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Rev Ins Nal Cancero 1996; Volumen 42 (4):181-187
Trabajo de investigación
Presencia de la proteína tardía del virus del papiloma
humano en tejido cervicouterino con lesiones de bajo y alto
grado de malignidad
Lucia G Taja Chayeb,*
Mauricio Salcedo Vargas,**
Alvaro R Osornio Vargas*
* División de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología. México.
** Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología, Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.
RESUMEN
Uno de los factores etiológicos más importantes involucrados en el cáncer cervicouterino
es el virus del papiloma humano, razón por la cual se ha estudiado ampliamente su
participación en esta neoplasia. Con el objetivo de detectar la infección lítica por este virus,
así como su distribución dentro del tejido cervicouterino, se analizaron 39 muestras de
lesiones cervicales: 13 lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (nueve tejidos
con condiloma y cuatro con neoplasia intraepitelial cervical grado I), 14 lesiones
intraepiteliales escamosas de alto grado (cinco con neoplasia intraepitelial cervical grado II
y nueve con carcinoma in situ) y 12 carcinomas invasores, mediante la técnica de
inmunohistoquímica con peroxidasa-antiperoxidasa, para identificar la proteína de cápside
viral. Se encontró la presencia del antígeno viral en ocho de nueve casos de condiloma y
disminuyó a dos de 12 en los cánceres invasores. Esto es similar a lo previamente
notificado en la literatura. Inesperadamente, se encontró la expresión de esta proteína en
células del estrato basal del epitelio, así como en células tumorales. Este tipo de hallazgos
no han sido consignados hasta el momento, y difiere de lo que se sabe en relación al tipo
de células en que puede ocurrir la infección lítica; también puede sugerir un nuevo
mecanismo viral de replicación diferente a los descritos. Con una técnica sencilla como la
inmunohistoquímica, es posible detectar rápidamente la infección lítica por este virus, así
como analizar la distribución viral en el epitelio infectado.
Palabras clave: Cáncer cervicouterino, virus del papiloma humano, antígeno tardío
común del virus del papiloma.
ABSTRACT
Human Papillomaviruses are one of the most important etiological factors involved in
cervical cancer, which have been widely studied in this neoplasia. In an effort to
demonstrate the presence of lytic infection and distribution of human papillomavirus, 39
lesions of the uterine-cervix were subjected to immunohistochemical analysis of the viral
capsid antigen: 13 low grade squamous intraepithelial lesions (9 condylomas, 4 cervical
intraepithelial neoplasia grade I), 14 high grade squamous intraepithelial lesions (5 cervical
intraepithelial neoplasia grade II, 9 in situ carcinoma) and 12 invasive carcinomas. We
found that the prevalence of viral capsid antigen decreased from 8 out of 9 cases in
condiloma to 2 out of 12 in invasive cancers, corresponding to previous reports.
Unexpectedly we found stained cells in basal layers of the epithelium as well as in tumour
cells, an observation that has not been reported before; this finding contradicts what has
been reported about what kind of cells support a lytic infection, but could also suggest a
new viral mechanism unknown so far. Immunological staining is the simplest technique for
positive identification of human papillomavirus infections, and also permits the analysis of
the distribution of the antigen in infected epithelia.
Key Words: Cervical carcinoma, human papillomavirus, viral capsid antigen
El carcinoma cervicouterino representa la neoplasia más frecuente en México y constituye
una de las principales causas de muerte por cáncer en el país. Ocurre con mayor
frecuencia en la etapa más productiva de la vida en la mujer (entre los 30 y 50 años de
edad), por lo que representa un serio problema socioeconómico y de salud nacional.1,2
Recientemente se ha observado que uno de los factores etiológicos más importantes que
se han asociado al desarrollo del carcinoma cervicouterino son los virus del papiloma
humano (VPH).3-7 En tumores cervicales, así como en líneas celulares derivadas de ellos
(por ejemplo HeLa, SiHa, etc.), se ha detectado su genoma y algunas proteínas virales
tempranas (E7). En ellos, el ADN viral se puede encontrar principalmente integrado al
genoma celular y ser transcripcionalmente activo.3,8,9 El genoma de VPH está constituido
por la región larga de control (LCR), la cual se encarga de regular los procesos de
replicación y transcripción virales; la región temprana que contiene a los genes E1-E7, los
cuales codifican para las proteínas que regulan tanto la replicación (E1) como la
transcripción viral (E2) y las oncoproteínas que participan en la transformación celular (E6 y
E7); y la región tardía, formada por los genes L1 y L2 que codifican para las proteínas de
cápside.10,11 La infección común por estos virus (epiteliotrópicos) se lleva a cabo en el
estrato basal proliferativo del epitelio, donde comienza la replicación viral (actividad propia
de los genes tempranos). Conforme la célula tiende a la diferenciación (tercios medio y
superior del epitelio), empieza a manifestarse la expresión de los genes tardíos del virus,
es decir, existe síntesis de proteínas de cápside conjuntamente con proteínas relacionadas
con la diferenciación del epitelio (por ejemplo las citoqueratinas),12,13 llevando a la aparición
de lesiones líticas (generación de partículas infectivas).
Los VPHs pueden ser identificados mediante diversas técnicas; entre ellas la de
inmunohistoquímica, la cual puede detectar algún antígeno viral. Uno de los más utilizados
es la detección del antígeno tardío común de los virus del papiloma (L1). Esta proteína
puede ser reconocida por un anticuerpo común, ya que todos los VPHs conocidos hasta la
fecha comparten varios determinantes antigénicos. La presencia de esta proteína indica
infección de tipo lítica, es decir, la presencia de viriones que son capaces de replicar su
genoma y ser envuelto por la cápside y de salir por medio de lisis celular e infectar otras
células (como partículas infectantes).14 Se ha encontrado que los tipos virales denominados
de bajo riesgo (por ejemplo, los tipos 6 y 11), por estar asociados generalmente con
lesiones benignas, son los que presentan este patrón de infección.8 En lesiones que han
sufrido transformación maligna, los virus (denominados de alto riesgo, como los tipos 16 y
18) pierden su integridad estructural al integrarse en el genoma de la célula huésped, paso
que es aparentemente importante durante el proceso de carcinogénesis inducida por
muchos virus; cuando este es el caso, es necesario el uso de técnicas tales como PCR o
hibridación in situ, que demuestren la presencia de los genomas virales en el tejido.15-17
Buscando la forma más simple para detectar partículas virales infectantes (es decir,
presencia de infección lítica) en tejido del cérvix, se propuso el objetivo de determinar
mediante inmunohistoquímica la presencia de la proteína tardía viral L1, así como su
distribución dentro del tejido cervicouterino normal o con diferentes lesiones epiteliales que
van desde el condiloma hasta el carcinoma invasor. Un análisis como el presente nos
permite conocer, de una manera muy general, la infección productiva de VPH, es decir, las
muestras que tengan el potencial de ser fuentes de infección viral.
MATERIAL Y METODOS
Material biológico
Se analizaron un total de 47 muestras: 13 lesiones de bajo grado (nueve tejidos con
condiloma y cuatro con neoplasia intraepitelial cervical grado I); 14 lesiones de alto grado
(cinco con neoplasia intraepitelial cervical grado II y nueve con carcinoma in situ); 11 con
carcinomas epidermoides y un adenocarcinoma. Las muestras fueron proporcionadas por
el Departamento de Patología del Instituto Nacional de Cancerología de la Secretaría de
Salud. Las ocho muestras de tejido cervical normal fueron obtenidas de piezas quirúrgicas
(histerectomía por patología benigna no relacionada al cérvix) del servicio de Ginecología
del Hospital Juárez del Centro. Como control positivo se utilizaron cortes de tejido de
condiloma de cavidad oral de perro (lesión temprana con infección lítica) infectado con el
virus papiloma y que expresa las proteínas de cápside (DAKO, Patts Inc.). Como control
negativo se utilizaron las líneas celulares HeLa y Caski, las cuales se sabe contienen
integrado a su genoma secuencias de VPH y que no expresan las proteínas de cápside. El
estudio histopatológico fue realizado por dos observadores diferentes y en estudio de doble
ciego, confirmándose por separado los diagnósticos.
Método
Una vez obtenidos los tejidos, éstos fueron fijados durante ocho horas en formaldehído al
10% amortiguado con solución de fosfatos, e incluidos en parafina. De cada uno de los
bloques de parafina, se obtuvieron cortes seriados de 5 mm de grosor y se montaron sobre
portaobjetos cubiertos con poli-D-lisina (50 mg/mL). Uno de los cortes de cada muestra fue
teñido con hematoxilina y eosina para su estudio histopatológico; los cortes subsecuentes
fueron usados para las tinciones de inmunohistoquímica de acuerdo a las instrucciones del
Kit-PAP (peroxidasa-antiperoxidasa) de DAKO-Patts, Inc.
Técnica inmunohistoquímica por el método de peroxidasa-antiperoxidasa
Los cortes de los tejidos fueron desparafinados en xilol por tres minutos y pasados
secuencialmente en etanol al 100%, 70%, 30% y agua durante dos minutos en cada uno de
ellos. Enseguida, los tejidos se incubaron por 10 minutos con peróxido de hidrógeno al 3%
a temperatura ambiente para inactivar a la peroxidasa endógena. Se lavaron en buffer
salino de fosfatos (PBS), y se trataron con la solución bloqueadora (suero de cerdo no
inmune al 10%) por 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda.
Posteriormente, se eliminó el exceso de bloqueador y se incubaron por 60 min a
temperatura ambiente con el primer anticuerpo policlonal (anti-antígeno tardío de cápside
de VP). Se lavaron los tejidos en buffer salino de fosfatos y se añadió el anticuerpo
secundario (IgG anti-conejo) por 30 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Posteriormente, se lavaron en buffer salino de fosfatos, se les añadió el complejo
peroxidasa-antiperoxidasa y se incubaron 30 minutos en cámara húmeda a temperatura
ambiente. Al término de las incubaciones se lavaron en buffer salino de fosfatos y se
añadió la solución de diaminobencidina (6 mg/10 mL de agua, con 100 mL de peróxido de
hidrógeno al 3%) para desarrollar el color, lo cual tomó aproximadamente dos minutos.
Finalmente, los tejidos fueron contrateñidos usando hematoxilina de Harris; en seguida se
deshidrataron en etanol (30%, 70% y 100%) durante dos minutos, en xilol otros tres
minutos y se montaron para su posterior revisión en el microscopio.
Las inmunotinciones fueron realizadas al mismo tiempo, monitoreando la reacción (con
diaminobencidina) cada 20 segundos bajo observación microscópica. Se consideró como
una reacción positiva, la aparición de un precipitado granular de color café intranuclear
insoluble, confinado a las células epiteliales. La reacción fue definida cuando el control
positivo había dado la coloración esperada. Todos los tejidos fueron trabajados por
triplicado. Los tejidos con tinción negativa, no mostraron señal alguna en ninguno de los
tres ensayos.
RESULTADOS
Si se considera al VPH como un agente etiológico en el carcinoma cervicouterino, es
entonces indispensable su detección en lesiones cervicales de nuestra población. Una de
las maneras para detectarlo es usando técnicas sencillas y reproducibles que involucran la
inmunología y la histología, como es el método de inmunohistoquímica.
En el presente trabajo, se estudiaron cortes de tejido incluidos en parafina de ocho
muestras de tejido cervical normal; de las cuales una se encontró positiva para la detección
de proteína tardía viral (Figura 1A), en la distribución con la que comúnmente se consigna
en la literatura (estrato superior del epitelio). Mientras que, de las muestras de condilomas,
se encontraron ocho de nueve positivas, dos de cuatro en los NIC I, tres de cinco de NIC II,
tres de nueve de carcinoma in situ e inesperadamente en dos de 12 casos de carcinoma
cervicouterino (Figura 1B, Cuadro I).
Figura 1. Expresión de la proteína tardía de virus del papiloma humano en tejido cervical. A) Detección de la
proteína viral en tejido cervical sin patología neoplásica (400X).
Cuadro I. Presencia del antígeno tardío del virus del papiloma humano
en lesiones de alto y bajo grado del cérvix.
Frecuencia de la
proteína
de cápside (L1)*
Tejido
Cérvix normal
Lesión de bajo grado:**
Lesión de alto grado:**
Condilomas
NIC I
NIC II
Carcinoma in situ
Carcinomas invasores
Células HeLa***
Células CaSki****
1/8
8/9
2/4
3/5
3/9
2/12
—
—
(0.125)
(0.88)
(0.50)
(0.60)
(0.33)
(0.17)
(0.00)
(0.00)
*Inmunohistoquímica por el método de peroxidasa-antiperoxidasa para la proteína L1.
**Lesión de bajo y alto grado: Nomenclatura de acuerdo al Sistema de Bethesda.32
***Células HeLa = Línea celular derivada de carcinoma cervicouterino con secuencias
integradas de HPV 18. No expresan L1.
****Células CaSki = Línea celular derivada de carcinoma cervicouterino con secuencias
integradas de HPV 16. No expresan L1.
En general, la señal de la proteína viral fue nuclear y en células de los estratos intermedios
y superiores, conforme a lo informado en la literatura, es decir, en células diferenciadas.
Sin embargo, al examinar detenidamente los resultados de las inmunotinciones,
inesperadamente se encontró señal positiva para la proteína viral en células del estrato
basal (células indiferenciadas) (Figura 2B), así como en células de carcinomas invasores
(Figura 1B), observación que no ha sido consignada hasta ahora.
Figura 2. Detección de la proteína tardía de cápside del virus del papiloma humano en diferentes regiones del
epitelio cervical de dos muestras de neoplasia intraepitelial cervical grado I: A) Tinción en el estrato superior e
intermedio del epitelio (células diferenciadas) (200X)
Tal y como se observó en todas las tinciones realizadas, la intensidad
inmunorreacción (nuclear) varió de célula a célula, lo cual sugiere que dichas
contienen diferentes concentraciones de proteína viral. Además, se encontró
prevalencia del antígeno viral disminuyó aproximadamente tres veces en lesiones
grado con respecto a las de bajo grado.
de la
células
que la
de alto
Como controles negativos (Figura 3A) se utilizaron las líneas celulares HeLa y Caski, las
cuales se sabe tienen integrado en su genoma el ADN de VPH tipos 18 y 16,
respectivamente (al igual que la mayoría de los tumores invasores del cérvix) y que no
expresan las proteínas de cápside. Como control positivo se utilizaron cortes de tejido de
condiloma infectado con el virus papiloma (Figura 3B).
Figura 3. A) Control negativo. En la foto se muestran células HeLa, las cuales no mostraron señal para la proteína
de cápside (250X). B) Control positivo. Tejido de condiloma infectado con el virus papiloma (400X). Los tejidos
fueron contrateñidos con hematoxilina de Harris.
DISCUSION
Entre la evidencia que sugiere a los VPH como uno de los más importantes agentes
etiológicos del carcinoma cervicouterino, se tiene que, en líneas celulares derivadas de
carcinomas cervicales (tales como Hela, SiHa y Caski), el ADN de VPH se encuentra
integrado al genoma celular y es transcripcionalmente activo, produciendo las
oncoproteínas E6 y E7;8 además, en un elevado porcentaje de tumores cervicales se
encuentra presente el ADN de VPH y las proteínas para las cuales codifica.9 Con base en
estudios de microscopia electrónica de biopsias de tejido con atipias en el epitelio cervical y
estudios citológicos, se ha sugerido que la infección por VPH en el cérvix puede ser la
principal causa de la neoplasia cervical.18-20
Considerando el papel que tienen estos virus en el desarrollo del carcinoma cervicouterino,
es importante detectar su presencia en este tipo de lesiones y estudiar cómo es que
participan en el desarrollo de las mismas. Sin embargo, no es suficiente con determinar
únicamente la presencia de infección; también es importante conocer el tipo de virus que
ha infectado. Estudios recientes muestran que entre los eventos moleculares presentes en
una infección por VPHs de alto riesgo (por ejemplo, los tipos 16 y 18), la formación de
complejos proteicos entre las oncoproteínas virales E6 y E7 con las proteínas supresoras
de tumores p53 y p105 Rb, respectivamente, puede ser uno de los pasos necesarios para
la transformación.8,21,22 Por otro lado, es posible que otras proteínas virales, tales como E2
o E5, pudieran activar transcripcionalmente a genes celulares involucrados en la división y
proliferación celular, por ejemplo los oncogenes c-myc, c-ras. También es posible que se
establezca una cooperación entre una proteína viral y un oncogen celular, tal es el caso de
la oncoproteína E7 que coopera con el oncogen c-ras para transformar células de riñón de
ratón.22
Así, algunos de los puntos claves para llevar a una transformación de células epiteliales de
cuello uterino son, entre otros, la presencia de VPHs de alto riesgo,3,12,23,24 el sistema
inmune,25 la pérdida o alteración de los genes supresores de tumores26,27 y la alteración de
oncogenes celulares.28-30
Una de las formas para abordar la presencia del VPH en tejidos consiste en los
experimentos in situ mediante la detección de su genoma o de alguna de las proteínas
codificadas. Así, en este trabajo se decidió utilizar la inmunohistoquímica para determinar
la presencia de infección lítica por VPH a través de la detección de las proteínas de
cápside, siendo la inmunohistoquímica una técnica que permite detectar localmente o in
situ la presencia de determinadas proteínas.
La señal positiva (precipitado de color café) se encontró siempre intranuclear, a diferentes
niveles del epitelio cervical y con diferentes intensidades. Estas diferencias en tinción que
se observaron dentro de un mismo tejido, es decir, la presencia de células positivas
intercaladas con negativas, puede deberse a que las células podrían encontrarse en
diferentes etapas de la infección viral, por lo que unas células sí expresan las proteínas de
cápside y otras no; o bien, a que las células negativas en efecto no estuvieran infectadas.
Sin embargo, cabe recordar que, en el presente caso, una célula negativa no indica
necesariamente que no haya infección viral, ya es posible que el genoma viral se encuentre
presente, pero que no esté ocurriendo síntesis de proteína de cápside, sugiriendo que en
los genomas virales la región tardía se encuentra inactiva (por ejemplo, por integración del
genoma viral) o no es eficiente la transcripción de dicha región.
Por otro lado, se observó que mientras aumentaba la severidad de la atipia cervical, la
prevalencia del antígeno disminuía. Esto sugiere que, al aumentar la severidad de la lesión,
los mecanismos de regulación de los virus pueden cambiar (dependiendo del tipo viral
infectante); de tal forma que estos cambios de regulación viral sean probablemente una de
las causas de las diversas alteraciones que presentan las diferentes lesiones (dependiendo
del grado de la lesión), por ejemplo, la integración del genoma viral al genoma hospedero y
la pérdida de expresión de las proteínas de cápside en carcinomas invasores.28,29 Así, los
resultados muestran que la expresión de la proteína viral está frecuentemente relacionada
con las lesiones de bajo grado.
Existen informes sobre la incidencia relativa de mujeres «sanas» infectadas por VPH (10 al
35%) que al momento del análisis no habían desarrollado ninguna lesión relacionada con la
presencia de este virus.23 En nuestro estudio se encontró que sólo una de las muestras
normales (sin patología neoplásica) presentaba proteína de cápside. Es posible que el
estado inmunológico desempeñe un papel importante en este tejido, ya que no se presentó
como un condiloma franco, o bien puede indicar una infección reciente. Aunque la muestra
de tejidos sin lesión preneoplásica o neoplásica es muy pequeña, los resultados sugieren
que puede existir una población aparentemente «sana» que está infectada por VPH
(aproximadamente 10/100 mujeres), que no ha desarrollado las lesiones características,
pero potencialmente podría ser un foco de transmisión con un alto riesgo para desarrollar
algún tipo de lesión cervical.
En forma por demás interesante, hasta este momento no existe ningún informe en la
literatura en el que se demuestre que las células de la capa basal del epitelio cervical
(células indiferenciadas), así como células de carcinomas invasores, permitan la expresión
de cápside viral. De acuerdo con nuestros resultados, la detección de células positivas
para antígeno tardío en el estrato de células basales puede sugerir la presencia de células
permisivas en la capa basal del epitelio que soportan, en eventos tempranos de la
infección, la expresión de proteína tardía. Este hallazgo contradice un poco lo que se sabía
hasta ahora en cuanto a las características que debían tener las células que soportan una
infección lítica, pues, como ya se ha mencionado, se cree que la replicación viral, así como
la expresión de sus proteínas de cápside, están relacionadas con eventos de diferenciación
celular, ya que sólo se había encontrado expresión de las proteínas de cápside en células
diferenciadas. Dado que el virus entra e infecta el epitelio a través de la capa basal del
mismo, podría pensarse que la presencia de cápside en este estrato se deba a los virus
que recién han entrado al epitelio. Sin embargo, consideramos que esto no es muy factible,
dado que debería tratarse de una gran cantidad de virus el que esté presente en la capa
basal, tal que las proteínas de cápside se hallen en concentración suficiente como para ser
detectables por inmunohistoquímica.
En cuanto al caso de los carcinomas invasores que mostraron presencia de proteína de
cápside, es posible que algunos genomas virales presentes en esta lesión se encuentren
en forma episomal con su genoma intacto y que sean capaces de sintetizar proteínas de
cápside. Con este tipo de tecnología podemos definir parcialmente la presencia de
antígenos de cápside en células indiferenciadas, ya que, como se ha mencionado, esta
técnica tiene ciertas limitaciones a pesar de las grandes ventajas que ofrece; por esto, es
necesario realizar estudios más específicos para determinar los mecanismos que pudieran
participar en la regulación de los genes virales, y poder explicar la presencia de proteína
tardía en las células indiferenciadas.
En el momento que se realizó el presente trabajo, lo que se consideraba de manera
general era que el ADN de VPH se podía encontrar principalmente en forma integrada en
los carcinomas invasores. Sin embargo, muy recientemente Berumen y colaboradores,31
han demostrado la presencia de formas episomales de VPH en cáncer invasor del cérvix
mediante la detección de la región E1/E2 por medio de la técnica de PCR, considerando
que es posible que las formas episomales jueguen un importante papel en la
carcinogénesis a través de la replicación viral, así como de otros mecanismos involucrados
en la transformación que no involucran la integración del genoma viral al celular. Por otro
lado, recientemente Salcedo y asociados demostraron, mediante estudios de tipo southern
blot, la presencia de formas episomales del VPH-16 en un 30% de las muestras de cáncer
invasor que estudiaron. Así pues, estos recientes hallazgos, que muestran que las células
tumorales pueden soportar la replicación viral con formas episomales del virus, confirman
la naturaleza de nuestros resultados en cuanto a la presencia de cápside (debida
probablemente a estas formas episomales) en células de carcinomas invasores. Sin
embargo, queda aún por explicar la presencia de infección lítica en los estratos basales del
epitelio cervical.
El uso de la inmunohistoquímica para la detección de la infección por el virus del papiloma
muestra grandes ventajas por ser una técnica muy rápida, fácil de llevar a cabo y que no
requiere de tecnología sofisticada; sin embargo, la detección de las proteínas de cápside
tiene la desventaja de que puede llegar a subestimarse la presencia del virus, en particular
si se trata de lesiones muy avanzadas, pero no así en lesiones tempranas. Consideramos
que esta técnica es muy útil para un rápido análisis de la presencia de infección lítica por
VPH, en particular para lesiones tempranas.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Cancerología (INCan) por el apoyo brindado para la realización del presente trabajo, así
como al CONACyT por el donativo de infraestructura al INCan (F383-M9304) y porque los autores (LTC, MSV) son
becarios del mismo.
Dirección para correspondencia:
Dra. Lucia G Taja Chayeb
Instituto Nacional de Cancerología
División de Investigación Básica
Av. San Fernando 22
Col. Tlalpan
14000 México, D.F.
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