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Agrobiotecnología. Curso 2013
Clase 13: Tolerancia a estreses abióticos
Estreses abióticos
Transparencias 3-5
Las respuestas de tolerancia al estrés desarrolladas por los distintos organismos para
adaptarse a situaciones desfavorables son mediadas usualmente por cambios en el
flujo metabólico. Las plantas están continuamente expuestas a estreses ambientales
que influyen en su desarrollo, crecimiento y productividad. Los genes inducidos por
estrés pueden codificar proteínas regulatorias, enzimas involucradas en una vía
metabólica particular o proteínas con propiedades protectoras específicas. Las
características de estas respuestas son altamente variables y dependen de las
especies, variedades y del estado particular del desarrollo de la planta.
Con excepción de las inundaciones, la mayor parte de los estreses abióticos provienen
del estrés por déficit de agua (transparencia 4). La membrana celular constituye una
barrera impermeable para las macromoléculas y para la mayoría de los compuestos
de bajo peso molecular. Cuando las concentraciones de solutos extracelulares
resultan alteradas o se forma hielo extracelular, hay un flujo de agua desde el interior
de las células hacia el medio, lo que disminuye la turgencia del tejido, incrementa la
concentración de solutos intracelulares e introduce distintas tensiones sobre las
membranas y macromoléculas. Asimismo, la menor disponibilidad de agua provoca
una reducción en la tasa fotosintética pudiendo ser esta completamente inhibida en
condiciones de estrés severo. Cuando la fotosíntesis desciende y los cloroplastos son
expuestos a excesos de energía de excitación hay fotorreducción de oxígeno y una
producción concomitante de especies reactivas, tales como superóxidos y peróxidos.
Estas especies dañan las membranas y la maquinaria biosintética de la célula. En la
respuesta de las células vegetales al estrés osmótico se hallan involucradas distintas
funciones bioquímicas. Entre ellas, las más importantes son la exclusión y exportación
de iones, el ajuste osmótico y la osmoprotección, y las modificaciones a nivel de la
pared celular. Por otra parte, las células vegetales disponen de enzimas antioxidantes,
tales como las peroxidasas y superóxidos dismutasas, que les permiten desactivar las
especies reactivas de oxígeno.
En los próximos 50 años, será necesario producir entre dos y tres veces más comida
que en la actualidad para alimentar adecuadamente a la población del planeta
(transparencia 5). La creciente degradación de los suelos agrega un factor de
incertidumbre importante a la hora de considerar este desafío. La búsqueda de
mayores beneficios a corto plazo en la agricultura intensiva se convirtió en la principal
causa del deterioro de los suelos y el agua y, por lo tanto de los procesos de
desertificación en los países subdesarrollados.
Problemas y pérdidas producidas por estreses abióticos
Transparencias 6-11
Desde 1972, la producción alimentaria en aumento es el principal factor de presión
ejercido sobre los recursos de la tierra (transparencias 7 y 8). Actualmente se estima
que las tierras secas cubren el 40% de toda la superficie terrestre (alrededor de 5.100
millones de hectáreas), que son el hábitat y el medio de subsistencia de más de 1.000
millones de personas. La desertificación afecta al 70% de las tierras secas del mundo,
que representan 3.600 millones de ha, es decir, la cuarta parte de todas las tierras del
mundo. En América del Sur, la desertificación afecta cerca de 250 millones de ha. Uno
de los principales procesos que conducen a la desertificación es la salinidad, la que
reduce considerablemente el desarrollo vegetativo y, por ende, el rendimiento de los
cultivos. Las condiciones de vida de más de 900 millones de personas (casi la sexta
parte de la población mundial) están amenazadas porque las tierras de las cuales
dependen corren peligro de convertirse en un desierto. La actividad humana es la
principal causa de la desertificación, ya que el clima y las sequías solamente la
favorecen. La pérdida de bosques conduce rápidamente a procesos de desertificación
como la erosión del suelo y la desestabilización de las capas freáticas, lo que produce
inundaciones y sequías.
Para abastecer la futura demanda mundial, la producción de alimentos debe
duplicarse y hasta triplicarse en un plazo de aproximadamente 25 años. Ello debe
lograrse utilizando esencialmente la misma superficie de tierra arable, enfrentando
suministros decrecientes de agua y empleando métodos de producción sustentables.
Compatibilizar el incremento de la producción agrícola con la preservación del medio
ambiente (conservación de hábitats y de biodiversidad) representa un gran desafío
que implica cambios profundos en los métodos y formas de producción actuales. Por
la envergadura y complejidad del problema, su resolución no sólo depende de la
adopción de tecnologías superiores de producción, sino también de políticas sociales y
económicas apropiadas. Sin embargo, las aplicaciones de la biotecnología a la
agricultura, junto con las prácticas mejoradas de manejo agrícola, pueden contribuir en
un grado importante a aportar soluciones.
Tal como muestra la tabla de la transparencia 9, las pérdidas producidas por estreses
abióticos superan ampliamente a las producidas por los bióticos. Se puede observar la
gran diferencia que existe entre el rendimiento promedio y el rendimiento máximo (un
indicador del rendimiento posible en condiciones ideales) de los principales cultivos.
Además, como se observa en la última columna, los estreses abióticos son los que
aportan la mayor parte de las pérdidas. Las mismas están calculadas a partir del
rendimiento máximo.
La creciente demanda de agua para uso agrícola, el agotamiento de las napas en
importantes regiones productivas y la competencia con otros usos (industria,
doméstico) agregará un factor adicional a la incidencia de los estreses de tipo hídrico
(transparencia 9). El tema es también relevante para amplias regiones de la Argentina
y para la población que habita en las mismas (transparencia 10).
Respuestas a estreses abióticos
Transparencias 12-21
Una planta en un ambiente desfavorable podría enfrentar las siguientes situaciones: a)
estrés letal, que puede finalmente provocar su muerte a causa del incremento de las
actividades de senescencia y b) estrés subletal o estrés letal precedido por un estrés
subletal, durante el cual pueden producirse cambios adaptativos que permiten su
supervivencia. Estas adaptaciones pueden ocurrir a nivel molecular, involucrando
cambios en la expresión génica y en la síntesis proteica, o a nivel bioquímico,
involucrando la síntesis de distintos metabolitos. Estos últimos cambios conducen a
respuestas celulares y fisiológicas alteradas. Mientras muchas respuestas son
comunes a los diferentes estreses abióticos, otros son específicos para un tipo
particular de estrés. A nivel de toda la planta, los efectos comunes causados por los
estreses abióticos incluyen reducciones en la germinación de las semillas y en el
establecimiento de las plántulas, pobre vigor de los brotes, decrecimiento en el largo
de las raíces, enrollamiento de las hojas, reducción en la viabilidad del polen,
senescencia de las hojas, y reducción y llenado incompleto de los granos
(transparencia 14). Por otra parte, a nivel celular o subcelular, los cambios específicos
inducidos por estrés incluyen incremento en la insaturación de los lípidos de las
membranas (respuesta a estrés por baja temperatura), niveles incrementados de
diferentes osmolitos (respuesta a deshidratación, salinidad o baja temperatura),
represión general de la biosíntesis de proteínas (respuesta a estrés hídrico o de alta
temperatura), cambios selectivos en los niveles de K+/Na+ (respuesta a salinidad) y
regulación positiva de la glucólisis y enzimas requeridas para la fermentación
alcohólica (respuesta a estrés anaeróbico).
Los cambios inducidos por estrés en el metabolismo y el desarrollo de la planta
pueden ser atribuidos a cambios en la expresión génica (transparencia 15). Una
respuesta al estrés es iniciada cuando el mismo es reconocido a nivel celular. Dicho
reconocimiento activa vías de transducción de señales que transmiten la información
en el interior de las células individuales y a través de la planta. Aunque aún se conoce
poco sobre cómo las plantas reconocen los estreses impuestos por el medio, muchas
evidencias indican que la regulación de las respuestas involucran hormonas
(especialmente ácido abscísico, ácido jasmónico y etileno) y segundos mensajeros
(tales como Ca2+). Algunos genes aumentan mucho su expresión como respuesta al
estrés, mientras que otros son reprimidos. Las proteínas codificadas por los genes
inducidos en condiciones desfavorables son frecuentemente acumuladas en las
células. La función de estas proteínas y los mecanismos que regulan su expresión son
actualmente un tópico central en la investigación de la fisiología del estrés.
Las respuestas adaptativas pueden ser conceptualmente agrupadas en tres grupos: a)
respuestas homeostáticas, que incluyen las de tipo iónico (relacionadas principalmente
con el estrés salino) y las de ajuste osmótico (relacionadas principalmente con el
estrés hídrico); b) respuestas de detoxificación o de control y reparación del daño
ocasionado por el estrés y; c) respuestas de control de la división celular. La
señalización del estrés por salinidad o sequía puede dividirse en tres categorías
funcionales: a) la señalización de estrés iónico y osmótico, que conduce al
restablecimiento de la homeostasis celular; b) la señalización de la detoxificación, que
conduce al control y reparación de los daños producidos por el estrés y; c) la
señalización involucrada en la coordinación, división y expansión celular para ajustarla
a niveles adecuados a las condiciones de un estrés particular (transparencia 16). La
señalización para la homeostasis regula negativamente las respuestas de
detoxificación porque, una vez que la homeostasis celular ha sido reestablecida, los
daños concomitantes al estrés también se reducen. A la inversa, el fracaso en
restablecer la homeostasis agravará el nivel de las lesiones. La señalización para la
homeostasis y para la detoxificación conduce a establecer la tolerancia al estrés; si
esta tolerancia se establece, se espera que la misma señalización anule la inhibición
de la división y el crecimiento celular. La ruta de señalización de la detoxificación es
inducida por daños derivados de estreses de tipo hídrico y salino (por ejemplo, daños
físicos en las membranas y complejos macromoleculares), y promueve la activación de
mecanismos de control y de reparación de daños (por ejemplo, activación de genes de
tolerancia a la deshidratación). En el esquema de la transparencia 16 se indican las
interacciones entre las rutas homeostáticas, de detoxificación y de regulación del
crecimiento.
El ajuste osmótico ocurre cuando se incrementa la concentración de solutos dentro de
la célula vegetal y permite mantener una presión de turgencia positiva dentro de la
misma (transparencia 17). Como todas las moléculas, el agua puede ser descripta
termodinámicamente en términos de su contenido de energía libre (también conocida
como potencial químico). Los fisiólogos vegetales utilizan un parámetro relacionado, el
potencial de agua (w), para predecir el movimiento del agua hacia adentro o fuera de
la célula y evaluar el estado de hidratación de los órganos o de la planta completa. La
diferencia de potencial a través de una membrana (por ejemplo, la membrana
plasmática, el tonoplasto, o las membranas de otras organelas) determina la dirección
del flujo del agua. El agua se mueve espontáneamente hacia sus potenciales
inferiores.
El potencial de agua de una planta está determinado por la suma de varios potenciales
parciales, lo que puede expresarse mediante la fórmula: w = s + P +g + m. El
potencial de soluto, S, decrece cuando aumenta el número de partículas disueltas en
el agua. El potencial de agua de la célula, w, decrece cuando la concentración de
solutos aumenta. El potencial de presión, P, refleja las fuerzas físicas ejercidas sobre
el agua por su ambiente. Cuando el agua es sometida a presión negativa (tensión), P
es menor que 0 MPa y w disminuye. Al contrario, cuando el agua es sometida a
presión positiva (turgencia), P es mayor que 0 Mpa. El potencial gravitacional, g,
puede tener un efecto sustancial cuando el agua es transportada verticalmente a
distancias mayores de 5-10 m, pero este término puede ser omitido cuando se trata de
transporte entre células o en plantas pequeñas. El potencial de matriz o de pared, m,
toma en cuenta como las superficies sólidas (por ejemplo, paredes celulares y
coloides) interactúan con el agua y reducen el w. Sin embargo, debido a que los
valores de m son tan pequeños y difíciles de medir, el impacto del m sobre el
potencial de agua de la planta es usualmente ignorado. Para aquellas circunstancias
en que el g y el m resultan insignificantes, la ecuación del potencial agua
simplificada es: w = S + P.
La transparencia 18 muestra los cambios producidos en los distintos potenciales en
dos situaciones distintas (una célula turgente y una célula plasmolizada). Como
resultado de la acumulación de solutos, S decrece, promoviendo el flujo de agua
hacia adentro de la célula. En las células que no pueden ajustarse osmóticamente, los
solutos se concentran pasivamente, pero se pierde la turgencia. Para que el agua
ingrese en la célula, el potencial de agua en el medio externo debe ser mayor que en
el medio interno (panel superior). La extensión de la plasmólisis en la célula del panel
inferior puede llegar a ser letal. Nótese que la célula se deshidratará hasta llegar a
equilibrio con la solución externa (W célula = W externa = - 2,5 MPa)
La transparencia 20 muestra un esquema de las funciones bioquímicas asociadas con
la tolerancia a estrés hídrico. El esquema incluye tres compartimentos que están
definidos por la membrana plasmática y el tonoplasto. Se muestran los efectos de la
acción de proteínas cuya expresión está relacionada con la tolerancia al déficit de
agua. El esquema se focaliza en los principios bioquímicos y no incluye eventos de
señalización o rutas que conducen a alterar la expresión génica. Los mecanismos
actuantes más probables ante estreses hídricos o salinos son los de ajuste osmótico y
de eliminación de radicales libres, pero la absorción de iones y su
compartimentalización, y el control del flujo de agua también juegan un papel
importante.
La exclusión parecería ser la estrategia más obvia para enfrentar el exceso de sodio.
Sin embargo, un estrés salino prologado puede desbordar la capacidad de los
sistemas involucrados en este proceso. Por otra parte, a menos que la presión
osmótica interna pueda ser incrementada concomitantemente por otra vía, la exclusión
eficiente o excesiva de iones puede resultar en estrés por sequía. Además, los
cambios en la concentración de sodio también afectan la homeostasis de otros iones.
En particular, el sodio interfiere con la absorción de potasio, otro macroión esencial
para la fisiología celular. La exposición de células que mantienen un potencial de
membrana fisiológico al estrés salino resulta en la entrada pasiva de sodio a través de
los canales y transportadores de potasio.
Otras proteínas que son importantes para el mantenimiento del balance osmótico son
las acuoporinas. Estas proteínas, que conforman canales de agua, están presentes en
todos los organismos. Las acuoporinas facilitan el movimiento de agua a lo largo de
gradientes osmóticos y su actividad parece estar regulada por mecanismos de
fosforilación. La regulación de la expresión y de la actividad de las acuoporinas
conforma un mecanismo adicional para compensar la presencia de sodio o la carencia
de agua en el medio externo. La regulación de la actividad de las acuoporinas y la
producción local o tejido-específica de osmolitos pueden actuar en forma sinérgica
para regular la absorción y transporte de agua en ausencia de transpiración.
En resumen, las estrategias para desarrollar tolerancia a estrés hídrico utilizadas por
las plantas se basan en: a) aumentar la actividad y concentración de los antiporter
Na+/H+ en las membranas plasmáticas de las células de la raíz (exportación de sodio)
y en los tonoplastos del mesófilo y de otras células (compartimentación de sodio); b)
controlar la expresión, actividad y propiedades de discriminación de iones de los
sistemas de transporte de potasio (y posiblemente la actividad de las acuoporinas); c)
contrarrestar el daño fotoinhibitorio mediante ajuste osmótico inducido por la
acumulación de metabolitos; d) proteger las enzimas responsables de reacciones
metabólicas críticas, los complejos proteicos y las estructuras de las membranas,
incrementando la capacidad de detoxificación de radicales hidroxilos.
La transparencia 21 ilustra la variación de los distintos componentes que participan del
ajuste osmótico en una célula del mesófilo de espinaca sometida a estrés salino. Los
iones de sodio y cloro, cuyo incremento puede interrumpir el metabolismo celular a
nivel citoplasmático, son concentrados en la vacuola. Al mismo tiempo, aumentan las
concentraciones de solutos compatibles (en este caso ejemplificados por glicinabetaína) en el citoplasma y en los cloroplastos (no se muestra en la figura), pero no en
la vacuola.
Solutos compatibles
Transparencias 22-25
La tabla de la transparencia 23 enumera ejemplos de compuestos que participan de
las respuestas metabólicas desarrolladas por las plantas para sobrevivir al déficit de
agua. A pesar de que no existe un modelo único para explicar la regulación génica
inducida por el estrés hídrico y salino, la evidencia disponible indica que todas las
plantas responden a los mismos con mecanismos similares. Sin embargo, existen
diferencias especie-específicas que determinan como las señales de estrés son
procesadas.
Los solutos compatibles, también conocidos como osmolitos compatibles, son un
grupo de compuestos orgánicos altamente solubles que, aún en altas concentraciones,
no interfieren con el metabolismo celular. Como se muestra en la transparencia 24,
sus estructuras químicas pueden ser muy diversas. La síntesis y acumulación de
osmolitos orgánicos es un mecanismo ampliamente distribuidos en las plantas, pero el
perfil de solutos compatibles varía en cada especie vegetal. Por ejemplo, el
aminoácido prolina es acumulado por plantas de distintos grupos taxonómicos,
mientras que la acumulación de -alanina-betaína parece estar confinada a unos
pocos representantes de la familia Plumbaginaceae. Un mecanismo utilizado por las
plantas para incrementar las concentraciones de solutos compatibles es la síntesis
irreversible de compuestos tales como glicina-betaína. Las concentraciones de otros
solutos compatibles (por ejemplo, prolina) son mantenidos mediante el balance entre
la síntesis y el catabolismo. Algunos azúcares monoméricos (por ejemplo, glucosa y
fructosa) pueden ser liberados de formas poliméricas (almidón y fructanos,
respectivamente) en respuesta a estrés. Una vez que el estrés se extingue, estos
monómeros pueden ser re-polimerizados. Este proceso facilita el ajuste osmótico
rápido y reversible.
Los solutos compatibles no perturban la capa de hidratación de las macromoléculas.
La transparencia 25 muestra el esquema de una proteína con su correspondiente capa
de hidratación, la que está compuesta por un arreglo ordenado de moléculas de agua.
Los iones como Na+ y Cl- pueden penetrar en la capa de hidratación e interferir con las
uniones no covalentes que determinan la estructura terciaria de la proteína. Por el
contrario, los solutos compatibles como glicina betaína y prolina, no penetran en la
capa de hidratación, por lo que la proteína y el soluto no entran en contacto directo.
Estrategias para aislar genes de resistencia a estreses abióticos
Transparencias 26-38
El desarrollo de una estrategia básica para introducir en un cultivo no tolerante la
capacidad de responder a un estrés particular comprende seis pasos fundamentales.
La transparencia 28 muestra un esquema de estos pasos, los cuales incluyen desde el
aislamiento y caracterización de un organismo naturalmente tolerante al estrés en
cuestión, hasta el desarrollo de una planta transgénica que exhibe mayor tolerancia.
Sin embargo, aún deben superarse muchas limitaciones para expresar correctamente
un gen foráneo en plantas superiores. Los problemas a resolver incluyen el desarrollo
de técnicas adecuadas de transformación genética, la expresión del transgen en el
momento y en el tejido apropiado, el procesamiento post-traduccional correcto de las
proteínas recombinantes, la disponibilidad de precursores, la presencia de inhibidores
ambientales, y la degradación de las nuevas proteínas por resultar tóxicas o ser
sustrato de enzimas presentes en la planta transformada.
La aplicación de técnicas de genómica funcional facilita el aislamiento y la
caracterización de genes de respuesta a estrés. El uso de microordenamientos de
ADN permite examinar el estado de la expresión génica de una planta en situaciones
de estrés y en situaciones control, y determinar qué genes se expresan de forma
diferencial. La transparencia 31 muestra un ejemplo en que se analiza la expresión
genética de Arabidopsis thaliana bajo estrés de frío. Para ello, se preparó una sonda
de ADN marcada con Cy5-dUTP (un compuesto fluorescente) por transcripción
reversa de ARNm de plantas no estresadas. En forma similar, se preparó una segunda
sonda marcada con Cy3-dUTP (un compuesto fluorescente distinto) a partir de plantas
estresadas durante 2 h a baja temperatura. Luego de hibridar simultáneamente con
ambas sondas un microordenamiento conteniendo 1.300 genes de Arabidopsis, se
generó una imagen en color falso. Los genes inducidos o reprimidos luego del estrés a
frío están representados como señales rojas y verdes, respectivamente. Los puntos
amarillos representan genes cuya expresión es la misma entre el tratamiento frío y el
control. La intensidad de la fluorescencia en cada punto es proporcional a la expresión
absoluta de cada gen. Se muestran los puntos correspondientes al gen inducible por
frío rd29A (responsive to dehidratation). Se incluye un control interno de -tubulina de
Arabidopsis (no inducible por frío) y un control negativo de la subunidad  del receptor
nicotínico de acetilcolina de ratón (nAChRE).
Las transparencias 32 y 33 muestran resultados del trabajo presentado anteriormente.
Se sometieron plantas a diferentes estreses abióticos y se analizó el estado de la
expresión génica utilizando microordenamientos que contenían 7.000 secuencias de
A. thaliana. El análisis de los datos obtenidos permitió realizar una clasificación de
genes inducibles o reprimibles por frío, sequía y salinidad. Se indica el número de
genes cuya inducción o represión es mayor de cinco veces para un determinado
estrés y menor de cinco veces para los restantes. Los números entre paréntesis en el
panel de la izquierda indican el número de genes cuya inducción es mayor de cinco
veces para un determinado estrés y menor de tres veces para los restantes. Las
intersecciones entre los círculos representan los genes inducibles o reprimibles por
más de un estrés. La intersección central representa los genes simultáneamente
inducibles o reprimibles por los tres estreses. Los genes candidatos identificados
mediante el análisis de microordenamientos deben ser analizados mediante análisis
de Northern blot para eliminar falsos positivos y corroborar su inducción ante un
determinado estrés. La transparencia 33 muestra un análisis de este tipo en que se
observa la evolución temporal de la transcripción de genes representativos para cada
uno de los estreses analizados. Los resultados del análisis muestran que los genes
estudiados sólo son inducidos por un tipo de estrés particular (paneles superiores).
Como control se utilizó un gen de expresión constitutiva (panel de abajo)
La transparencia 34 muestra otros resultados obtenidos en el mismo trabajo. Las
técnicas de genómica funcional permiten también determinar qué genes se inducen
por la acción de determinados factores de transcripción. En la transparencia se
muestra el esquema usado para identificar genes inducidos por el factor de
transcripción DREB1A. El mismo fue expresado en plantas transgénicas de A. thaliana
utilizando el promotor constitutivo 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV). Los pasos
seguidos en el esquema fueron los siguientes: a) se prepararon sondas de ADNc
marcadas con Cy3-dUTP o Cy5-dUTP a partir de ARNm de plantas sometidas a
tratamientos de estrés (frío o sequía) y no estresadas. Las sondas se usaron para
hibridar microordenamientos de ADN. Debido a que su nivel de expresión no varía en
condiciones de estrés, el gen de -tubulina se utilizó como control interno. Los genes
con tasas de expresión frío/control o sequía/control mayores que 2 se consideraron
genes inducibles por frío y sequía respectivamente; b) se prepararon sondas de ADNc
marcadas con Cy3-dUTP y Cy5-dUTP a partir de ARNm de plantas transformadas con
una construcción 35S:DREB1A y no transformadas (NT). Los genes con tasas de
expresión 35S:DREB1A/NT mayores que 2 se consideraron inducibles por DREB1A.
Los genes inducibles por sequía o frío identificados fueron clasificados en 3 grupos
(transparencia 35): a) genes inducibles por sequía y frío; b) genes inducibles sólo por
sequía y, c) genes inducibles sólo por frío. A su vez, los genes inducibles por frío y
sequía fueron clasificados en dos grupos: los que son blancos de la acción de
DREB1A (12 genes) y los que no son inducibles por este gen (4 genes).
Las transparencias 36 a 38 comentan la utilización de plantas modelo en el estudio de
los mecanismos responsables de las respuestas a deshidratación (plantas
poiquilohidricas) y salinidad (plantas halofilas). Las dos plantas que se muestran en
estas transparencias, Craterostigma plantagineum y Thellungiella halophila ha sido
propuestas con este fin.
Ejemplos de tolerancia a estreses abióticos. Solutos compatibles
Transparencias 39-51
Una estrategia posible para incrementar la tolerancia al estrés hídrico y salino es
incrementar la concentración de un soluto compatible en el citoplasma. En el trabajo
que se presenta en la transparencia 40 se expresó en plantas de tabaco el gen mtlD,
que codifica la manitol 1-fosfato deshidrogenasa de E. coli, en forma constitutiva. Esta
enzima cataliza la reacción que sintetiza manitol 1-fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
El manitol se produce por acción de una fosfatasa no específica. El gen mtlD se puso
bajo la dirección del promotor 35S del CaMV. Las plantas transgénicas se sometieron
a ensayos de crecimiento en medios de alta concentración salina y se evaluó la altura
de la parte aérea y el peso fresco de las plantas respecto del de los controles no
transgénicos. Como se muestra en la transparencia 30, las plantas transgénicas
toleran mayores niveles de salinidad.
La transparencia 41 muestra resultados del trabajo comentado anteriormente. El panel
izquierdo muestra plantas de tabaco transgénicas que acumulan manitol (T) y plantas
control (NT) luego de 30 d de crecimiento en medio de cultivo conteniendo 250 mM de
ClNa. En la imagen de la derecha se muestran raíces de plantas de tabaco que
acumulan manitol (T) y de plantas control (NT) a los 30 d de crecimiento en medio con
y sin 250 mM de ClNa. Las raíces de ambas plantas no difieren en tamaño cuando se
las cultiva sin ClNa, pero es notable la diferencia cuando se crecen en 250 mM de
ClNa.
El estudio comparado de la ruta de síntesis de inositol permite comprender algunas de
las estrategias adaptativas utilizadas por las plantas halófilas en respuesta al estrés
hídrico. Esta vía, por la que el inositol deriva a partir de glucosa 6-fosfato, es la fuente
de compuestos esenciales para la biosíntesis de fosfolípidos de membrana,
fosfoinositósidos, fitatos, galactinol, resinas de paredes celulares, mucílagos y
glicoproteínas. El myo-inositol y sus estereoisómeros pueden ser metilados para
formar una variedad de productos tales como D-ononitol y D-pinitol. En varias familias
de especies tolerantes al estrés hídrico o salino, como los manglares, los pinos y
algunas legumbres, esta ruta se extiende mediante la actividad de enzimas de
epimerización o metilación, lo que conduce a la acumulación de inositoles metilados.
La transparencia 42 compara las rutas de síntesis de la especie halófila
Mesembryanthemun crystallinum (“Planta del Hielo”) y de la especie glicófila (no
tolerante a salinidad) A. thaliana. La regulación diferencial de las mismas define la
tolerancia o la sensibilidad frente al estrés salino. En M. crystallinum, las condiciones
de estrés inducen la activación transcripcional del gen de la myo-inositol Ometiltransferasa (imt1), conduciendo así a la síntesis de D-pinitol. El gen que codifica
la primera enzima de esta vía, la inositol 1-fosfato sintetasa, es también inducido
(inps1). Como consecuencia, la concentración de myo-inositol se incrementa, y el
producto final, D-pinitol, se acumula a niveles osmóticamente significativos. En
Arabidopsis no se observa inducción del gen inps1 ni incremento significativo de mioinositol. Los genes que codifican las enzimas que podrían extender la vía para producir
D-pinitol parecen estar ausentes en esta especie.
La transparencia 43 muestra los resultados de un trabajo en que se transformaron
plantas de N. tabacum con el gen de imt1 de M. crystallinum. Se mantuvieron plantas
transgénicas (I5A) y control (SR1) en ausencia de riego durante 8 d y se midió en las
mismas la acumulación de myo-inositol y D-ononitol. Para realizar los ensayos se
utilizaron hojas jóvenes de la misma edad obtenidas de ambas líneas. Las hojas
poseían inicialmente el 10% del tamaño de una hoja madura y se expandían hasta
alcanzar un 30-50% de este tamaño durante el período de estrés. Como se observa en
la transparencia, al acentuarse las condiciones de estrés, la concentración de myoinosital baja tanto en las plantas transgénicas como las control (panel izquierdo). Sin
embargo, mientras la línea control no produce D-ononitol, la concentración de este
compuesto sube consistentemente en la línea transgénica. Las plantas I5A mostraron
una diferencia significativa en su comportamiento en condiciones de estrés salino con
respecto a las no transformadas. Las transgénicas mantuvieron una tasa de
fotosíntesis más alta. Todas las plantas se recuperaron de las condiciones sometidas
en los experimentos cuando el estrés fue removido. Por otro lado, 8 de 10 plantas SR1
contenían áreas no turgentes en sus hojas, las cuales eventualmente se tornaron
necróticas.
La glicina-betaína es un soluto compatible que se sintetiza por distintas rutas en
diferentes organismos. En el esquema de la transparencia 44 se muestran las rutas
presentes en plantas superiores, en E. coli y en Arthrobacter globiformis. Todas ellas
utilizan como precursor a colina y conducen a glicina-betaína por reacciones de
oxidación o reducción en que intervienen la colina monooxigenasa, la colina oxidasa,
la colina deshidrogenasa y la betaína aldehído deshidrogenasa. Por otra parte, se ha
descrito la producción de glicina-betaína por una vía diferente en dos microorganismos
halófilos extremos, Actinopolyspora halophilia y Ectothiorhodospira halochocloris. En
estos microorganismos la glicina-betaína se produce realizando metilaciones
sucesivas en el grupo amino del aminoácido glicina. Dichas reacciones son
catalizadas por dos enzimas, la glicina sarcosina metiltransferasa y la sarcosina
dimetiltransferasa.
Siguiendo una estrategia similar a la desarrollada para lograr acumulación de manitol o
myo-inositol, se realizaron trabajos para acumular glicina-betaína en plantas de A.
thaliana. Con este fin, se sobrexpresó el gen de la colina oxidasa de A. globiformis en
plantas transgénicas. En la construcción genética utilizada, el transgén fue puesto bajo
la dirección del promotor de 35S de CaMV. Además, se agregó a la secuencia del
transgen una secuencia señal para acumular el producto génico en los cloroplastos. La
transparencia 45 muestra un esquema de la construcción utilizada y los datos de
concentración de glicina-betaína en plantas control no transformadas y en tres líneas
transgénicas. Los datos obtenidos son el resultado del promedio de tres experimentos
independientes.
La transparencia 46 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Se
hicieron germinar semillas de plantas controles y de líneas transgénicas en placas
suplementadas con varias concentraciones de ClNa. Luego de incubar por 2 d a 0oC,
las placas se incubaron a 22oC para permitir la germinación y el crecimiento de
plántulas. A los 5 d de transferir las semillas a 22oC, se midió la altura total de las
plantas desde el tope de la parte aérea hasta la punta de la raíz. Los resultados que se
presentan en la tabla muestran que a 100 mM de ClNa (destacado en rojo), la tasa de
crecimiento de las plantas control fue menor que la de las tres líneas transgénicas. A
200 mM de ClNa, las plantas transformadas crecieron más lentamente, mientras que
ninguna de las plantas controles creció en estas condiciones. En la imagen de la
izquierda, se muestran los efectos del estrés salino sobre el crecimiento de las
plántulas después de la germinación. Se germinaron semillas de la línea transgénica 1
y de plantas controles en medio MS suplementado con 100 mM de ClNa, y se permitió
que las raíces y los cotiledones se desarrollaran por 20 d más. En las plantas
controles, el crecimiento cesó a los 10 d y las hojas se tornaron blancas. Por el
contrario, las plantas transgénicas se mantuvieron verdes y continuaron creciendo. El
desarrollo de las raíces de las plantas transgénicas fue marcadamente más eficiente
que las de las plantas controles. En ausencia de ClNa, las líneas transgénicas y
controles tuvieron la misma tasa de crecimiento.
La transparencia 47 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las
plantas transgénicas fueron cultivadas en medio hidropónico durante 30 d. Las plantas
transgénicas y las controles se transfirieron a medio suplementado con 200 mM de
ClNa y se las incubó durante 10 d adicionales con luz. Bajo estas condiciones, las
hojas y flores de las plantas controles se tornaron blancas y las plantas murieron. En
contraste, las plantas transformadas no exhibieron daños en hojas y flores y
sobrevivieron, aunque su tasa de crecimiento y de desarrollo fue menor que en el
medio que no contenía ClNa.
La transparencia 48 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las
plantas transformadas con el gen codA fueron sometidas a un ensayo de estrés por
baja temperatura. Se cultivaron plantas transgénicas y controles no transgénicas
durante 30 d en hidroponía y se las incubó luego a 5oC bajo luz continua durante 7 d.
Luego de un período de incubación de 2 d a 22ºC, las hojas de las plantas controles
comenzaron a marchitarse y a desarrollar clorosis, mientras que las transgénicas no
registraron daños aparentes frente a este tratamiento.
La transparencia 49 muestra un ensayo de comportamiento a altas temperaturas de
plantas de A. thaliana transformadas por el gen codA de A. globiformis. Las semillas
fueron imbibidas durante 1 h a 22, 40, 50 y 55oC y luego sembradas en placas. Luego
de incubarlas a 4oC por 2 d, las semillas fueron mantenidas a 22oC por 3 d. Como
puede observarse en las fotografías, cuando las semillas no transgénicas fueron
expuestas durante 60 min a 40ºC, sólo un 50% germinó, mientras que en el caso de la
línea transgénica todas lo hicieron. Luego de la imbibición de 60 min a 50ºC, sólo un
10% de las semillas no transgénicas germinaron y las plántulas resultantes
presentaron un fenotipo anormal. En contraste, un 70% de las semillas transgénicas
germinaron y las plántulas presentaron un fenotipo normal. Luego de la imbibición de
60 min a 55ºC, ninguna semilla no transgénica germinó, mientras que un 30% de las
transgénicas lo hizo exitosamente.
Se han transformado plantas de varias especies con diferentes construcciones
genéticas que les permiten acumular glicina-betaína (transparencia 50). Todas ellas
acumulan este compuesto y exhiben aumentos de tolerancia a varios tipos de estrés.
Sin embargo, las concentraciones de glicina-betaína observadas en las plantas
transgénicas son generalmente bajas (<5 mol g-1 de peso fresco), comparadas con
las observadas en las plantas de especies que normalmente acumulan este
compuesto bajo condiciones de estrés (4-40 mol g-1 de peso fresco). Ello podría
sugerir que glicina-betaína ejerce su rol protector por más de un mecanismo. Se han
identificado dos factores importantes que limitan la acumulación de glicina-betaína en
plantas transgénicas: la disponibilidad endógena de colina y el transporte de colina a
través de la envoltura de los cloroplastos.
La tabla de la transparencia 51 muestra casos de plantas transgénicas modificadas
para producir otros solutos compatibles y tolerancia frente a distintas formas de estrés.
Se muestran resultados obtenidos con distintos tipos de solutos:
Fructanos: Se transformaron plantas de tabaco con el gen sacB de levanosacarosa de
Bacillus subtilis. La levanosacarosa genera fructanos a partir de fructosa. Las plantas
de tabaco transformadas tuvieron una tasa de crecimiento 55% más rápido, un peso
fresco 33% más grande y un peso seco 59% mayor que las plantas no transformadas.
Bajo condiciones de sequía, las plantas transgénicas acumularon cerca de 7 veces
más fructanos que bajo condiciones control.
Manitol: Las plantas de tabaco y A. thaliana no contienen usualmente manitol. La
expresión constitutiva del gen mt1D de E. coli incrementó la tolerancia a alta salinidad.
Sin embargo, bajo condiciones control, las plantas de tabaco transgénicas que
acumulaban manitol fueron un 20-25% más pequeñas que las plantas no
transformadas. En condiciones de estrés salino (150 mM de ClNa), el peso seco de las
plantas controles se redujo en un 44%, pero no se observaron efectos en las plantas
transgénicas.
D-ononitol: Plantas de tabaco transformadas con el gen imt1 de M. crystallinum
acumularon hasta 35 mol/g de peso fresco cuando se las expusieron a estrés salino o
a sequía.
Prolina: La 1-pyrrolina-5-carboxilasa sintetasa (P5CS) es una enzima sujeta a
retroalimentación por prolina. La enzima mutante (P5CsF127A) de Vigna aconitifolia es
insensible a esa regulación, por lo que, en su presencia, puede acumularse hasta 2
veces más prolina que con la enzima no mutada. La presencia de niveles significativos
de prolina en plantas que expresaban el gen de la enzima mutada les permitió crecer
en medio que contenía hasta 200 mM de ClNa. Otra estrategia que ha sido explorada
consiste en expresar un ARN antisentido del gen de la prolina deshidrogenasa (antiproDH) de Arabidopsis, una enzima que cataliza la degradación de prolina. Las plantas
transgénicas de Arabidopsis transformadas con la construcción anti-proDH
acumularon niveles más altos de prolina que las plantas controles sin transformar. Las
plantas transgénicas mostraron un incremento en la tolerancia a estreses por frío (-7ºC
por 2 d) y por alta concentración salina (hasta 600 mM de ClNa).
Sorbitol: Se transformaron plantas de tabaco con el gen de la sorbitol-6-fosfato
deshidrogenasa (S6PDH) de manzana. Las plantas transgénicas acumularon entre 0,2
y 130 mol de sorbitol por g de tejido fresco. Las plantas que acumularon niveles de 2
a 3 mol/g de peso fresco presentaron fenotipos normales. Sin embargo, a mayores
niveles de sorbitol, se desarrollaron lesiones necróticas sobre las hojas, infertilidad, y/o
la incapacidad para regenerar raíces. En plantas de caqui expresando esta enzima se
detectó hasta 61,5 mol de sorbitol por g de tejido fresco. Bajo condiciones de
salinidad, la actividad fotosintética de las plantas transgénicas declinó menos que en
las plantas controles.
Trehalosa: La expresión del gen TPS1 (subunidad 1 de trehalosa-6-fosfato sintetasa)
de levaduras en tabaco permitió incrementar la tolerancia a estrés hídrico, pero las
plantas transgénicas mostraron una reducción del crecimiento de 30 a 50% respecto a
las controles. Los máximos niveles de trehalosa alcanzados fueron de 3,2 mg por g de
peso seco de tejido. Otros genes que se utilizaron para incrementar la síntesis de
trehalosa en plantas fueron los genes otsA y otsB (trehalosa-6-fosfato sintetasa y
trehalosa-6-fosfato fosfatasa respectivamente) de E. coli. Se detectaron muy bajos
niveles de trehalosa en hojas de tabaco transformadas. A pesar de que dichas plantas
fueron más tolerantes a la sequía que las controles, exhibieron cambios en la
morfología y acumularon niveles más altos de carbohidratos estructurales.
Ejemplos de tolerancia a estreses abióticos. Bombas de Na+/H+
Transparencias 52-55
Los efectos detrimentales de la salinidad sobre las plantas son una consecuencia de la
deficiencia de agua que resulta por las altas concentraciones de solutos en el suelo, y
de un estrés específico de Na+ resultado de la relación alterada K+/Na+ y de
concentraciones de Na+ que son dañinas para las plantas. La alteración en la relación
de iones en la planta es causada por un influjo de Na+ a través de vías que sirven para
la adquisición de K+. Las plantas que toleran la sal y crecen en ambientes salinos
tienen altos niveles de sal intracelular. Sin embargo, sus enzimas son muy sensibles a
la sal, por lo que se sugiere que estas plantas son capaces de mantener baja
concentraciones de Na+ a nivel del citoplasma. Las plantas pueden utilizar tres
estrategias para regular la concentración de Na+: a) exclusión de sodio; b)
compartimentación de sodio y c) secreción de sodio (transparencia 53). El transporte
de Na+ fuera de la célula puede ser llevado a cabo por la operación de bombas de
Na+/H+ unidas a la membrana plasmática. Una bomba de Na+/H+ de A. thaliana, la
proteína SOS1, ha sido ya caracterizada. Asimismo, los mecanismos de transporte a
nivel del tonoplasto pueden transferir iones perjudiciales del citoplasma a la vacuola. El
estrés por alta concentración de Na+ da lugar a una señal mediada por Ca2+ que es
censada por la proteína SOS3. Esta proteína interacciona con SOS2 y ello activa el
complejo de quinasas SOS3-SOS2, el que a su vez estimula a la bomba SOS1 de
intercambio Na+/H+ y regula la expresión de distintos genes a nivel transcripcional y
postranscripcional. El complejo SOS3-SOS2 puede también estimular o suprimir las
actividades de otros transportadores involucrados en la homeostasis de iones bajo
condiciones de estrés, tales como H+-ATPasas y pirofosfatasas (PPasas) vacuolares,
la bomba vacuolar Na+/H+ (NXH) y las bombas de Na+ y K+ de la membrana
plasmática.
La transparencia 54 muestra experimentos realizados para desarrollar tolerancia a
salinidad en plantas de tomate transformadas con el gen nhx1 de Arabidopsis, el que
codifica una bomba vacuolar de Na+/H+. Con anterioridad, se había observado que la
sobrexpresión de este gen incrementaba la tolerancia a salinidad en plantas de
Arabidopsis. El gen nhx1 se introdujo en tomate (Lycopersicon esculentum c.v.
Moneymaker) mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens bajo
la regulación de un promotor constitutivo. Los ensayos en alta concentración salina se
realizaron con una línea control no transgénica y dos líneas transgénicas
independientes, que fueron cultivadas en hidroponía. Se cultivaron 60 plantas
independientes por cada línea en medio conteniendo 5 mM ó 200 mM de ClNa. A los 3
meses, se colectaron hojas maduras y en desarrollo, raíces y frutos. Los frutos se
recolectaron en el estadío de maduración verde/rojo, y luego se dejaron madurar por
una semana más hasta el momento del análisis. Se midieron los niveles de Na+, K+,
Cl-, azúcar y prolina en cada muestra. La mayoría de las plantas control murieron en
medio conteniendo 200 mM de ClNa y las que sobrevivieron crecieron muy poco (C).
En cambio, las plantas transgénicas (D) crecieron, florecieron y dieron frutos
normalmente. Las plantas control como las transgénicas se desarrollaron en forma
similar en medio conteniendo 5 mM de ClNa (A y B, respectivamente). A altos niveles
de sal, los frutos de las plantas transgénicas resultaron ligeramente más pequeños. No
se encontraron diferencias significativas en el contenido de agua ni de sólidos
solubles.
Siguiendo la misma estrategia usada en la transparencia 54, se transformaron plantas
de Brassica napus con el gen Atnhx1 de Arabidopsis. Las plantas fueron capaces de
creer, florecer y producir semillas en presencia de 200 mM de ClNa. Las plantas
acumularon sodio hasta un 6% de su peso seco, aunque las semillas y la calidad del
aceite no fue afectada por la salinidad del suelo. La sobrexpresión de este gen no
afectó el crecimiento de las plantas, ya que en 10 mM de ClNa no se observaron
diferencias en su crecimiento respecto de las plantas controles. La transparencia 55
muestra plantas de tres líneas transgénicas con niveles decrecientes en la expresión
del gen y de una línea control no transformada. En medio con alta concentración de
sal, el crecimiento de las plantas transgénicas se correlacionó con los niveles de
expresión de la proteína AtNHX1.
Tolerancia a estreses abióticos. Sobrexpresión de citoquininas
Transparencias 56-60
Una de las consecuencias del estrés hídrico es la inducción de los mecanismos de
senescencia, lo que trae como consecuencia la floración precoz y la modificación de la
relación fuente/sumidero. El retraso de la senescencia inducida por el estrés puede
proveer mecanismos de supervivencia mediante la activación de mecanismos de
evasión (regulación del turn-over proteico, eficiencia en el uso de agua, consumo de
nutrientes de almacenamiento, retraso de la floración inducida por estrés). Una
estrategia muy interesante para desarrollar tolerancia a estreses de tipo hídrico
consiste en incrementar la síntesis de citoquininas en forma concomitante a la
aparición del estrés.
Para lograr esto, se han transformado plantas con construcciones que contienen la
secuencia de la enzima isopentenil transferasa (una enzima clave en la ruta de
síntesis de citoquininas) bajo un promotor inducible por senescencia. En el caso que
se ilustra en las transparencias 57 a 60, el promotor utilizado con este fin corresponde
al del gen de un receptor de quinasa asociado a senescencia (SARK) aislado a partir
de un screening de genes asociados a este proceso en Phaseolus vulgaris. Este
promotor se activa al inicio del proceso de senescencia. En consecuencia, el
incremento en el nivel de citoquininas sólo se produce como respuesta al estímulo y
no se observan efectos en condiciones normales.
Las plantas transformadas con esta construcción evidencian una notable tolerancia al
proceso de marchitamiento por falta de riego. En condiciones en que las plantas
control no transformadas se marchitan en forma irreversible, las plantas transgenicas
mantienen un nivel de agua superior y son capaces de recuperar su turgencia normal
cuando el riego es restituido (transparencia 58). Además, estas plantas pueden crecer
en condiciones similares a las normales en condiciones de riego equivalentes al 30%
del riego óptimo. En estas condiciones, el crecimiento de las plantas control se
encuentra considerablemente afectado (transparencia 59). En condiciones de
ausencia y restitución del riego, las plantas transgenicas desarrollar mayor biomasa,
número y peso de semillas que las plantas control (transparencia 60). Los ensayos
realizados en condiciones de campo con este tipo de plantas muestran que el
rendimiento en semillas y biomasa es superior al de las plantas control en condiciones
en las condiciones de disponibilidad de agua normales. Esto hace que el fenotipo de
tolerancia obtenido en este caso pueda considerarse con más propiedad como un
fenotipo de mayor rendimiento. Esta estrategia encierra pues grandes promesas no
sólo por el desempeño de las plantas modificadas en condiciones de estrés, sino
también para los períodos de crecimiento normal y puede tener un alto impacto en el
incremento de la productividad de los cultivos.
Tolerancia a estreses abióticos. Expresión de factores de transcripción
Transparencias 61-64
Un posible enfoque para generar tolerancia a estreses abióticos se basa en la
expresión (constitutiva o inducible) de factores de transcripción involucrados en las
respuestas de tolerancia. Esta estrategia tiene la ventaja de que, si se expresa el
factor apropiado, se puede controlar la expresión de todos aquellos genes que
dependen de él, aún cuando dichos genes y sus funciones sean en su mayor parte
desconocidos. Esto permite inducir respuestas de tipo multigénico sin necesidad de
realizar transformaciones. Como los factores de transcripción asociados a la tolerancia
a estreses están en general inducidos por la presencia del estrés, una alternativa
atractiva es sobrexpresarlos bajo la dirección de sus propios promotores. Por el
contrario, la expresión bajo promotores de tipo constitutivo puede conducir a fenotipos
alterados que son incompatibles con una aplicación agronómica.
Las transparencias 62-64 muestran una serie de ensayos realizados con plantas de A.
thaliana transformadas con el factor de transcripción Hahb-4, que pertenece a la
familia Hd-Zip. La secuencia correspondiente al transgen fue aislada de plantas de
girasol y, en este caso, es dirigida por el promotor 35S de CaMV. Como puede
observarse en las transparencias, las plantas transgenicas evidencian un alto grado de
tolerancia a condiciones de ausencia de irrigación. En otros trabajos realizados con
este mismo factor de transcripción, la secuencia transgénica fue clonada bajo su
propio promotor (inducible por estrés hídrico y salino). En este caso los fenotipos
obtenidos resultaron indistinguibles de los controles.
Ejemplos de tolerancia a estreses abióticos. Proteínas LEA
Transparencias 65-66
Las proteínas LEA (late embryo-genesis abundant) son un grupo de proteínas que se
acumulan en el embrión en un estadío tardío del desarrollo de la semilla. La expresión
de estas proteínas se ha correlacionado también con condiciones de estrés fisiológico
y ambiental. Un gran número de evidencias apoyan la hipótesis de que las proteínas
LEA pueden tener un rol protector en las células bajo condiciones extremas de estrés.
La transparencia 66 muestra líneas transgénicas de arroz transformadas con gen
hva1, el que codifica una proteína LEA de cebada. La secuencia del transgen se puso
bajo la dirección del promotor de actina de arroz. Las plantas control no transgénica
(NT) y dos líneas transgénicas distintas fueron sometidas a tres ciclos consecutivos de
estrés hídrico de 7 d cada uno, consistentes en 5 d sin riego seguidos por 2 d con
riego. Se observaron altos niveles de la proteína HVA1 acumulada en hojas y raíces
de las plantas transgénicas. Las mismas exhibieron mayor crecimiento de hojas y
raíces en condiciones de estrés. La segunda generación de plantas de arroz mostró un
incremento significativo en la tolerancia al déficit de agua y a salinidad.
Tolerancia a estreses abióticos. Citrato sintetasa
Transparencias 67-73
Los suelos ácidos y con alta concentración de aluminio resultan tóxicos para las
raíces, las cuales no son capaces de desarrollarse y absorber los nutrientes
disponibles. Este es un problema común en las agriculturas tropicales y por lo tanto
afecta los cultivos de muchos países no desarrollados. El exudado de ácidos
orgánicos como el citrato, conduce a la quelación del aluminio y produce tolerancia al
mismo. Las transparencias 68 a 70 muestran los resultados de una investigación
hecha en México en que se sobrexpresó un gen involucrado en la síntesis de citrato.
Se transformaron plantas de N. tabacum con el gen de citrato sintetasa (csb) de la
bacteria Pseudomonas aeruginosa dirigido por el promotor 35S de CaMV. Se
cuantificaron los niveles de citrato en la planta y en el exudado de las raíces, tanto en
raíces transgénicas como en controles sin transformar. Las plantas transformadas
exhibían aumentos de hasta 10 veces en el nivel de citrato de sus raíces y, en algunos
casos, cuadriplicaron la liberación de citrato respecto de las controles (ver tabla). Las
plantas transformadas fueron capaces de tolerar altas concentraciones de aluminio.
La transparencia 69 muestra resultados del trabajo comentado. Se evaluó la inhibición
del crecimiento en las raíces, utilizando medios complementados con diferentes
concentraciones de aluminio en 3 experimentos independientes en los que se
incluyeron 100 plántulas de cada línea. Se observaron diferencias significativas entre
las plantas controles y las transgénicas. En las imágenes que se muestran en la
transparencia se observa el resultado del crecimiento de líneas transgénicas y
controles que fueron germinadas en medio conteniendo aluminio y la detección de la
asimilación de aluminio en las raíces respectivas.
La misma construcción utilizada en las plantas de tabaco fue utilizada para obtener
plantas transgénicas de papaya (Carica papaya). No se observó desarrollo de raíces
en las plantas controles cultivadas en concentraciones de 50 M o más altas de
aluminio. Por el contrario, las transgénicas crecieron normalmente en concentraciones
de hasta 300 M de aluminio. En la imagen que se muestra en la transparencia 70 se
puede observar la diferencia entre el desarrollo de una planta transformada con el gen
csb (izquierda) y una planta control (derecha) crecidas en medio que contiene 300 M
de aluminio.
El fósforo (P) es un nutriente esencial para el crecimiento, desarrollo y reproducción de
la planta. El P es extremadamente reactivo y sólo está disponible para su absorción
por la planta en un estrecho rango de valores de pH del suelo. En suelos ácidos, el P
forma moléculas de baja solubilidad con hierro y aluminio, mientras que en suelos
alcalinos, se combina eficientemente con calcio y magnesio para formar compuestos
fosforados poco solubles. En respuesta a condiciones limitantes de P, algunas plantas
sufren adaptaciones fisiológicas y de desarrollo, tales como cambios en la arquitectura
de las raíces, inducción de genes que codifican transportadores de P de alta afinidad,
acidificación de la rizosfera y exudado de ácidos orgánicos por parte de las raíces. Los
datos que se muestran en las transparencias 71 a73 corresponden a un trabajo del
mismo laboratorio en que se utilizaron plantas transgénicas que expresan el gen de la
citrato sintetasa de P. aeruginosa (csb) para determinar su capacidad de crecimiento
en suelos pobres en P. La construcción genética utilizada es análoga a la del caso
anterior. La tabla de la transparencia 71 muestra que tanto la actividad de la citrato
sintetasa como la proporción de citrato en los exudados radiculares se incrementa en
líneas transgénicas (CSb-4 y CSb-18) respecto de las plantas control (1522). Las
plantas que expresan citrato sintetasa fueron capaces de solubilizar y absorber P
inmovilizado en suelos alcalinos. En la transparencia 72 se muestra el resultado de los
ensayos realizados para establecer el patrón de crecimiento y la productividad de
líneas de tabaco CSb sometidas a distintos tratamientos de P. Se cultivaron plantas
transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y control (1522) en suelo alcalino estéril de bajo
contenido de P, con o sin agregado de P. En los experimentos G y H las plantas
fueron inoculadas con micorrizas Glomus fasciculatum. Se ha propuesto que el
incremento en la absorción de P por excreción de ácido orgánico puede ser mediada
por dos mecanismos: a) acidificación de la rizosfera que conduce a una más alta
solubilización del P y, b) reducción en las concentraciones de Ca2+ libre por la
formación de citrato de calcio. No se detectaron diferencias significativas en la
capacidad de acidificación de la rizosfera entre las plantas CSb y las controles. Las
plantas fueron fotografiadas luego de 4 meses en el invernáculo. Se cultivaron plantas
transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y control (1522) en medio (pH 8,0) suplementado con
1 mM de ácido cítrico o sin suplementar (transparencia 73). Los suplementos soluble e
insoluble de fosfato (PO4H2Na y Ca10(PO4)6(OH)2, respectivamente) se ajustaron a 1
mM. Las plántulas se cosecharon a los 15 d y se determinó su peso seco. Los datos
son el promedio de tres experimentos independientes. Como puede observarse,
cuando se agrega ácido cítrico al medio, no existe diferencia en la acumulación de
biomasa entre plantas transgénicas y control. Estos resultados demuestran que el
citrato es capaz de disolver compuestos insolubles de P y que las diferencias
observadas en la acumulación de biomasa entre plantas controles y transgénicas se
deben al aumento en la capacidad de éstas últimas para utilizar P insoluble.
La transparencia 55 enumera una serie de genes que han sido utilizados para
introducir tolerancia a distintos estreses abióticos en plantas. Algunos de los trabajos
correspondientes han sido utilizados como ejemplos en esta clase. Se recomienda leer
las revisiones citadas en Referencias para mayor información sobre otros casos.