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ENZIMAS-2005
Las enzimas son catalizadores biológicos en su mayoría de naturaleza proteica
(99,99%) y las ribosimas (fragmentos de RNA) (0,1%).
Las enzimas tienen tres propiedades bien definidas e inigualables que las hacen
mucho más efectivas que los catalizadores no biológicos:
a) EFICIENCIA: en cantidades micromoleculares aceleran la velocidad de la
reacción millones de veces.
b) ESPECIFICIDAD: las enzimas son capaces de distinguir entre sustancias
estrechamente relacionadas como los estereoisómeros. Por ejemplo: la glucosa
oxidasa reconoce la β- D- glucosa y no sobre la α- D- glucosa.
c) REGULACIÓN: algunas enzimas son regulables, es decir, se puede
aumentar o disminuir su actividad catalítica.
Las enzimas influyen exclusivamente sobre la velocidad de la reacción, pero no
modifican:
1- La dirección de la reacción.
2- La posibilidad termodinámica de que dicha reacción se produzca. Es decir,
sólo catalizan reacciones que pueden producirse espontáneamente.
3- El equilibrio de la reacción, es decir, no altera las concentraciones de
reactivos ni de productos en el equilibrio.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
El estudio de la velocidad de la reacción catalizada y la forma en que cambia en
respuesta a cambios en los parámetros experimentales se conoce como cinética.
Los factores o parámetros experimentales más importantes son:
a- La concentración de enzima.
b- La concentración de ligandos (sustrato, productos, cofactores, inhibidores y
activadores).
c- El pH.
d- La fuerza iónica.
e- La temperatura.
Uno de los factores claves que afectan a la velocidad de una reacción catalizada
por una enzima “in vitro” es la cantidad de sustrato presente, [S]. Durante el transcurso
de una reacción a medida que el sustrato se convierte en producto, disminuye la [S],
por esta razón resulta complicado el estudio de los efectos de la concentración de
sustrato. Una aproximación simplificadora consiste en medir la velocidad inicial,
designada V0 cuando [S] es generalmente mucho mayor que la concentración de
enzima. En estas condiciones, si transcurre poco tiempo después del inicio de la
reacción, los cambios en [S] son insignificantes por lo que se puede considerar [S]
constante. Se puede determinar V0 graficando la velocidad de la reacción en función
del tiempo, manteniendo [S] en exceso y la concentración de enzima constante. En
estas condiciones la cantidad de sustrato transformado es proporcional al tiempo y la
parte lineal del gráfico corresponde a la V0.
En la figura1 se muestra el efecto de la variación de [S] sobre V0 cuando se
mantiene constante la concentración de enzima. Esta reacción obedece a la cinética
clásica o de Michaelis- Menten. La Vmax se observará cuando toda la enzima esté
como complejo ES. Esta condición se produce cuando [S] es suficientemente alta, de
modo que toda la enzima libre se encuentra como ES. La Km (moles/L) es igual a la
concentración de sustrato en la cual V0 es la mitad de la Vmax. El significado de Vmax
y Km es único para cada enzima.
1
V0
o
V max.
V max
2
Km
[S]
Figura 1- Esta curva de saturación puede ser expresada matemáticamente por la
ecuación de Michaelis-Menten:
V0 = Vmax . [S]
Km + [S]
Debemos destacar lo siguiente:
1- El sistema involucra a un solo sustrato que da un solo producto.
2- El sistema se encuentra en estado estacionario: esto quiere decir que [ES]
es constante.
3- Se trabaja en condiciones de V0 es decir cuando la [S] >> [P] o sea donde P
es prácticamente nulo.
PARTE PRÀCTICA
En el laboratorio observaremos el efecto del tiempo, temperatura y concentración
de sustrato sobre la actividad enzimática de la Ureasa.
La ureasa es una enzima que tiene importancia histórica por haber sido la
primera enzima cristalizada. Tiene importancia en el laboratorio bioquímico pues se la
usa en la determinación de urea de los líquidos biológicos.
Es una enzima de alto peso molecular (485.000 D), con un punto isoeléctrico (pI)
alrededor de 5,0 que se encuentra en cantidades variables en microorganismos, en
plantas leguminosas, en estómago, en hígado y otros órganos de animales superiores.
La reacción que cataliza es la siguiente:
NH2
NH2
C=O + H2O
ureasa
2 NH3 + CO2
FUNDAMENTO: la ureasa descompone específicamente a la urea produciendo
CO2 y NH3, éste reacciona con fenol e hipoclorito de sodio en medio alcalino
produciendo azul de indofenol que se determina fotocolorimétricamente a 540 ηm.
2
EFECTO DEL TIEMPO- DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD INICIAL
Se determina la actividad enzimática en función del tiempo, manteniendo
constantes las demás variables: [S], [E] y temperatura. Se sigue el esquema del
cuadro y luego de cumplido el tiempo de incubación correspondiente se efectúan las
lecturas de DO (densidad óptica), en un fotocolorímetro con filtro verde (540 ηm). La
actividad enzimática se obtiene midiendo la cantidad de producto formado, que es
directamente proporcional a la intensidad del color desarrollado. Se grafica en un
sistema de coordenadas DO en función del tiempo
TUBO
Blanco
1
2
3
4
5
H2O
dest.
1 gota
Urea
Ureasa
-----0.2mL
0.2mL
Tiempo de
incubación Reactivo Reactivo Incubación a
(35-37ºC)
1
2
35-37ºC
20 minutos
0.5 mL
0.5 mL 5 minutos
3 minutos
5 minutos.
10 minutos
15 minutos
20 minutos
EFECTO DE LA TEMPERATURA
La temperatura influye sobre la actividad enzimática. Cada enzima tiene una
temperatura en donde la actividad enzimática es máxima.
Se determinará para la ureasa la temperatura óptima. Se sigue la técnica
indicada en el cuadro. Se efectúan las lecturas correspondientes y se grafica la
actividad enzimática en función de la temperatura.
TUBO
H2O
dest.
Urea
Ureasa
Blanco
1
2
3
4
5
6
1 gota
-----.2mL
0.2mL
Temperatura
de
Reactivo Reactivo Incubación
incubación
1
2
a 35-37ºC
(10 minutos)
100ºC
0.5 mL
0.5 mL 5 minutos
0ºC
20 ºC
40ºC
60 ºc
80ºC
100 ºC
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
Para la determinación de Km y Vmax. se trabajará con la ecuación de LinerweaverBurk (doble recíproca). Se sigue el esquema dado en los cuadros y se lee en
fotocolorímetro las densidades ópticas correspondientes. Se grafica 1/V0 en función de
1/S. El valor de V0 corresponde a la DO del P en cada tubo.
Diluciones del Sustrato: la solución madre posee una concentración de 200 mM de
Urea.
3
TUBO
H2O DEST.
1
2
3
4
5
6
7
1 mL
-------2mL
Solución
madre
1 mL
Concentración
de Urea mM
3.125
6.25
12.5
25
50
100
200
TECNICA
TUBO
Urea
-----Blanco
1
0.2mL de la
2
dilución
3
correspondiente
4
5
6
7
Ureasa
0.2 mL
H2 O
dest
Temperatura
Reactivo Reactivo Incubación
de
1
2
a 35-37ºC
incubación
(30-35 ºC)
5 minutos
0.5 mL
0.5 mL
5 minutos
10
mL
4
5