongo o alga) intracelular o albergarlo en el interior de cavidades u órganos (12). Por
otra parte, la sintrofia es la acción cooperante de dos microorganismos con
metabolismos complementarios (un tipo de mutualismo) alcanzando un efecto que no
es logrado separadamente por ninguno de ellos (9).
Un organismo puede ser incapaz de crecer en presencia de cierto substrato, pero si
coincide con un microorganismo capaz de degradarlo y producir moléculas útiles para
el primero, se observa su crecimiento. Esta asociación recibe el nombre de
comensalismo o vida en común de dos especies con beneficio para una de ellas y sin
16
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
daño ni provecho para la otra, por ejemplo cuando los microbios colonizan la superficie
externa de una planta obteniendo energía de la metabolización de exudados
producidos por el hospedador. Otro ejemplo es la influencia favorable de un microbio
facultativo sobre el desarrollo de uno anaerobio, el primero reduce la tensión de
oxígeno y crea un ambiente adecuado para que prospere el segundo (27).
Las comunidades microbianas están caracterizadas por siete diferentes mecanismos
biológicos:
a) provisión de nutrientes específicos por los diferentes miembros de la comunidad,
b) moderación de la inhibición del crecimiento,
c) interacciones que causan la alteración de los parámetros de crecimiento de las
poblaciones individuales, produciendo un desempeño de la comunidad más
eficiente y/o competitivo,
d) actividad metabólica combinada no expresada por las poblaciones individuales
aisladas,
e) cometabolismo,
f) reacciones de transferencia de hidrógeno,
g) interacción entre varias especies dominantes (28).
2.9.2.1. Fijación simbiótica del nitrógeno
Una particularidad de las plantas leguminosas es su capacidad para asociarse con
bacterias fijadoras de nitrógeno pertenecientes a los géneros Rhizobium, Sinorhizobium,
Bradyrhizobium y Azorhizobium. Esta simbiosis se traduce en el desarrollo del nódulo en
cuyo interior las bacterias se multiplican y transforman el nitrógeno del aire en amonio
(ver 3.10). La asimilación de ese amonio por parte
de las plantas les permite crecer en suelos pobres
en nitrógeno.
En la primera etapa, la planta secreta en su
exudado radicular unos flavonoides que atraen a
los rizobios por quimiotactismo y activan en la
bacterias la expresión de ciertos genes que
determinan la producción, en los rizobios, de
moléculas fundamentales para el reconocimiento
y la infección de la planta hospedadora
induciendo la formación de los nódulos. Las
bacterias se adhieren a los pelos absorbentes de la
raíz e inducen la curvatura del extremo de los
mismos (29).
Los rizobios infectan la planta mediante un filamento de infección que avanza hacia
la base del pelo y el interior de la raíz, simultáneamente las células de la corteza interna
de la raíz se dividen y forman el primordium nodular. La multiplicación muy intensa
de estas células provoca la aparición del nódulo, que es un verdadero órgano
especializado en el intercambio metabólico entre ambos asociados.
Algunas especies de bacterias fijadoras de nitrógeno en simbiosis (33)
Género, especie, biovar
Planta hospedadora
Sinorhizobium meliloti
alfalfa
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii
trébol
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli
poroto
Rhizobium ciceri
garbanzo
Bradyrhizobium japonicum
soja
Azorhizobium caulinodans
Sesbania (nódulos en el tallo)
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
17
Las simbiosis entre rizobios y leguminosas son muy específicas, por ejemplo R.
leguminosarum induce la nodulación en el poroto pero no en la alfalfa (30). Las bacterias
no se mezclan con los orgánulos citoplasmáticos, sino que se mantienen confinadas en
los simbiosomas que son vesículas protegidas por membranas. Los simbiosomas del
lupino tienen una sola bacteria, los de la soja varias. La figura 4 muestra el corte de un
nódulo.
La membrana del simbiosoma actúa a modo de
barrera que controla el flujo de ácidos carboxílicos
(malato, succinato, fumarato). Éstos constituyen la
fuente de carbono para los bacteroides. Tales ácidos
proceden de la oxidación de azúcares sintetizados en
las hojas por la fotosíntesis. Durante el proceso de
formación de los simbiosoma s, las bacterias se van
transformando en bacteroides que expresan diversas
proteínas específicas como la enzima nitrogenasa y
algunos citocromos. Las células intersticiales sin
infectar intervienen en las últimas etapas de la síntesis
de ureidos, asparagina o glutamina, por incorporación
del nitrógeno fijado. Éstos se exportan hacia la parte
aérea a través de los vasos del xilema.
Para que los nódulos de las leguminosas fijen
nitrógeno
es
imprescindible
que
contengan
leghemoglobina cuyo grupo hemo es sintetizado por el
vegetal (32). La fijación de nitrógeno requiere gran
cantidad de energía que se produce en los bacteroides
durante la oxidación de los ácidos dicarboxílicos y la
leghemoglobina transporta el O2 a una concentración
baja pero estable que permite mantener una elevada
actividad respiratoria sin afectar la nitrogenasa, pues
esta enzima se inactiva en presencia de oxígeno (30).
La rizósfera de algunas plantas contienen acumulaciones de bacterias fijadoras, tal
como Azotobacter paspali sobre la superficie de la raíz de Paspalum notatum y
Azospirillum brasilense en la de caña de azúcar. Las bacterias se hallan en el espacio
intercelular del córtex radical, en una simbiosis donde se benefician los dos
participantes de la asociación. Por otra parte, el helecho de agua Azolla contiene a la
cianobacteria Anabaena azollae en las cavidades de las hojas. Nostoc vive
simbióticamente en el líquen Peltigera y sobre las raíces aéreas de Cycas y Gunnera (29).
Varias dicotiledóneas que no pertenecen a las leguminosas, también contiene nódulos
en las raíces capaces de fijar N2 . En la mayoría de los casos se trata de actinomicetos del
género Frankia. En la figura 5 se esquematiza la forma en que los filamentos penetran a
las células de la raíz y produce nódulos donde también se encuentra una hemoglobina
que facilita la provisión de O2 al endófito (32).
Un inoculante para enriquecer el suelo con la bacteria simbiótica deseada, contiene
altas concentraciones celulares en un substrato que favorece largos períodos de
supervivencia sin pérdidas de las características fisiológicas del microorganismo. Los
pasos a seguir comprenden:
a) selección de las cepas convenientes por su mayor eficiencia;
b) cultivo del microorganismo en un medio líquido;
c) elección, preparación y esterilización del material de soporte;
d) impregnación del soporte con el cultivo líquido que posee un alto número de células,
e) control del número de bacterias vivas en el producto terminado (34).
18
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
No todas la cepas infectivas en un hospedador
particular son capaces de fijar nitrógeno, debido
a la interrrelación varietal y a la interacción con
los suelos y sistemas de producción. La cepa
seleccionada debe ser genéticamente estable,
tener una alta competencia frente a las cepas
menos eficientes propias del suelo, crecer en los
medios corrientemente utilizados en la industria
y sobrevivir en el soporte a las condiciones de
comercialización.
El empleo de turba estéril como soporte, el
almacenamiento refrigerado del producto y el
control de calidad, permiten mantener altos
niveles de rizobios vivos en la distribución del
inoculante. Esto se traduce en un incremento de
rizobios por semilla. Se suele exigir 2*109
bacterias/g de inoculante a la salida de la fábrica, para así asegurar que el momento de
aplicación permanezcan vivos unos mil millones por gramo. Las condiciones de
transporte, almacenamiento y uso determinan el éxito de la inoculación (34).
2.9.2.2. Micorrizas
Una de las funciones más importantes
de las micorrizas (asociaciones entre
hongos y plantas) es absorber los
elementos minerales menos móviles del
suelo
(fosfato,
cobre,
zinc)
y
transferirlos a la planta hospedadora,
así como amonio. La planta proporciona
azúcares al hongo (36).
Las ectomicorrizas se caracterizan por
una modificación de la raíz, que pierde
sus pelos absorbentes. El hongo rodea la
raíz con un manto de filamentos, del
cual parte una red micelial externa que
se extiende por el suelo y una red micelial interna que penetra la raíz en el espacio
intercelular. Los hongos implicados son macromicetos que solamente en simbiosis
pueden formar basidiomas (por ejemplo Amanita, Boletus, Lactarius, Pisolithus, Suillus) o
ascomas (como las trufas) (ver 7.3).
En las endomicorrizas el micelio entra en la raíz donde
inicialmente es intercelular, luego penetra en las células
y se ramifica formando los arbúsculos que son más o
menos digeridos por el hospedador, y unas vesículas.
Los hongos de las endomicorrizas son micromicetos
(Glomus). En la figura 6 se observa un esquema de una
endomicorriza y en la 7 de una ectomicorriza.
2.9.2.3. Biopelículas
Las biopelículas que se forman en el forraje ingerido
por el ganado vacuno y otros rumiantes, están
inicialmente formadas por microorganismos que
digieren la celulosa del material vegetal y producen
ácidos grasos y otros metabolitos. Luego las células de
otras especies invaden la película y comienzan a usar
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2
19
esas sustancias para su propio metabolismo. Así es como el forraje desaparece y es
transformado en una masa bacteriana que el animal digiere más tarde. Estas películas
son imprescindibles para los rumiantes.
Menos de la tercera parte de la biopelícula está constituída por microcolonias de
bacterias, el resto es una sustancia blanda y pegajosa (matriz extracelular) secretada por
ellas que absorbe agua, atrapa partículas pequeñas y mantiene unidas a las
microcolonias (figura 8). La película biológica está atravesada por diminutos conductos
que bañan a cada agrupación bacteriana, aportando nutrientes disueltos y eliminando
productos de desecho (37).
2.9.3. Predación
Algunos microorganismos predadores se alimentan de las bacterias, como los
protozoos, mixobacterias, acrasiomicetos y varios flagelados fotosintetizantes que no
siempre están clasificados como algas.
Siempre que existen protozoos en estado trófico hay una población bacteriana que le
sirve de presa. Debido a que una sola célula de protozoo consume entre divisiones 10 3 a
10 4 bacterias, una comunidad con 103 protozoos por mL ó g está caracterizada por una
predación activa. Un suelo suele tener 109 bacterias/cm3, pero en solución los
protozoos reducen el número de células a 106 /cm3
Sin embargo, a pesar de su abundancia y actividad, los protozoos no suelen eliminar
sus presas porque esto acarrearía la desaparición consecuente del predador. Con una
baja densidad de presas el protozoo debe utilizar gran cantidad de energía para llegar a
las pocas células que le sirven de alimento y puede morir cuando se acaben o bien
enquistarse (27).
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