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COMUNICACIONES LIBRES | GGM. GENÓMICA Y GENÉTICA MOLECULAR
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IDENTIFICACIÓN DE VACAS POLLED
HEREFORD PORTADORAS DE MSUD
C248>T MEDIANTE PCR-HRM Y
CONFIRMACIÓN POR SECUENCIACIÓN
GENES RELACIONADOS CON LA
RESISTENCIA A INSECTICIDAS EN EL
VECTOR DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Triatoma infestans
La enfermedad de la orina con olor a jarabe de
Maple (MSUD, OMIA 000627-9913) es autosómica
recesiva y causada por una mutación sin sentido
(C248>T) en la región líder del gen de la subunidad
E1 alfa (BCKDHA, cadena ramificada alfa ceto-ácido
deshidrogenasa). Para identificar esta mutación en una
población de 86 vacas Polled Hereford de un predio de
la región Este de Uruguay se realizó el análisis HRM
(High Resolution Melting) utilizando PCR en tiempo
real (Rotor-Gene Q, Corbett) con el intercalante
fluorescente EvaGreen (kit Type-it® HRM-PCR,
QIAGEN, Hilden, Alemania), utilizando un par de
primers específicos. El programa de ciclado consistió
en una desnaturalización inicial de 10 min de 95 ºC,
40 ciclos de 10s a 95 ºC, 30s a 59 ºC y 10s a 72 ºC, en
un rango entre 65-95 ºC con incrementos de 0,1 ºC
durante 2s. Luego de la amplificación del fragmento
94 pb se normalizaron las lecturas de fluorescencia
utilizando el software Rotor Gene versión 1.7.28 que
permitió identificar las curvas de melting en la zona
estable de fluorescencia. Luego, se normalizó con
respecto a un control homocigota normal y el software
identificó el genotipo de cada muestra analizada con
un porcentaje de confianza >90%. La confirmación
del genotipado fue evaluada mediante secuenciación
de los productos amplificados por PCR. Se detectó
la presencia del alelo mutante recesivo para MSUD
C248>T en 3 vacas de la población analizada.
Con el propósito de investigar la participación de
los citocromos P450 en la resistencia a insecticidas
piretroides en Triatoma infestans se aisló ADN copia
(ADNc) de 3 genes citocromo P450 y del gen
NADPH citocromo P450 reductasa (CPR) que
codifica para una enzima que actúa en la transferencia
de electrones desde la forma reducida de NADPH
a los citocromos P450. A partir de las secuencias de
ADNc de esos genes se diseñaron primers específicos
y sondas Taqman para la determinación de su
expresión mediante la técnica de PCR en Tiempo
Real. Las determinaciones de expresión se llevaron
a cabo a partir de ARN total extraído de pooles de
cuerpo graso de los insectos en distintos intervalos
de tiempo después de la aplicación tópica de la
dosis letal 50% del principio activo deltametrina. La
expresión a nivel de transcripción de los tres genes
P450, revelaron que esa expresión fue inducida por
deltametrina en poblaciones resistentes y susceptibles.
Los niveles de ARNm del gen CPR analizados en
una colonia de laboratorio susceptible a deltametrina
también se incrementaron después de la aplicación
del insecticida. Por otra parte, el análisis comparativo
de la expresión de los genes P450 y del gen CPR en
insectos provenientes de diferentes poblaciones, reveló
sobre-expresión de uno de los genes P450 y del gen
CPR en la población que presentó el mayor grado
de resistencia al insecticida. Los resultados obtenidos
apoyarían la hipótesis que postula la participación de
los citocromo P450 en el desarrollo de la resistencia a
insecticidas piretroides en T. infestans.
Branda Sica A.1, A. Romero2, M.T. Federici1, C. Briano2, M. Dalla
Rizza1, F. Dutra2. 1Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas,
Uruguay. 2DILAVE Treinta y Tres, Uruguay.
Email: [email protected]
Grosso C.G.1, M.M. Stroppa1, B.A. García1. 1INICSA, CONICET y
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
Email: [email protected]
Journal of Basic & Applied Genetics | 2016 | Volumen 27 | Issue 1 | Supp.