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Agrobiotecnología
2016
Tolerancia a estreses abióticos
Ruth Heinz
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
-
Sumario
Estreses abióticos
Problemas y pérdidas producidas por estreses abióticos
Respuestas a estreses abióticos
Solutos compatibles
Estrategias para aislar genes de tolerancia
a estreses abióticos en plantas
Uso de genómica funcional para la búsqueda
de genes de tolerancia a estreses abióticos
Búsqueda de genes regulados por factores de
transcripción inducibles por estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Ejemplos de tolerancia frente a diferentes
estreses abióticos:
Solutos compatibles
Bomba de Na+/H+
Sobrexpresión de citoquininas
Factores de transcripción
Proteínas LEA
Citrato sintetasa
Referencias
Estreses
abióticos
•
Las plantas son frecuentemente sometidas
a estreses, condiciones externas que
adversamente afectan su crecimiento,
desarrollo o productividad.
•
Los estreses pueden ser bióticos, provocados
por otros organismos, o abióticos, causados
por condiciones desfavorables en el ambiente
físico o químico.
•
Los estreses disparan un amplio rango
de respuestas en la planta, desde alteraciones
en la expresión genética y el metabolismo
celular, a cambios en la tasa de crecimiento
y rendimientos de los cultivos.
•
La tolerancia o sensibilidad a los estreses
depende de las especies, del genotipo y
del estadío de desarrollo de la planta.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Diferentes factores ambientales
que resultan en estreses abióticos
Tomado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.
La mayoría de estos factores ambientales induce estrés osmótico
Demandas
y restricciones
futuras de la
agricultura
• Se espera que la población mundial duplique
su número para el año 2050.
• En ese momento, la población mundial
alcanzará los 11.000 millones de personas,
de las cuales el 90% residirá en países en
desarrollo.
• La producción de alimento deberá
duplicarse o triplicarse para entonces.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
• En Latinoamérica sólo el 7% del total de
tierra es cultivable. Los esfuerzos por
satisfacer las demandas de una población en
aumento han conducido al cultivo de suelos
de pastoreo y, en algunos casos, de tierras
forestales, así como también de tierras
marginales (suelos salinos, ácidos, etc.).
Problemas y pérdidas producidas
por estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Muchas tierras
cultivables se
pierden debido
al exceso de uso
o al mal manejo
de los suelos
La producción
alimentaria en aumento
es el principal factor de
presión ejercido sobre
los recursos de la tierra.
Esto acentúa
la degradación de los
suelos y conduce a
fenómenos de
desertificación y pérdida
de los mismos.
Más de 3.500 millones de
ha (25% de la superficie
total) están afectadas por
la desertificación a nivel
mundial. En Sudamérica,
la desertificación afecta
unos 250 millones de ha.
Las principales causas
de desertificación son la
salinidad y la sequía.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
El acceso a la
alimentación de más de
900 millones de personas
corre peligro debido a
que las tierras de las que
dependen están
amenazadas por este
problema.
Las aplicaciones
biotecnológicas
contribuirán a
la recuperación
de suelos
inapropiados
para el cultivo
Para aumentar la
producción agrícola
y preservar los suelos
se requiere
implementar políticas
sociales y económicas
de largo plazo,
introducir nuevas
formas de manejo
agronómico
e incrementar la
investigación científica
y tecnológica.
Las aplicaciones
biotecnológicas, en
particular el uso de
cultivos transgénicos,
prometen incrementar
la producción agrícola
disminuyendo los
costos de producción.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
El uso de plantas
tolerantes a estreses
abióticos podría
permitir el uso y la
recuperación de tierras
afectadas por salinidad,
acidez, sequía, etc.
Rendimientos y pérdidas promedio de los principales cultivos
Rendimiento
máximo
Rendimiento
promedio
Pérdidas promedio
(Kg/Ha)
Pérdidas
abióticas
Cultivo
(Kg/Ha)
(Kg/Ha)
Bióticasa
Abióticasb
(% rend. max.)
Maíz
19.300
4.600
1.952
12.700
65,8
Trigo
14.500
1.880
726
11.900
82,1
Soja
7.390
1.610
666
5.120
69,3
Sorgo
20.100
2.830
1.051
16.200
80,6
Avena
10.600
1.720
924
7.960
75,1
Cebada
11.400
2.050
765
8.590
75,4
Papa
94.100
28.300
17.775
50.900
54,1
Remolacha
121.000
42.600
17.100
61.300
50,7
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
a
b
Los estreses bióticos incluyen enfermedades, insectos y malezas.
Los factores abióticos ambientales incluyen, pero no se limitan a, sequía, salinidad, inundación, y
altas y bajas temperaturas.
La incidencia de los factores ambientales sobre
los rendimientos es mayor en las zonas tropicales
Tomado de: Chispeels y Sadava, Plants, Genes and Crop Biotechnology, 2003..
Rendimiento clima templado (Tm/ha) a
Cultivo
Promedio
Récord
Promedio
Récord
Papa
18,1
126.0 (USA)
8,7
60,0 (América
Central) b
Batata
13,6
65,0 (USA)
6,9
---
Arroz
4,1
10,5 (Japón)
2,0
Maíz
4,0
22,2 (USA)
1,4
12,9 (Zimbabwe)
Trigo
3,0
14,1 (USA)
1,4
10,3 (Asia,
Zimbabwe,
América Central)
Sorgo
2,3
20,1 (USA)
1,2
10,3 (Asia)
1,7
8,6 (USA
1,0
9,6 (Zimbabwe)
1,6
7,3 (Japón)
1,0
4,8 (Zimbabwe)
20,8
100
15,7
100
Soja
% rendimiento récord
a
Rendimiento clima tropical (Tm/ha)
7,4 (Asia)
b
Las zonas subtropicales y templadas se consideran templadas. Las zonas entre 23,5º latitud Norte y 23,5º latitud Sur se consideran
tropicales. b Asia está representada por Filipinas, Thailandia e India. Centro América está representada por México y Colombia.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Uso de agua (Km cubicos)
La creciente
demanda de
agua es uno de
los problemas
más acuciantes
que enfrentará
la agricultura
intensiva
Agricultura
Industria
Uso doméstico
El uso de agua en la agricultura se ha incrementado
siguiendo una función lineal en los últimos 70 años
El desarrollo de
las tierras áridas
y semiáridas es
un problema
geo-económico
importante de
la Argentina
Aproximadamente
60 millones de
hectáreas están
sometidos a
procesos erosivos
en la Argentina
Cada año se suman
unas 650.000
hectáreas a los
procesos de erosión
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Unos 9,5 millones de
personas están
localizadas en tierras
áridas o semiáridas
Respuestas a estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Respuesta de las plantas a niveles letales
o sub-letales de estrés
• En un ambiente desfavorable,
una planta podría enfrentar
las siguientes situaciones:
- Estrés letal que puede conducir a
la muerte de la planta debido al
incremento de los procesos de
senescencia.
- Estrés sub-letal o estrés letal precedido
por un estrés sub-letal durante el
cual pueden producirse cambios
adaptativos que permiten la
supervivencia de la planta (tolerancia).
• Estas adaptaciones pueden
ocurrir a nivel molecular,
(expresión génica y síntesis
. proteica) o a nivel bioquímico
. (síntesis de nuevos metabolítos),
. lo que conduce a respuestas
. celulares y fisiológicas alteradas.
Tomado de: Grover et al., Current Science, 2001.
Respuesta de las plantas a niveles letales
o sub-letales de estrés
• A nivel de toda la planta:
.
.
- Reducciones en la germinación de las semillas
- Reducciones en el establecimiento de las plántulas
- Pobre vigor de los brotes
- Decrecimiento en la extensión de las raíces
- Enrollamiento y senescencia de las hojas
- Disminución de la tasa fotosintética
- Reducción en la viabilidad del polen
- Reducción y llenado incompleto de los granos
• A nivel celular o subcelular:
.
- Niveles incrementados de diferentes osmolitos (sequía y salinidad)
- Represión general de la biosíntesis de proteínas (sequía y salinidad)
- Cambios selectivos en los niveles de K+/Na+ (sequía y salinidad)
- Incremento en la insaturación de los lípidos de membrana
(descenso de temperatura)
- Regulación positiva de la glucólisis y enzimas requeridas
para la fermentación alcohólica (anaerobiosis; innundaciones)
Respuestas a estreses ambientales
,
ácido jasmónico,
ácido abscísico,
etileno, Ca 2+
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Las plantas responden al estrés tanto a nivel celular como del conjunto de los tejidos. Los estreses constituyen
señales ambientales que son percibidas y reconocidas por las plantas. Las señales son transducidas en las
células y transmitidas a través de la planta. Típicamente, la transducción de señales a nivel celular resulta en la
alteración de la expresión genética, lo que a su vez influye sobre el metabolismo y el desarrollo de la planta.
Demarcación funcional de las rutas de señalización de
estreses inducidos por salinidad y sequía
Adaptado de: Zhu, Annual Review in Plant Biology, 2002.
Las rutas de señalización del estrés hídrico y salino son inducidas por exceso de Na+ o
por cambios osmóticos. Las rutas de señalización iónica y osmótica derivan en la
restauración de la homeostasis a nivel celular y de la planta.
Señal
Señal
de estrés
de estrés
canales
ionicos,
histidina
kinasa,
Hsfs, ionicos,
GPCR, RLKs
canales
Hsfs, GPCR, RLKs
membrana
membrana
plasmática
plasmática
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
MAPKK
MAPKK
CaM, CaN,
CDPK
CaM,CDPK
CaN,
CaM,
CDPK
SOS3
SOS3
MAPKK
MAPKK
Fosforilación
de proteínas
Fosforilación
de proteínas
SOS2
SOS2
transducción de señales
transducción de señales
MAPKKK
MAPKKK
recepción
recepción
Rutas de
transducción
de señales
involucradas
en las
respuestas a
estreses
abióticos
Sensores:
histidina kinasa,
Sensores:
Factores de
transcripción
Factores
de
transcripción
proteínas
de tipo LEA
proteínas
de tipo LEA
Transportadores
iónicos
Transportadores
iónicos
Protección de
macromoléculas,
Protección
de
reparación de daños,
macromoléculas,
homeostasis
osmótica
reparación
de daños,
homeostasis osmótica
Protección celular,
reparación
de daños,
Protección
celular,
homeostasis
osmótica
reparación
de daños,
homeostasis osmótica
homeostasis
ionica
homeostasis
ionica
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Efectores/
de acción
niveles
Efectores/
niveles de acción
antioxidantes,
osmolitos
antioxidantes,
osmolitos
MPK, MPKK, MPKKK, : MAP quinasa, MAPK quinasa y MAPKK quinasa, respectivamente; CaM: Calmodulina; CDPK: proteína
quinasa dependiente de calcio; SOS3, SOS2: proteína quinasas (Salt overly sensitive); LEA: proteínas abundantes en la
embriogénesis tardía; Hsfs: factores de choque térmico; GPCR: receptor acoplado a proteína G; RLKs: quinasas de tipo receptor
Control transcripcional de las respuestas a estrés
sequía y alta salinidad
estrés biótico
y heridas
frío
calor
AJ
ABA
MYB
MYC
AREB/ABF
(bZIP)
NAC
HDZF
MYBR
MYCR
ABRE
NACR
HDZR
DREB1D/CBF4
(AP2/ERF)
DREB2
(AP2/ERF)
DREB1/CBF
(AP2/ERF)
DRE/CRT
Expresión de genes inducibles por estrés
Tolerancia a estrés
Adaptado de: Nakashima y Yamaguchi-Shinozaki, Abiotic stress adaptation in plants, 2010.
Los factores de transcripción que controlan respuestas inducibles por estrés están representados por elipses. Los elementos que actúan en cis
controlando la trascripción inducida por el estrés están representados como cajas. Los círculos pequeños sobre los factores de transcripción
representan modificaciones (tales como fosforilaciones) inducidas por el estrés que resultan en su activación.
Análisis proteómico
órgano especifico para
respuesta a estreses
abióticos
Setsuko Komatsu and Zahed Hossain
Frontiers in Plant Science, 2013, 4, 71
Funciones
bioquímicas
asociadas con
la tolerancia al
estrés hídrico
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Adaptada de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.
El esquema incluye tres espacios que están definidos por la membrana plasmática y
el tonoplasto. Se muestran los efectos de la acción de proteínas relacionadas con la
tolerancia al déficit de H2O. El esquema se focaliza en los eventos bioquímicos y no
incluye eventos de señalización o rutas que conducen a alterar la expresión génica.
Respuestas de tolerancia al estrés hídrico
Las respuestas de tolerancia a estrés hídrico se basan en:
 Aumentar la actividad de bombas Na2+/H+
. en las membranas plasmáticas de células de raíz
. y en los tonoplastos del mesófilo y de otros tejidos
. (exportación y compartimentación de sodio)
 Controlar la expresión, actividad y propiedades de
. los sistemas de transporte de potasio y la actividad
. de las acuoporinas
 Controlar el flujo de agua y el nivel de turgencia
. .
incrementando la producción de solutos compatibles
. (ajuste osmótico)
 Proteger las enzimas, complejos proteicos y estructuras
. de membrana incrementando la capacidad de detoxificación
. de radicales hidroxilos y la producción de osmoprotectores.
.
.
Solutos compatibles
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Parámetros
que
determinan
el ajuste
osmótico
turgencia
tensión
p =
0 MPa
p = + 0,5 Mpa
s = – 1,2 MPa
s = – 2,0 MPa
w = – 1,2 MPa
w = – 1,5 MPa
Déficit de H2O
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Suelo
con ajuste
osmótico
w = – 1,2 MPa
sin ajuste
osmótico
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
W : potencial de H2O
W = S + P
S : potencial de soluto
P : potencial de presión
El movimiento de
agua hacia dentro
o fuera de la
célula depende
del gradiente de
potencial de agua
(w) a través de
la membrana
plasmática
w externo = 0 MPa
Membrana
plasmática
Valores
intracelulares
Pared celular
Vacuola
Rodeada por la
membrana
del tonoplasto
p = + 0,5 MPa
s = – 1,6 MPa
w = – 1,1 MPa
H2O
Célula plasmolizada:
w
externo
> w
interno
w externo = – 2,5 MPa
Membrana
plasmática
Valores
intracelulares
p =
Agrobiotecnología
0 MPa
s = – 2,0 MPa
w = – 2,0 MPa
H2O
w
externo
< w
interno
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Ajuste osmótico
en una célula
del mesófilo
en una hoja
de espinaca
sometida
a exceso de sal
Agrobiotecnología
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Tolerancia
a estreses abióticos
Los iones de sodio y cloruro, que pueden interrumpir el
metabolismo en el citoplasma, se concentran en la vacuola.
Por el contrario, la concentración de glicina-betaína es alta
en los cloroplastos y el citoplasma, pero baja en la vacuola.
Funciones sugeridas de compuestos que se producen en
las plantas como respuesta al estrés hídrico
Grupo de productosa
Componente específico
Funciones sugeridas
Iones
Potasio
Ajuste osmótico, requisitos de
macronutrientes,
exclusión / exportación de sodio
Proteínas
LEA/dehidrinasb
Osmotinab
SOD/catalasa
Osmoprotección
Proteínas relacionadas con patogénesis
Detoxificación de radicales
Aminoácidos
Amidinas
Prolina
Ectoína
Ajuste osmótico
Osmoprotector
Azúcares
Sacarosa
Fructanos
Ajuste osmótico
Osmoprotector, reserva de carbono
Polioles
Acíclicos (ej., manitol)
Cíclicos (ej., pinitol)
Reserva de carbono, ajuste osmótico
Osmoprotector, ajuste osmótico
Aminas cuaternarias
Glicina betaína
-alanina betaína
Dimetilsulfonio propionato
Osmoprotector
Osmoprotector
Osmoprotector
Pigmentos y
carotenoides
Carotenoides, antocianinas,
betalaínas
Protección contra la fotoinhibición
Poliaminas
Espermina, espermidina
Balance iónico, protección de la cromatina
Adaptado de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.
a
b
No todos los compuestos que se acumulan se encuentran en todas las especies; las rutas bioquímicas son
específicas para órdenes y familias de plantas.
Las LEAs (late-embryogenesis abundant proteins) y las dehidrinas, así como las proteínas relacionadas con la
patogénesis, son ejemplos del reclutamiento de proteínas con “otra función” en las respuestas de estrés abiótico.
Estructuras químicas de solutos celulares compatibles
-
+
-
+
NH3(CH2)3NH (CH2)4NH (CH2)3NH3
Espermina
Compuestos con amonios cuaternarios
-
Colina-O-sulfato
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Los solutos
compatibles
preservan
la capa
de hidratación
de las
macromoléculas
La capa de hidratación
de las macromoléculas
no es perturbada por los
solutos compatibles.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Proteína desnaturalizada:
Proteína intacta: moléculas de H2O
pocas moléculas de H2O unidas
rodeando a la proteína en forma
a la proteína; alta entropía
altamente ordenada; baja entropía
Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.
Estrategias para aislar genes
de tolerancia a estreses abióticos
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Las
respuestas
al estrés
abiótico
involucran
mecanismos
complejos
estreses primarios
estreses secundarios
sequía salinidad
estrés osmótico
polución
química
frio
estrés oxidativo
calor
Disrrupción de la
homeostásis osmótica
e iónica; daños a
proteínas funcionales
y estructurales y a
membranas celulares
Sensado , percepción
y transducción
de señales
Control transcripcional
Mecanismos de
respuesta al estrés
Osmosensores (ej., AtHK1),
enzimas que clivan fosfolípidos (ej., PDL),
segundos mensajeros ( ej., Ca2+, PtdOH , ROS),
MAP quinasas , sensores de Ca 2+ (ej., SOS3),
quinasas dependientes de Ca 2+ (ej., CDPKs )
Factores de transcripción
(ej., CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP , MYC/MYB
Detoxificación
Chaperonas
(SOD, PX)
(Hsp, SP1, LEA, COR)
Activación génica
Osmoprotección
(prolina , glicina- betaína,
polioles azúcares)
Movimiento de agua e iones
(acuoporinas,
transportadores de iones)
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Adaptado de: Vinocur and
Altman, Current Opinion in
Biotechnology, 2005.
Restablecimiento de la homeostásis celular,
protección funcional y estructural de proteínas
y membranas celulares
Tolerancia al estrés
ABF: ABRE binding factor;
AtHK1: histidin quinasa 1
de Arabidopsis thaliana;
bZIP: basic leucine zipper
transcription factor;
CBF/DREB: C-repeatbinding
factor/dehidratationresponsive binding protein;
CDPK: protein quinasa
dependiente de Ca2+;
COR: cold-responsive
protein;
Hsp: Heat-shock protein;
LEA: late embryogenesis
abundant;
MAP: mitogen-activated
protein;
MYC/MYB: familias de
actores de transcripción
PLD: fosfolipasa;
Ptd-OH: ácido fosfatídico;
PX: peroxidasa;
ROS: especies reactivas
de oxígeno;
SOS: salt overly sensitive
SOD:
superoxidodismutasa;
SP1: stable protein 1
Estrategias para desarrollar plantas tolerantes al estrés
mediante ingeniería genética
Adaptado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.
Genes y proteínas asociadas a estreses
Componentes
de rutas de
señalización,
factores de
transcripción
Mejoramiento
vegetal y
marcadores
moleculares
(ej., QTLs)
Hsps,
chaperonas
y proteínas
LEA
Transporte
de agua e
iones
Detoxificación
y scaveging
de ROS
Tolerancia adquirida a estrés
Osmolitos,
osmoprotectores
Poliaminas
Metabolismo
de carbono
Transformación
genética
Otros
mecanismos
de respuesta
a estrés
(ej., apoptosis)
Metabolitos asociados a estreses
Hsp: heat shock protein
LEA: late embryogenesis
abundant
ROS: reactive oxygen
species
La tolerancia adquirida al estrés puede ser incrementada modificando la expresión de genes y proteínas
o por la sobrexpresión de metabolitos asociados al estrés. La tolerancia es un carácter que depende de
la actividad concertada de muchos genes, proteínas y rutas metabólicas. La tolerancia a los estreses
abióticos puede desarrollarse por ingeniería genética o mejoramiento asistido con marcadores
moleculares y quantitative trait loci (QTLs).
Estrategias
para desarrollar
plantas
tolerantes al
estrés mediante
ingeniería
genética
Buscar organismos que vivan
bajo condiciones medioambientales
extremas de estrés
Estudiar los organismos bajo
condiciones estresantes
y no estresantes
Aislar y clonar aquellos genes
que confieren la tolerancia al estrés
Caracterizar el producto génico
en un sistema modelo procariota
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Introducir el gen en un sistema
vegetal y estudiarlo bajo estrés
Introducir el gen en un cultivo
y proceder con ensayos de campo
Adaptado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.
Craterostigma plantagineum es una planta poiquilohídrica
modelo para el estudio de tolerancia a la deshidratación
Los dos azúcares más prominentes hallados
en C. plantagineum son 2-octulosa y
estaquiosa. 2-octulosa predomina en las
hojas y es convertido en sacarosa durante la
deshidratación. Estaquiosa predomina en las
raíces, tanto en condiciones normales como
bajo deshidratación
Arriba: C. plantagineum (“Planta de la Resurrección”).
Abajo: efecto de la deshidratación. Planta totalmente
túrgida (izquierda); planta deshidratada (centro);
planta hidratada por 12 h (derecha).
Tomado de: Bartels and Salamini, Plant Physiology, 2001.
Bromus pictus es una gramínea patagónica
resistente a frio y sequia con alto contenido de
fructanos
1. Aislamiento y caracterización de ADNc y secuencias genómicas completas.
2. Expresión en sistemas heterólogos (Piccia pastoris)
3. Transformación y evaluación de modelos de plantas.
4-Transformación decultivos de importancia agronómica para incrementar la
resistencia al estrés provocado por el frío y la sequía.
Bp 6-SFT
5´ ?
ATG ?
Exón 1
300
Miniexón
Intrón 2
Intrón 1
140
9
454
Exón 3
Intrón 3
850
700
TAA
Exón 4
655
3´
227
(pb)
Northern Blot
nmoles Fructósidos/ mg PF
FRUCTOSIDOS TOTALES
0-2 cm
1
2
70
60
50
2-4 cm
1
2
4-6 cm Lamina Tip Lamina
1
2
1
2
1
2
40
2,4 Kb.-
30
20
10
0
0-2 cm
2-4 cm
4-6 cm
Lamina
Tip Lamina
RNA
Florencia Del Viso (tesis doctoral 2010)
0-2 2-4 4-6
Lamina
tip Lamina
Thellungiella halophila es una planta halófila modelo
para el estudio de la tolerancia a salinidad
Tomado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.
Thellingiella halophila es una pequeña halófila altamente tolerante
al estrés salino. Tiene un ciclo de vida corto y comparte muchas
similitudes biológicas y moleculares con Arabidopsis thaliana.
La fotografía muestra plantas de T. halophila y A. thaliana cultivadas
durante 7 días en medio saturado con 0, 200 y 600 mM de NaCl.
Thellungiella halophila es una planta halófila modelo
para el estudio de la tolerancia a salinidad
Uso de genómica funcional para la búsqueda
de genes de tolerancia a estreses abióticos
rd29A nAChRE
a-tubulin
Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.
Análisis de la expresión genética frente a estrés inducido por frío utilizando
microarreglos de 1.300 genes de Arabidopsis. Los genes señalados en la imagen
corresponden a controles positivos (rd29A), negativos (nAChRE) y a controles internos
no inducibles (α-tubulina). Se utilizaron sondas realizadas con ADNc de plantas
estresadas y no estresadas con frío. La coloración roja indica inducción génica; la
coloración verde, inhibición. Lo puntos en amarillo indican que no hay cambios en la
expresión génica.
Identificación de genes inducibles por estrés abiótico
Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.
Clasificación de genes inducibles o reprimibles por frío, sequía y salinidad mediante análisis con
microordenamientos. Los números entre paréntesis (panel izquierdo) indican genes cuya inducción
es mayor de cinco veces para el estrés en cuestión y menor de tres veces para los restantes.
Identificación de genes de Arabidopsis thaliana inducidos
por estreses de frío, sequía y salinidad
Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.
Análisis por Northern blot para tres genes altamente inducibles por salinidad
(RAFL08-19-G15), sequía (RAFL08-08-O14) y frío (RAFL04-12-P22). Se muestra
la expresión de un gen constitutivo (RAFL05-14-L02) como control interno.
Identificación
de genes
regulados por
factores de
transcripción
inducibles
por estreses
abióticos
Agrobiotecnología
Estrategia para
identificar genes
inducidos por
frío y sequía
que son blanco
del factor de
transcripción
DREB1A
(Dehydration
Responsive
Element Binding
Protein)
a
Tolerancia
a estreses abióticos
a
Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.
Identificación de genes inducibles por estrés abiótico
Genes inducibles por
Sequía y frío: 16
Genes
específicos
inducidos por
sequía: 5
FL6-55, FL5-2D23,
FL2-56, FL5-3J4,
rd20
Genes que son blanco de DREB1A: 12
rd29A, cor15a, kin1, kin2, rd17, erd10, FL35a3, FL5-77, FL5-2122, erd4, FL5-94, FL3-27
Genes inducibles
por frío: 2
FL5-90, DREB1A
Genes que no son blanco
de DREB1A: 4
FL5-3M24, FL5-3A15,
FL5-2O24, FL5-1A9
Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.
Los genes inducibles por frío y sequía fueron clasificados en dos grupos: los
que son blancos de la acción de DREB1A y los que no son inducibles por este gen.
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Tratamientos estrés abiótico evaluados en hoja
Salinidad
Frío
Control
4 plantas/maceta
Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja
expandida fueron regadas con solución 150 mM de NaCl durante 3
días (adaptado de Liu y Bard, 2003)
Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja
expandida fueron tratadas en cámaras a 10 grados durante 24
horas (Huang y col. 2005).
Plantas crecidas en invernáculo y en estadio de segunda hoja
expandida continuaron su crecimiento en invernáculo mientras las
otras recibían los tratamientos correspondientes.
Fernández et al 2008, BMC 8:11
Estudios de expresión de genes candidatos
frente a estreses abióticos
Análisis de expresión a gran escala mediante el uso de micromatrices de ADNc
a partir del banco local de ESTs
OBTENCIÓN DE ADNc
Y AMPLIFICACIÓN
GENERACIÓN DE SONDAS
IMPRESIÓN
HIBRIDACIÓN
ESCANEO Y PROCESAMIENTO DE LAS IMÁGENES
OBTENCIÓN DE MATRIZ DE EXPRESIÓN GÉNICA
Gentron Suc. Argentina
Microarreglo para deteccion de genes
candidatos para respuesta a frío y salinidad
Cluster jerárgico





80 genes diferenciales para
frío/sal
48 up/down en ambos estreses
17 inducidos estrés específicos
12down estrés especificso
3 patrones opuestos
Sal1
Sal2
Sal3
Frio2
Frio3
Frio1
Ctrl1
Ctrl2
F467
F319
F373
T155
F295
T479
F176
H360
F426
F514
F379
H406
F557
F496
T411
F491
T129
F593
T283
F340
F305
T243
F455
EF264
F554
F572
F482
F561
T368
F494
T307
T124
F577
H368
T120
F202
F489
EF127
H329
T464
T187
T322
F192
T111
T107
F171
F210
H411
F216
EF624
T253
H322
T340
EF502
F137
F230
H209
H304
H136
F209
H111
F175
H385
T234
F231
T221
H302
H387
F443
F549
H123
H125
H354
F543
H124
F550
EF432
T289
H110
F401
Fernández et al 2008, BMC 8:11
Secuenciación de alto rendimiento
Roche / 545 FLX (2004) o Titanium 2009
Desarrollo de
plataformas
automatizadas para
secuenciación
masiva
Illumina Solexa Genome analyzer (2006)
Applied Biosystems SOLIDTM System (2007)
Pacific Biosciences SMRT (2010)
Ion Torrent (2010)
Secuenciación de alto rendimiento
Plataforma de
secuenciación
ABI 3730xl
Genome
Analyzer
Roche 454
Titanium
Illumina
Genome
Analyzer
ABI SOLID
Pacific
Biosciences
Química de
secuenciación
Secuenciación
automática
por el método
de Sanger
Pirosecuenciación
sobre soporte
sólido
Secuenciación
por síntesis
con
terminadores
reversibles
Secuenciación
por ligación
Secuenciación
por síntesis
Método de
amplificación
del templado
Amplificación
in vivo
vía clonado
de ADN
PCR en
emulsión
¨Bridge¨ PCR
PCR en
emulsión
Ninguna
(molécula
única)
Longitud de
lectura
700-900 pb
300-400 pb
100 pb
75 pb
1-10 kpb
Producción de
secuencia
0,03-0,07 Mb/h
13 Mb/h
25 Mb/h
21-28 Mb/h
?
• Pronunciado descenso en el costo de secuenciación por base secuenciada
• Datos cualitativos (secuencia) y cuantitativos (abundancia de la secuencia)
• Posibilidad de incluir muchas situaciones por corrida
Identificación
de genes
inducibles
por estreses
abióticos
mediante
enfoques
transcriptómicos
Planta no estresada
(estado de referencia)
Planta estresada
(estado experimental)
ARNm
ARNm
ADNc
ADNc
Secuenciación
masiva
Secuenciación
masiva
Análisis bioinformático.
Selección de genes candidado
Análisis de función génica
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Clonado de genes candidatos
Ensayos en sistemas modelo
Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
•
Diferentes estudios han sido realizados con el objetivo de identificar genes asociados a la
senescencia sobre- y sub-expresados a lo largo de distintos estadios del proceso.
•
Una de las técnicas pioneras de alto desempeño que permite el estudio simultáneo de miles
de genes fue el desarrollo de micromatrices de oligonucleótidos.
133,682 EST Genbank
(Helianthus annuus L.)
MICROMATRIZ
(Agilent 44Kx4)
42.386 sondas
74 controles específicos
1.417 controles Agilent
(4x44, www.agilent.com)
(Fernández y col ., Plos One 2012)
Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
Genes asociados a la senescencia
≈1.200 SAGs de Arabidopsis
Leaf senescence database
(http://psd.cbi.pku.edu.cn/)
≈41.000 unigenes de girasol
Sunflower unigene Repository
(http://atgc-sur.inta.gob.ar/)
Campo
Control
Campo
Déficit h.
369 unigenes candidatos
alta identidad de secuencia
Invernáculo
Control
Condición
Control
Déficit H.
Campo
167
152
Invernáculo
103
60
Invernáculo
Déficit h.
Moschen 2013,, Tesis doctoral
Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
Factores de transcripción
≈23.000 FTs de Arabidopsis,
Oryza sativa, Populus trichocarpa,
Vitis vinifera, Zea mays.
Plant Transcription Factor Database
(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)
≈41.000 unigenes de girasol
Sunflower unigene Repository
(http://atgc-sur.inta.gob.ar/)
Condición
Campo Control
Control
Déficit h.
Campo
140
136
Invernáculo
123
86
Campo Déficit h.
Invernáculo Control
687 unigenes candidatos
alta identidad de secuencia.
Invernáculo Déficit h.
Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
T0 T1 T2
NAC
ANAC055
ANAC019
ANAC029
MYB
MYB44
MYB73
AP2-EREBP
ERF3
ERF72
ERF104
HB
HAHB4
Log2 FC
0
5
(Kim y col., 2009)
(Balasadeh y col., 2013)
Estudio transcriptómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
Análisis de correlaciones entre FT
ANAC19
ANAC02
ANAC47
ANAC55
ANAC81
Correlación de Spearman p-valor <0,01
Estudio integrador relacionado a la senescencia foliar en girasol
Genómica
Transcriptómica
Proteómica
Capítulo 4
Metabolómica
Biología de Sistemas
Mapman
BINCODE
1
1.1
1.1.1
1.1.1.1
1.1.1.2
1.1.2
1.1.2.1
1.1.2.2
11
11.3
11.3.2
3.1.1001
13.1.7.1002
NAME
PS
PS.lightreaction
PS.lightreaction.photosystem II
PS.lightreaction.photosystem II.LHC-II
PS.lightreaction.photosystem II.PSII polypeptide subunits
PS.lightreaction.photosystem I
PS.lightreaction.photosystem I.LHC-I
PS.lightreaction.photosystem I.PSI polypeptide subunits
lipid metabolism
lipid metabolism.Phospholipid synthesis
lipid metabolism.Phospholipid synthesis.choline kinase
minor CHO metabolism.raffinose family
amino acid metabolism.synthesis.histidine
Moschen 2013,, Tesis doctoral
IDENTIFIER
HeAn_C_11607
HeAn_C_3889
HeAn_C_677
HeAn_S_37979
HeAn_C_3253
DESCRIPTION
TYPE
moderately similar to ( 431) AT3G47470 | Symbols:
T LHCA4, C
moderately similar to ( 225) AT2G39050 | Symbols:
T
| hydro
moderately similar to ( 260) AT1G45474 | Symbols:
T LHCA5 |
moderately similar to ( 304) AT4G12800 | Symbols:
T PSAL | P
moderately similar to ( 229) AT2G31040 | Symbols:
T
| ATP sy
HeAn_S_18559 moderately similar to ( 222) AT3G18850 | Symbols:
T LPAT5 |
HeAn_S_17701 moderately similar to ( 254) AT4G09760 | Symbols:
T
| cholin
raffinose
minor CHO metabolism.raffinose
M
histidine
amino acid synthesis.histidine
M
(Thimm y col., 2004)
Estudio metabolómico relacionado a la senescencia foliar en girasol
Ensayo a campo (GC-TOF-MS)
Estudio integrador transcriptomica/metabolomica relacionado a la
senescencia foliar en girasol
Campo control: Tiempo 1 vs Tiempo 0
Estudio integrador relacionado a la senescencia foliar en girasol
Moschen 2013, Tesis doctoral
Esquema del (Programa Mapman) de genes (cuadrados) y metabolitos (círculos) Up regulados (rojo o
downregulados(azul) durante el proceso de senescencia
Tolerancia a estreses abióticos
Solutos compatibles
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Transformación
de tabaco con
el gen de
manitol-1P
deshidrogenasa
de Escherichia coli
- Se transformaron plantas de tabaco con una
construcción genética que contenía el gen mtlD
de E. coli bajo el promotor de 35S de CaMV.
- Se realizaron experiencias de crecimiento
en medios de alta concentración salina.
- Se evaluó la altura de la parte aérea y el peso
fresco de las plantas.
- Las plantas transgénicas toleraron mayores
niveles de salinidad.
Glucosa 6-fosfato
Fructosa
Fructosa 1,6-difosfato
Fructosa 6-fosfato
Agrobiotecnología
mtlD
Manitol 1-fostato
deshidrogenasa
Manitol 1-fosfato
Tolerancia
a estreses abióticos
Fosfatasa no
Fosfatasa
específica
inespecífica
Manitol
Transformación de tabaco con el gen
de manitol-1P deshidrogenasa de Escherichia coli
NT
NT
T
NT
T
T
Tomado de: Tarczynski et al., Science, 1993.
Plantas de tabaco transgénicas que
acumulan manitol y plantas control a los 30
días de crecimiento en medio de cultivo
conteniendo 250 mM de NaCl.
NT: no transgénica; T: transgénica.
Raíces de plantas de tabaco que acumulan
manitol y plantas control a los 30 días en medio
de cultivo sin sales (izquierda) y conteniendo
250 mM de NaCl (derecha).
NT: no transgénica; T: transgénica.
Transformación
de tabaco con
el gen fructan 6fructosyltransfera
(6-SFT) de la
gramínea
patagónica
Bromus pictus
- Se caracterizó el perfil de expresión del gen en B.
píctus, se asiló y clonó el mismo
- Se expreso en el sistema heterólodo Pichia pastoris
-Se transformaron plantas de tabaco con una
construcción genética que contenía el gen 6-SFT
bajo el promotor de 35S de CaMV.
-Se evaluó la actividad enzimática así como el
contenidio de fructanos en hojas de tabaco.
-Se realizaron ensayos sometiendo a plantas
previamente aclimatados o sin aclimatación a
condiciones de estrés por temperaturas de
congelamiento
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
- Se evaluó la perdidas de electrolitos así como la
altura de la parte aérea y el peso fresco de las plantas
en relación a controles no transgénicos.
Transformación de tabaco con el gen fructan 6-fructosyltransfera (6-SFT)
de la gramínea patagónica Bromus pictus
Las lineas trangénicas tanto aclimatadas como no aclimatadas presentaron menor daño de membrana plasmática comparada con
controles no trangénicos y mayores nivles de fructanos. Las lineas trangénicas reasumieron el desarrollo despues del tratamiento de
congelamiento.
Del Viso et al, 2011, J Plant Phys. 168 : 493–499
Vía ubicua; no inducible por
estrés en Arabidopsis thaliana
Vía ubicua y su extensión, la cual es inducible por
estrés en Mesembryanthemum crystallinum
Ruta de síntesis de D-ononitol y de D-pinitol
en la planta del hielo (Mesembryanthemun crystallinum)
Pool de glucosa 6 -fostato
inps1
Inositol 1 -fosfato
sintetasa
Pool de myo -inositol 1 -fosfato
imp1
Inositol
monofosfatasa
myo -inositol
imt1
Fosfoinosítidos,
fosfolípidos, fitatos
D-glucuronato -1-fosfato,
síntesis de pared celular,
galactinol para azúcares
de rafinosa
Inositol
O -metiltransferasa
D-Ononitol
Ononitol
epimerasa
oep1
D-Pinitol
Adaptada de: Bohnert and Jensen. Trends in Biotechnology,1996.
La ruta de síntesis de D-ononitol y D-pinitol a partir de glucosa 6-P es inducible por sequía y/o
salinidad en varias familias de plantas halófilas. En la planta del hielo (Mesembryanthemun
crystallinum) se ha demostrado la inducción coordinada de la transcripción de inps1 y imt1. En
cambio, inps1 no se induce bajo estrés y el gen imt1 no está presente en Arabidopsis thaliana.
Expresión
constitutiva del gen
de la mio-inositol
O-metiltransferasa de
Mesembryanthemum
crystallinum en
Nicotiana tabacum
mio-inositol
D-ononitol
Tomado de: Sheveleva et al., Plant Physiol.,1997.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Acumulación de mio-inositol y D-ononitol en plantas de tabaco
no transformadas (SR1) y en una línea transgénica (I5A)
transformada con el gen de imt1 de M. crystallinum en condiciones
de carencia de riego. Las plantas fueron privadas de agua durante
8 días. Las plantas I5A exhibieron mayor tasa fotosintética,
mayor nivel de fijación de CO2 y mayor recuperación de la
fotosíntesis que los controles en condiciones de estrés .
Rutas biosintéticas presentes en diferentes organismos
para la síntesis de glicina betaína
Rutas
dede
dehidrogenación/oxidación
de la
Rutas
deshidrogenación/oxidación
decolina
la colina
a) Plantas
CMO: colina monooxigenasa
COD: colina oxidasa
CDH: colina deshidrogenasa
colina
betaína aldehído
glicina betaína
b) Escherichia coli
BADH: betaína aldehído
deshidrogenasa
GSMT: glicina sarcosina
metiltransferasa
SDMT: sarcosina dimetiltransferasa
colina
betaína aldehído
glicina betaína
Fd(red) / Fs(ox): ferredoxina en
forma reducida u oxidada
SAH: S-adenosilhomocisteína
c) Arthrobacter globiformis
SAM: S-adenosilmetionina
glicina betaína
colina
Ruta de metilación de la glicina *
glicina
sarcosina
(N-metilglicina)
N,N-dimetilglicina
glicina betaína
Adaptado de: Murata and Chen Curr. Opin. Plant Biol., 2002.
* La ruta de metilación de la
glicina fue identificada en dos
microorganismos halófilos:
Actinopolyspora halophila y
Ectothiorhodospira halochocloris
Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen
de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
- Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con una construcción
que contiene el gen codA de la bacteria del suelo Arthrobacter globiformis
dirigido por el promotor 35S de CaMV. Se agregó una señal de transporte
a cloroplastos a la secuencia del transgén para permitir la acumulación
de la enzima en dicha organela.
p35S rbcS tr
codA
tnos
- El contenido de glicina-betaína en hojas de plantas transgénicas aumentó
respecto del control.
- Las plantas transgénicas exhiben tolerancia al estrés salino y a altas
y bajas temperaturas.
Contenido (mol g-1 peso fresco)
Control
Línea 1
Línea 2
Línea 3
Colina
1,5 ± 0,3
1,4 ± 0,3
0,8 ± 0,2
1,0 ± 0,3
Glicinabetaína
0,0
0,9 ± 0,2
1,2 ± 0,2
0,8 ± 0,3
Tomado de: Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Transformación de Arabidopsis thaliana con el gen
de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
Efecto del estrés salino
sobre la germinación y el crecimiento
de plantas transgénicas y control
Tamaño de la planta (cm)
NaCl
(mM)
Control
Línea 1
Línea 2
Línea 3
0
3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2
3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2
100
0,2 ± 0,0 2,5 ± 0,3
2,0 ± 0,1 2,2 ± 0,1
200
0,1 ± 0,0 0,8 ± 0,1
0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,1
300
0,0
0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0
0,2 ± 0,0
Se hicieron germinar 5 semillas de plantas controles
y 5 semillas de cada una de las líneas transgénicas
en placas de Petri suplementadas con varias
concentraciones de NaCl. Después de incubar a 0oC
por 2 días, las placas se incubaron a 22oC para
permitir la germinación y el crecimiento de plántulas.
Se midió la altura total de las plantas desde el tope
de la parte aérea hasta la punta de la raíz a los 5 días
de transferir las semillas a 22oC.
Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Efecto del estrés salino en plantas transgénicas
y controles desarrolladas
A
B
5 cm
Transformación
de Arabidopsis
thaliana con el
gen de colina
oxidasa
de Arthrobacter
globiformis
Se cultivaron plantas
controles sin transformar
y transgénicas en medio
hidropónico por 30 días.
Las plantas se
transfirieron luego
a medio suplementado
con 200 mM de NaCl
y se las incubó por 10
días con luz.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
A: Planta control no transgénica
B: Planta transgénica
Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Transformación
de Arabidopsis
thaliana con el
gen de colina
oxidasa
de Arthrobacter
globiformis
Inducción de daños visibles en hojas de plantas
controles y transgénicas por bajas temperaturas
A
B
Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Se cultivaron plantas transgénicas y controles durante 30 días y se las
incubó a 5oC bajo luz continua por 7 días. A continuación, las plantas
fueron incubadas en condiciones normales por 2 días.
A: Planta control no transgénica
B: Planta transgénica
Tolerancia a altas temperaturas en plantas de Arabidopsis thaliana
que expresan el gen de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis
No transgénica
Transgénica
22°C
50°C
22°C
50°C
40°C
55°C
40°C
55°C
Tomado de: Alia et al., The Plant Journal, 1998.
Efecto de altas temperaturas durante la imbibición y subsiguiente germinación de semillas
de plantas no transgénicas y transgénicas. La semillas fueron imbibidas a 22, 40, 50 y 55oC
por 1 hora y luego sembradas en placas. Luego de incubarlas a 4oC por 2 días, las semillas
fueron mantenidas a 22oC por 3 días.
Comportamiento frente a distintas formas de estrés de
plantas modificadas para sobrexpresar glicina betaína
Especies
Gen
Acumulación
máxima
Tolerancia
aumentada
Arabidopsis thaliana
codA
codA
codA
codA
codA
codA
cox
1,2 mol g –1 pf
1,2 mol g –1 pf
1,2 mol g –1 pf
1,2 mol g –1 pf
1,2 mol g –1 pf
1,2 mol g –1 pf
19 mol g –1 ps
Frío
Frío, salinidad
Calor
Luz intensa
Salinidad
Heladas
Heladas, salinidad
Brassica napus
cox
13 mol g –1 ps
Sequía, salinidad
Brassica juncea
codA
0,82 mol g –1 pf
Salinidad
Diospyros kaki
codA
0,3 mol g –1 pf
Salinidad
Nicotiana tabacum
cox
betA
betA / betB
13 mol g –1 ps
*
0,035 mol g –1 pf
Salinidad
Salinidad
Frío, salinidad
Oryza sativa
codA
betA
(modificado)
5,3 mol g –1 pf
5,0 mol g –1 pf
Frío, salinidad
Sequía, salinidad
* No se dispone de datos
Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002.
codA: gen de colina oxidas de E. coli; cox: gen de colina colina oxidasa de A. globiformis; BetA y BetB: genes de betaína deshidrogenasa
y de betaína aldehido deshidrogenasa de E. coli;
Tolerancia frente a distintas formas de estrés de plantas
modificadas para producir otros solutos compatibles
Solutos
compatibles
Gen
Planta
hospedadora
Acumulación
máxima
Tolerancia
aumentada
Fructano
sacB
sacB
Tabaco
Remolacha
azucarera
0,35 mg g –1 pf
0,5 % ps
Sequía
Sequía
Manitol
mt1D
mt1D
mt1D
mt1D
Arabidopsis
Tabaco
Tabaco
Tabaco
10 mol g –1 pf
6 mol g –1 pf
3,8 mg g –1 ps
7 mol g –1 pf
Salinidad
Salinidad
Salinidad
Estrés oxidativo
D-ononitol
imt1
Tabaco
35 mol g –1 pf
Sequía, salinidad
Prolina
Anti-proDH
P5CF127A
Arabidopsis
Tabaco
600 g g –1 pf
4 mg g –1 pf
Heladas, salinidad
Salinidad
Sorbitol
S6PDH
Caqui
61,5 mol g –1 pf
Salinidad
Trehalosa
TPS1
TPS1
TPS1
otsA, otsB
Tabaco
Papa
Tabaco
Tabaco
3,2 mg g –1 ps
*
*
90 g g –1 pf
Sequía
Sequía
Sequía
Sequía
Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002..
* No se dispone de datos
Anti-proDH: ADNc antisentido del gen de prolina deshidrogenasa de A. thaliana; imt: gen de myo-inositol O-metil transferasa de M.
crystallinum; mt1D: gen de la manitol-1-fosfato deshidrogenasa de E. coli; otsA y otsB: genes de trehalosa-6-fosfato sintetasa y de
treahalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli; P5CS: gen de ´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; P5CF127A: gen mutado de
´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; SacB: gen de la levanosacarasa de B. subtilis; S6PDH: gen de la sorbitol-6-fosfato
deshidrogenasa de manzano; TPS1: gen de la trehalosa-6-fosfato sintetasa de levadura.
Tolerancia a estreses abióticos
Bombas de Na+/H+
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Regulación de
la homeostasis
de Na+ y K+
por la ruta SOS
exportación
H+
compartimentalización
exclusión
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Adaptado de: Zhu. Annual Review in Plant Biology, 2002.
El estrés por alta concentración de Na+ da lugar a una señal mediada por
Ca2+ que activa el complejo de kinasas SOS3-SOS2, el que a su vez
estimula la actividad de intercambio Na+/H+ de SOS1 y regula la expresión
de distintos genes a nivel transcripcional y post-transcripcional.
Tolerancia a estrés salino en plantas de tomate transformadas
con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana
A
B
D
Tomado de: Zhang and Blumwald.
Nature Biotechnology, 2001
C
Plantas controles (A) y transgénicas (B)
crecidas en 5 mM NaCl
A
Plantas controles (C) y transgénicas (D)
crecidas en 200 mM NaCl
B
A: Frutos de plantas controles
B: Frutos de plantas transgénicas
Tolerancia a estrés salino en plantas de Brassica napus transformadas
con el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana
Plantas transgénicas y control crecidas en 200 mM de NaCl
Tomado de: Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.
X1OE1
X1OE2
X1OE3
Controles
Las diferentes líneas transgénicas presentan niveles de expresión
X1OE1: nivel alto; X1OE2: nivel medio; X1OE3: nivel bajo
Tolerancia a estrés salino en plantas de Paspalum dilatatum
transformadas con el gen nhx1 de Arabidopsis thaliana
Se transformaron plantas de P. dilatatum con una construcción que
permite expresar el gen nhx1 de A. thaliana en forma constitutiva
T
WT
T
WT
T
T
Gentileza: Ing. Agr. G. Schrauf
Texto: Arial 24
Plantas transgénicas (T) y control (WT) regadas con 250 mM NaCl
Tolerancia a estreses abióticos
Sobrexpresión de citoquininas
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Tolerancia
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
• La salinidad y la sequía aceleran el proceso de
. senescencia en las plantas.
• Bajo un estrés no letal, las plantas tienden a florecer
. más rápidamente.
• El estrés modifica la relación fuente/sumidero
• Las citoquininas retrasan el proceso de senescencia
El retraso de la senescencia originada por el estrés puede proveer
mecanismos de supervivencia mediante la activación de mecanismos
de evasión (regulación del turn-over proteico, mayor eficiencia en el
uso de agua, consumo de nutrientes de almacenamiento, retraso de
la floración inducida por estrés)
Se expresó un gen de la enzima isopentenil transferasa (IPT) bajo un
promotor inducible por senescencia para mantener niveles óptimos
de citoquininas y retrasar el estrés inducido por este proceso. La IPT
es el factor limitante de la biosíntesis de citoquininas.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
SARK
IPT
El promotor utilizado proviene del gen de
una quinasa tipo receptor asociada a
senescencia (SARK) de Phaseolus vulgaris.
El gen SARK es inducido por este proceso.
No transgénica
Transgénica
Gentileza Dr. E. Blumwald
Tolerancia
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Fila superior: sin riego segunda semana
Fila inferior: riego restaurado, tercera semana
La tolerancia a estrés hídrico puede visualizarse como un
carácter de productividad en condiciones de escasez de agua
Gentileza Dr. E. Blumwald
Tolerancia
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Plantas transgénicas y control cultivadas en condiciones de riego
diario normal (derecha) y bajo 30% del riego diario normal (izquierda)
Peso fresco de plantas
Producción de semillas
semillas /planta
Peso fresco (g/planta)
Tolerancia
a estrés hídrico
en tabaco
transformado
con el gen ipt
bajo un
promotor
inducible
por senescencia
Tolerancia
a estreses abióticos
1 L/día
0,3 L/día
Sequía
Gentileza Dr. E. Blumwald
Agrobiotecnología
Peso seco
(g semilla/planta)
Rendimiento de semillas
Tolerancia a estreses abióticos
Expresión de factores de transcripción
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Transformación
de plantas de
Arabidopsis
thaliana
con el gen
del factor de
transcripción
Hahb-4
de girasol
Gentileza Dr. R. Chan
La
disponibilidad
de agua regula
la expresión
del gen hahb-4
en los
diferentes
órganos de la
planta
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Hahb-4 es un factor de transcripción de girasol que
pertenece a la familia Hd-Zip. Los factores de este tipo
contienen un dominio de unión a ADN asociado con
un cierre de leucinas y estarían involucrados en procesos
del desarrollo vinculados a factores ambientales.
Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana
con el gen del factor de transcripción Hahb-4 de girasol
Plantas
transformadas
con
el gen Hahb-4
(derecha ) y
no transgénicas
(izquierda)
sometidas a
sequía.
Gentileza Dr. R. Chan
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
T
WT
WT
T
T
WT
Plantas de
Arabidopsis
thaliana de 28
días postgerminación
sometidas a
estrés hídrico
extremo
Gentileza Dr. R. Chan
Transformación
de plantas de
Arabidopsis
thaliana
con el gen
del factor de
transcripción
Hahb-4
de girasol
Las mismas
plantas que en
el panel
superior a las 24
h de resumido el
riego normal
WT
T
Ensayos de campo con plantas de trigo transformadas
con el gen Hahb-4 de girasol
39°54’51”S
62°37’12”W
Yield (kg ha-1)
4000
b
Villalonga
ab
3000
ab
ab
a
a
2000
1000
00
4
BI
3
.1
2
Ta
.IV
.ii
.a
Ta
.IV
.ii
.a
.6
Ta
.IV
.ii
.a
.4
W
Villalonga
Ta
.IV
.ii
.a
.3
ild
Ty
pe
0
Ta.IV.ii.a.6
Ta.IV.ii.a.12
2000
Monte Buey
32°55’08”S
62°27’28”W
Yield (kg ha-1)
1500
1000
500
0
Wild type
Monte Buey
Ta.IV.ii.a.3
Ta.IV.ii.a.4
Gentileza Ing. Agr. G. Watson
Etapas de experimentacion para la llegada de un cultivo
transgénico al mercado
Tolerancia a estreses abióticos
Proteínas LEA
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Sobreexpresión
del gen hva1
de cebada
(Hordeum vulgare
L.) en plantas
transgénicas
de arroz
Se transformaron plantas de arroz con el gen hva1
de cebada que codifica una proteína LEA (Late
Embryogenesis Abundant). La secuencia se puso
bajo la dirección del promotor de actina de arroz.
Las plantas transgénicas exhibieron mayor crecimiento
de hojas y raíces en condiciones de estrés.
Planta control
no transgénica (NT)
y dos líneas
transgénicas (36, 41)
que fueron
sometidas a tres
ciclos consecutivos
de estrés hídrico
de 7 días cada uno,
consistentes en
5 días sin riego
seguidos por 2 días
con riego.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Tomado de: Xu et al., Plant Physiol., 1996.
Tolerancia a estreses abióticos
Citrato sintetasa
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas
con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
- Los suelos ácidos y con alta concentración de aluminio resultan tóxicos para
las raíces, las cuales no son capaces de desarrollarse y absorber los nutrientes
disponibles.
- El exudado de ácidos orgánicos produce la quelación del aluminio produciendo
tolerancia al mismo.
- Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con una construcción que contiene
el gen de citrato sintetasa (csb) de la bacteria Pseudomonas aeruginosa dirigido
por el promotor 35S de CaMV.
- Se cuantificaron los niveles de citrato en la planta y del exudado por las raíces,
en raíces transgénicas con CSb y controles sin transformar.
Línea
Niveles de citrato (mmol
por gramo de peso fresco)
Eflujo de citrato (nmol
por plántula por hora)
Control
0,43 ± 0,05
57 ± 7,2
CSb-4
1,41 ± 0,07
105 ± 12,2
CSb-11
1,62 ± 0,08
111 ± 12,6
CSb-15
2,31 ± 0,10
163 ± 14,3
CSb-18
4,47 ± 0,35
231 ± 15,3
Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.
- Las plantas transformadas toleraron altas concentraciones de aluminio.
Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadas
con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
A: Plantas controles germinadas
en medio con (derecha) y sin
(izquierda) 300 M de aluminio,
2 semanas post-germinación.
B
A
C
D
E
F
G
B y C: Plantas controles (B)
y CSb-18 (C) germinadas
en medio conteniendo 0, 75, 300
y 1000 M de aluminio, 10 días
post-germinación.
D y E: Plántulas CSb-4 y CSb-18
de una semana germinadas
en 200 M de aluminio.
H
I
J
H: Segregación del fenotipo
de tolerancia a aluminio
en la progenie de CSb-18 luego
de 4 semanas de crecimiento
en medio con 300 M de aluminio.
Las flechas indican
las plántulas susceptibles.
F, G, I y J: Tinción con hematoxilina de los pelos y la punta
de las raíces de plántulas de 7 días
tratadas por 1 h con 100 M
de aluminio. (F) y (I) son controles
y (G) y (J) plántulas CSb-18.
Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.
Tolerancia
a aluminio en
plantas de papaya
transformadas
con el gen de
citrato sintetasa
de Pseudomonas
aeruginosa
Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.
Agrobiotecnología
Tolerancia
a estreses abióticos
Plantas de papaya (Carica papaya) control
y transformadas con el gen csb a los 30 días de
cultivo en presencia de 300 M de aluminio.
Izquierda: planta de papaya transgénica;
derecha: planta transformada con el vector vacío.
Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que
expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
• En suelos alcalinos (compuestos fosforados con calcio y magnesio) y ácidos
(compuestos fosforados con hierro y aluminio) la disponibilidad de fósforo
soluble es baja.
• El exudado de ácidos orgánicos por parte de las raíces aumenta su
disponibilidad.
• Se introdujo en plantas de tabaco el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas
aeruginosa bajo el promotor 35S de CaMV.
• Las plantas que expresaron la citrato sintetasa fueron capaces de solubilizar
y absorber el fósforo inmovilizado en suelos alcalinos.
actividad CS
(mg CoA min-1mg-1
proteína)
225 ±11
eflujo de citrato
(nmol por plántula por
hora)
57 ± 7,2
CSb-4
430 ± 14
105 ± 12,2
Csb-18
595 ± 18
231 ± 15,3
Línea
1522 (control)
Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.
Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que
expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
A1522
C
B
A
CS-4
CS-18
B1522
CS-4
CS-18
1522 CS-4
C
CS-18
D
Crecimiento y productividad de líneas de
tabaco CSb sometidas a distintos
tratamientos con fósforo. Se cultivaron
plantas transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y
control (1522) en suelo alcalino estéril de
bajo contenido de fósforo, con o sin
agregado de fósforo. Las plantas fueron
fotografiadas luego de 4 meses en el
invernáculo.
A: Plantas cultivadas sin agregado de P.
e P.
B y C: Plantas cultivadas con el agregado
de 22 ó 108 mg de PO4H2Na por kg de
suelo, respectivamente
D
1522
CS-4
CS-18
E
D: Frutos de plantas cultivada con 22
ppm de PO4H2Na
E: Vista superior de una maceta
conteniendo la planta CSb-18 en que se
observan precipitados de citrato de calcio
(flechas).
F
G
H
Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.
F-H: Tinción de raíces de la planta CSb18 con Tryptan blue. F: planta no
inoculada. G y H: planta inoculada con la
micorriza Glomus fasciculatum
Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que
expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa
Efecto de citrato
en la acumulación
de biomasa de plantas
de tabaco cultivadas
en medio conteniendo una
fuente insoluble de fosfato
Sin
Se cultivaron plantas
transgénicas (CSb-4
y CSb-18) y control (1522)
en medio (pH 8,0)
suplementado o no con 1 mM
de ácido cítrico. Las fuentes
soluble e insoluble de fosfato
(PO4H2Na y Ca10(PO4)6(OH)2)
se ajustaron a 1 mM. Las
plántulas se cosecharon
a los 15 días y se determinó
el peso seco. Datos promedio
de tres experimentos
independientes.
Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.
Nuevas estrategias basadas en gene targeting
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.
Ejemplos de otros genes utilizados para conferir
tolerancia a estreses abióticos
Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.
Referencias
1.
2.
3.
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5.
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Tolerancia
a estreses abióticos
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