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CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS.
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA
TESIS
EFECTOS TÓXICOS DEL FLUIDO CELÓMICO DE LA LOMBRIZ DE
TIERRA Eisenia fétida EN COLEOPTERA Y ORTHOPTERA
PRESENTA
Alfonso Maximiliano Claros Guzmán
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS ÁREA EN
TOXICOLOGÍA
TUTOR
Dr. Martín Gerardo Rodríguez (Tutor)
COMITÉ TUTORAL
Dr. Fernando Jaramillo Juárez
Dr. Francisco Aníbal Posadas del Río
Aguascalientes, Ags, 21 de mayo del 2015
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACIT) por la beca 472356
A la Universidad Autónoma de Aguascalientes (UAA) por aceptarme una vez más
en esta gran institución.
A todos los profesores del programa de la Maestría en Ciencias del área de
Toxicología quienes me enseñaron mucho.
A mi tutor el Dr. Martín Gerardo Rodriguez quien me enseño mucho de
investigación, ciencia y aspectos de la vida. Agradezco la gran paciencia que me
tuvo, el apoyo que me brindó y los buenos momentos que pasamos.
A los Doctores Fernando Jaramillo Juárez y Francisco Aníbal Posadas del Río por
la guía que me dieron en sus revisiones, observaciones y preguntas.
A María Guadalupe Espino López y Olivia Campos Richarte técnicas de
laboratorio de Fisiología, por su disposición y ayuda en el préstamo de equipo de
laboratorio.
A mi compañera y gran amiga Alejandra Ponce por su ayuda y apoyo en el
proyecto.
A Dios, a mi familia y amigos de toda la vida que siempre me apoyaron y creyeron
en mí.
DEDICATORIA
Esta tesis que representa el esfuerzo de un año y medio de trabajo, se lo dedico
primeramente a Dios por todo lo que me ha dado y por la gran experiencia que ha
representado la maestría para mí.
En segundo lugar quiero dedicar este trabajo a todas esas personas que creyeron
en mí y que me acompañaron en mis momentos más difíciles. Ellos son mi padre
Manuel Ricardo Claros Negrete, a quien admiro por su gran fortaleza y de quien
me enorgullezco; a mi madre María de Jesús Guzmán García, por su compasión y
fe en mí; a mi querida hermanita Fátima Humelia Claros Guzmán, que es tan
noble y aguanta todas mis bromas. Y no puedo olvidar a mis buenos amigos de
quienes no sé qué sería de mí sin ellos, especialmente a Leobardo David Gonzalez
Cabrera, mi casi hermano, no olvidare los buenos momentos; a Cristina Gonzalez
por las fiestas de tareas; y a mi gran amigo José Ulises Marque Urbina quien ha
sido una gran inspiración para seguir este camino.
Finalmente a ese pequeño y solitario niño de quien nadie creía que podría salir
adelante.
INDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL
1
ÍNDICE DE TABLAS
4
ÍNDICE DE FIGURAS
5
RESUMEN
8
ABSTRACT
10
INTRODUCCIÓN
12
1. Marco teórico
14
1.1. La lombriz de tierra Eisenia foetida
14
1.1.1. Importancia
14
1.1.2. Anatomía de la lombriz de tierra
15
1.1.3. Toxicidad del fluido celómico y sus componentes
17
1.2. Los insectos
19
1.2.1. Importancia de los insectos
19
1.2.2. Aspectos generales de la Anatomía externa de los insectos
20
1.2.2.1. Región cefálica
21
1.2.2.2. Región del tórax
23
1.2.2.3. Las patas de los insectos
24
1.2.2.4. La región abdominal
28
1. 2.3. Anatomía interna de los insectos
30
1.2.3.1. Anatomía del sistema circulatorio
29
1.2.3.2. Sistema muscular
34
1.2.3.2.1. Músculo esquelético
34
1.2.3.2.2. Estructura de los músculos
36
1.2.3.2.3. Inervación y activación delos músculos
40
1.2.3.2.4. Mecanismo general de la contracción del músculo
41
1.2.3.2.5. El músculo liso
45
1.2.3.2.6. Anatomía del músculo liso
46
1
1.2.3.2.7..Comparación de la contracción del músculo liso con la
contracción del músculo estriado
1.2.3.3. Anatomía del sistema digestivo
1.2.3.3.1. Morfología y función del intestino
49
50
51
1.2.4. Aspectos generales de los Orthopteros
54
1.2.5. Aspectos generales de los Coleopteros
56
2. HIPÓTESIS
58
3. OBJETIVOS
58
3.1. Objetivo general
58
3.2. Objetivos específicos
58
4. JUSTIFICACIÓN
58
5. MATERIALES Y MÉTODO
60
5.1. Obtención de los organismos
60
5.2. Obtención del fluido celómico
61
5.3. Prueba del efecto del fluido celómico en el modelo de vaso dorsal de
insecto
5.4. Prueba del fluido celómico en el modelo neuromuscular de la pata trasera
del insecto
61
63
5.5. Determinación de la dosis letal 50 del fluido celómico
65
5.6. Prueba de efectos de la lisenina en el modelo de vaso dorsal de insecto
67
5.7. Prueba Estadística
67
6. RESULTADOS
68
6.1. Efectos del fluido celómico liofilizado en la frecuencia del vaso dorsal
del grillo y del tenebrio
6.2. Análisis del efecto del fluido celómico en la apertura del vaso dorsal en
el grillo y el tenebrio
6.3. Análisis del efecto del fluido celómico en la preparación neuromuscular
de la pata trasera del grillo y del tenebrio
6.4. Efecto de la lisenina en la preparación del vaso dorsal y neuromuscular
de la pata trasera del grillo
2
68
73
78
85
6.5. Determinación de la DE50 y DL50
90
DISCUSIÓN
91
CONCLUSIÓN
98
BIBLIOGRAFÍA
99
3
INDICE DE TABLAS
TABLA
PÁGINA
Tabla 1. Diferentes concentraciones de FCF que se usaron en la
determinación de la DL50, en la que se utilizaron 6 grillos por
dosis.
4
65
INDICE DE FIGURAS
FIGURA
PAGINA
Figura 1. Estructura anatómica de la lombriz de tierra
16
Figura 2. Morfología externa de la región cefálica de un insecto
22
Figura 3. Segmentos que conforman el tórax
24
Figura 4. Pata de un insecto mostrando los artejos que la constituyen
25
Figura 5. Diferentes tipos de patas por su función
27
Figura 6. Diagrama del abdomen segmentado de un insecto
28
Figura 7. Diagrama anatómico externo básico del grillo Achaeta
domesticus
29
Figura 8. La hemolinfa llega a todos los tejidos y estructuras para
asegurar la circulación a través de los órganos pulsátiles, aorta,
vaso dorsal, diafragma dorsal, válvulas ostiales y los septos. El
31
cordón nervioso ventral está asociado al diafragma ventral
Figura 9. Parte del diafragma dorsal de un “zangano” con los órganos
asociados a él vistos por abajo.
33
Figura 10. Músculo con fibras paralelas y fibras pinadas. Las fibras
musculares en paralelo son los músculos mesotorásicos
dorsales para el vuelo en el tettigónido Neoconocephalus
robustus. La estructura oscura que pasa a través de la superficie
35
del músculo es la motoneurona que inerva al músculo. Los
músculos con fibras pinadas pertenece a la tibia mesotorásica
extensora del grillo Teleogryllus oceanicus
Figura 11. Estriación transversa del músculo esquelético. Imagen tomada
desde el microscopio electrónico, el cual, es una sección de
fibra del área del mesotórax dorsal del músculo longitudinal del
36
tettigoniido Neoconocephalus ensiger
Figura 12. Estructura de los filamentos gruesos y delgados
5
38
Figura 13. Organización estructural de una fibra muscular rápida de un
insecto
39
Figura 14. Ciclo de la contracción, las sarcómeras se acortan en ciclos
repetidos, durante las cuales las cabezas de miosina (puentes
43
cruzados) se unen a la actina, giran y se separan de la misma.
Figura 15. Función de los iones del Ca2+ en la regulación de la contracción
por la troponina y la tropomiosina
44
Figura 16. Músculo liso multiunitario y músculo unitario
46
Figura 17. Estructura física del musculo liso
48
Figura 18. Diagrama general del intestino de un insecto
51
Figura 19. Tipos de intestinos en la mayoría de insectos
53
Figura 20. Diferentes especies de ortópteros
55
Figura 21. Vista dorsal de un coleóptero
57
Figura 22. Achaeta domesticus
60
Figura 23. Tenebrio molitor
60
Figura 24. Material utilizado en la preparación fisiológica de vaso dorsal
del grillo y de tenebrio
Figura 25. Preparación neuromuscular del grillo.
Figura 26. Grillo fijado en placa de parafina en posición ventralmente
hacía arriba
Figura 27. Grillos encerrados en cajas de petri después de habérseles
administrado el FCF
62
64
66
66
Figura 28. Efecto del FCL en el modelo de vaso dorsal de grillo
comparado con la dosis de solución control, en la que se
grafica el número de contracciones contra el tiempo en minutos
69
(ANOVA preuba Tukey p<0.05).
Figura 29. Comparación de la dosis de FCL contra la solución control en el
modelo de vaso dorsal de tenebrio (ANOVA preuba Tukey
p<0.05).
6
71
Figura 30. Efecto del FCL sobre la apertura del vaso dorsal del grillo a
diferentes dosis (ANOVA preuba Tukey p<0.05).
74
Figura 31. Gráficas del efecto del FCL en la apertura del vaso dorsal de
tenebrio a diferentes concentraciones(ANOVA preuba Tukey
76
p<0.05)
Figura 32. Efecto del FCL en la preparación neuromuscular de grillo
(ANOVA preuba Tukey p<0.05)
79
Figura 33. Gráficas del porcentaje de fuerza de la pata trasera del grillo
posterior a la administración de las dosis (ANOVA prueba
81
Dunnet p<0.05)
Figura 34. Gráficas del efecto del FCL en la preparación neuromuscular de
tenebrio (ANOVA preuba Tukey p<0.05)
82
Figura 35. Gráfica del porcentaje de intensidad de fuerza de la pata trasera
del tenebrio posterior a la administración de las dosis (ANOVA
84
prueba Dunnet p<0.05)
Figura 36. Gráficas del fecto de la lisenina en la frecuencia del vaso dorsal
del grillo,comparada con el tratamiento control (ANOVA
86
preuba Tukey p<0.05).
Figura 37. Efecto de la lisenina en la apertura del vaso dorsal del grillo
control (ANOVA preuba Tukey p<0.05)
Figura 38. Gráficas del efecto de la lisenina sobre la preparación
neuromuscular del grillo (ANOVA prueba Tukey p<0.05).
87
88
Figura 39. Gráficas del porcentaje de fuerza de la pata trasera del grillo
posterior a la administración de las dosis de lisenina (ANOVA
89
prueba Dunnet p<0.05)
Figura 40. Gráfica para determinar la DE50 del grillo
90
Figura 41. Gráfica para determinar la DL50 utilizando FCF en grillos
90
7
RESUMEN
EFECTOS TÓXICOS DEL FLUIDO CELÓMICO DE LA LOMBRIZ
DE TIERRA Eisenia foetida EN COLEOPTERA Y ORTHOPTERA
La Fisiología constituye parte esencial de la Entomología básica y aplicada, pues tiene
relación con la toxicología de los insecticidas y otras formas de control de población de
los insectos. No obstante el conocer nuevas aplicaciones para el mejoramiento del
control de las plagas de insectos nos permite sustituir el uso de pesticidas químicos.
En este estudio se planteó el análisis de los efectos del fluido celómico (FC) en dos
especies de insectos; el grillo común o Acheta domesticus (Orden Orthoptera) y del
escarabajo tenebrio o Tenebrio molitor (Orden Coleoptera), de quienes se analizaron los
efectos producidos por el FC de la lombriz Eisenia foetida. Se ha reportado que esta
sustancia posee componentes con diversas actividades biológicas, tales como actividad
hemolítica y citotóxica en vertebrados; además de poseer actividad antibacterial.
Se analizaron los efectos del FC en las preparaciones fisiológicas del vaso dorsal y
neuromuscular de los grillos y tenebrios. En la preparación del vaso dorsal de estos
insectos se hicieron registros por microvideo, en el que se administró fluido celómico
liofilizado (FCL) en las concentraciones de 0.4, 0.6, 0.8 y 1mg/Kg. Observándose una
disminución en la frecuencia cardiaca del vaso dorsal en las concentraciones de 0.6, 0.8
y 1mg/Kg de FC en el grillo; sin embargo en tenebrio no se observaron efectos
significativos en el ritmo de las contracciones.
Se observó que en todas las concentraciones de fluido celómico se produjo una
disminución significativa de la apertura del vaso dorsal en el grillo, pero en el tenebrio
en las concentraciones de 0.6, 0.8 y 1mg/Kg. Además, se administró a los grillos 100ng
y 200ng de lisenina, en el que se observó efectos significativos en la apertura del vaso
dorsal, pero no se observó efectos en la frecuencia cardiaca del vaso dorsal.
8
En la preparación neuromuscular de la pata trasera del grillo y del tenebrio se
observaron alteraciones en la contracción muscular de estos apéndices. Se
administraron concentraciones de 0.8, 1.6, 3.2 y 6.4mg/Kg de FCL, en los que se
observó una disminución de la contracción muscular de pata trasera de estos insectos. Se
presentaron efectos significativos en todas las concentraciones para el grillo, mientras
que en el tenebrio se registraron efectos en las concentraciones de 0.8, 3.2 y 6.4 mg/Kg.
Este efecto también se observó al administrar lisenina a la preparación neuromuscular
del grillo, en las dosis de 100 y 200 ng.
Se determinaron los parámetros toxicológicos como la dosis letal 50 (DL50) con fluido
celómico fresco (FCF), la cual fue de 1.486 x10-4 mg/g en los grillos, y la dosis efectiva
(DE50) determinada a partir de las dosis de FCL administradas a la preparación del vaso
dorsal del tenebrio, el cual fue de 5.083 x10-4 mg/g.
En conclusión, el FC de la lombriz de tierra Eisenia foetida es una sustancia tóxica,
capaz de alterar la contracción en los músculos del vaso dorsal; produciendo
vasoconstricción en los grillos y los tenebrios y disminuir la frecuencia del vaso dorsal
en los corazones miogénicos. Además, puede afectar los músculos encargados de la
locomoción de los insectos que se estudiaron, disminuyendo la fuerza de contracción de
sus patas traseras.
9
ABSTRACT
TOXIC EFECTS OF THE CELOMIC FLUID FROM EART WORM Eisenia
foetida ON COLEOPTERA AND ORTHOPTERA
Physiology is an essential component of the basic and applied Entomology. It has
relation with the Toxicology of insecticides and other forms of control insects
population. However the knowledge new applications for improve insect pest control
enable us replace the use of chemistry pesticides.
In this investigation we proposed the analyse effects of celomic fluid (CF) in two insect
species, the common cricket (Acheta domesticus, order Orthoptera) and mealworm
(Tenebrio molitor, order Coleoptera). We analyzed and record the effects of CF on these
insects. Other investigations have reported that the FC has component with many
biological activities, like a hemolytic and cytotoxic activity in vertebrates; furthermore,
it has antibacterial action.
We analyzed the effects of CF in physiological preparations of the dorsal vessel and
neuromuscular of the crickets and mealworms. The effects of CF in dorsal vessel were
recorded in microvideo. The lyophilized coelomic fluid (LCF) was administered in the
dorsal vessel preparation of the crickets and mealworms at the concentrations of 0.4, 0.6,
0.8 and 1 mg/Kg. Our result suggest that dorsal vessel decrease its heart rate in 0.6, 0.8
and 1 mg/Kg in the cricket; however in the mealworm no significant effects in the rate
of contractions.
Our results aim that all concentration of CF produced a significative decrease of the
aperture in dorsal vessel of the cricket, but in the mealworm, only had significant effects
in 0.6, 0.8 and 1 mg/Kg; furthermore, in the cricket, we injected lysenin in 100 and 200
ng, but did not observe significative effects in heart rate of dorsal vessel
10
In the neuromuscular preparation in rear leg of the cricket and mealworm, we observed
disturbance in the muscular contraction. When administered LCF in concentration of
0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 mg/Kg, had decreased the force of muscular contraction of the rear
leg in crickets and meal worms. Our results suggest that in all concentrations of LCF can
decrease the force of the muscular contraction, although in the mealworm only had
significative effects in 0.8, 3.2 and 6.4 mg/Kg. This effect is also presented to
administered lysenin in the neuromuscular preparation of the crickets, in the doses of
100 and 200 ng
The toxicological parameters like the letal doses 50 (LD50) with fresh coelomic fluid
(FCF), had a value of 1.486 x10-4 mg/g in crickets. While the efective dose 50 (ED50)
with LCF had a value of 5.083 x10-4 mg/g.
In conclusion, the CF of the earth worm Eisenia foetida is a toxic substance can disturb
the muscular contraction in the dorsal vessel. It produces vasoconstriction in the dorsal
vessel of the crickets and mealworms and decreases the heart rate in myogenic hearts;
furthermore can disturb the locomotive muscles of the crickets and mealworms,
decreasing the force of the muscular contraction of their rear legs.
11
INTRODUCCIÓN
En los siguientes 20 años, la producción agrícola habrá incrementado significativamente
para satisfacer las necesidades de una creciente población (Chandler y col. 2013),
incrementando la demanda de una producción sustentable de alimentos, esto tiene que
hacerse sin perjudicar los bienes públicos, ambientales y sociales que la agricultura trae
(Sørensen y col. 2012). A demás con un incremento restrictivo en la aplicación de
agentes de control químico, que han dado como resultado la necesidad de aplicar
métodos alternativos para combatir las pestes de insectos agrícolas (Sørensen y col.
2012). Por lo que se necesita una serie de innovaciones que deben ser desarrolladas para
satisfacer las necesidades de los agricultores de acuerdo a sus circunstancias locales
(Chandler y col. 2013).
Una vía para incrementar la disponibilidad de alimentos es mejorar el control de las
plagas. Hay un estimado de 67 000 diferentes especies de plagas agrícolas, entre las que
incluyen plantas patógenas, malas hiervas, invertebrados y algunas especies de
vertebrados y juntos causan cerca del 40% de pérdidas de cultivos en el mundo
(Sørensen y col. 2012). Entendiendo el término plaga como cualquier organismo vivo
(animal o vegetal) que ocasiona daños económicos a poblaciones de personas, animales,
vegetales, a la propiedad o al medio ambiente (Cañedo y col. 2011), estas constituyen
una limitación severa en la producción de cultivos anuales alimenticios en América
Central (Saunders, 1984).
Desde 1960, el control de pestes de insectos en los países industrializados ha estado
basado
en el uso de pesticidas químicos sintéticos. Sin embargo, el uso de estas
sustancias comenzó a ser restringido debido a factores como: el uso de pesticidas puede
dañar la salud humana y ambiental. Algunos compuestos químicos viejos han causado
serios problemas a la salud de los agricultores y otros por el inadecuado control durante
la manufactura, cultivo y aplicación. Por otro lado el excesivo y poco juicioso uso
profiláctico de pesticidas condujeron al resurgimiento de plagas, problemas de pestes
12
secundarias o el desarrollo de resistencia heredada. Mundialmente hay más de 500
especies de artrópodos que tienen resistencia a uno o más insecticidas (Chandler y col.
2013).
La lombriz de tierra podría dar una solución alternativa para ayudar en la protección del
campo. Estudios han demostrado por un lado, que la vermicomposta, que es suelo
orgánico modificado producido por la lombriz de tierra a partir de residuos orgánicos,
permite a las plantas crecer más rápido, ser más productivas y menos susceptibles a las
pestes de artrópodos (Cardoza J. Y 2010) y microorganismos (Sharma y col. 2005). Y
por otro lado, el estudio del fluido celómico (FC) de la lombriz de tierra Eisenia fetida
que ha demostrado poseer propiedades aglutinantes, citotóxicas, proteolíticas,
hemolíticas y antibacteriales (Kobayashi y col. 2001).
13
1. MARCO TEÓRICO
1.1 La lombriz de tierra Eisenia foetida
1.1.1. Importancia
La lombriz está clasificada en el reino animal como anélido terrestre de la clase
oligoquetos, vive en ambientes húmedos, se nutre de restos orgánicos vegetales y
animales en descomposición, siendo un excelente recuperador. Hoy se conocen
aproximadamente 8,000 especies de lombrices, pero solo 3,500 de ellas se han estudiado
y clasificado, por lo que no todas las especies son aptas para la cría, ya que la mayoría
requiere condiciones muy precisas y difíciles de lograr; sin embargo, existe una especies
de lombrices que se adaptan al cautiverio (Maldonado G. A. M. 2011).
Las lombrices son invertebrados de agro ecosistemas que pertenecen a la familia
Lumbricidae y dominan suelos templados y tropicales. Pueden existir en diversos
hábitats, en materiales orgánicos como estiércol, composta, etc. que son altamente
atractivos para las lombrices, pero también son encontrados en ambientes cerrados muy
hidrofílicos tanto agua dulce como agua salobre. Además cabe mencionar que las
lombrices son generalmente clasificadas como saprófagos, pero basados en su hábitat
son clasificados como detritívoros. Siendo Eisenia foetida un ejemplo de las especies de
lombrices detritívoras. En cuanto a Eisenia foetida, también es conocida como lombriz
cebo; esta especie se la ha dado un muy común y amplio uso en el mundo; no solo a esta
especie, si no a las lombrices en general, entre estas aplicaciones al ser cultivadas son
para: mejorar y mantener fértil el suelo, para convertir el estiércol en residuos orgánicos,
para producir alimentos proteicos para ganado basados en lombrices, fuente de drogas y
vitaminas, como detoxificante natural y como una marca de cebo para peces. Otro uso
que se les ha dado a las lombrices, es en experimentos con jitomates y coles en Polonia
en donde encontraron que la vermicomposta podría ser usado como un biopesticida y
proteger a los vegetales de microorganismos. Por último las lombrices han sido
utilizadas como biomarcadores para monitorear los cambios en los ecosistemas. En estos
14
trabajos se usaron lombrices para evaluar el efecto de los contaminantes en el suelo con
metales pesados, pesticidas agrícolas, lluvia ácida, etc. Hay numerosos estudios en la
que los metales pesados influenciaron el crecimiento, reproducción y mortalidad de las
lombrices (Sharma y col. 2005).
1.1.2. Anatomía de la lombriz de tierra
A pesar de su sencillez, estos invertebrados tienen un buen desarrollo de su sistema
nervioso, aparato circulatorio, digestivo, excretor, muscular y reproductor. El cuerpo de
los anélidos se destaca por presentar una segmentación externa e interna, entonces la
pared del cuerpo está constituida de afuera hacia dentro por una cutícula (lámina muy
delgada, generalmente incolora), una epidermis (epitelio simple con células glandulares
que producen una secreción mucosa o serosa), las capas musculares, (una circular
externa y una longitudinal interna), el peritoneo (es una capa más interna y limita
exteriormente con el celoma de la lombriz) y el celoma (es una cavidad que contiene
líquido celómico, se extiende a lo largo del animal y envuelve el canal alimenticio). De
tal manera, que el líquido celómico o fluido celómico actúa como un sistema de
transporte entre la pared del cuerpo y la del tubo digestivo, facilitando la distribución de
los nutrientes, metabolitos y gases respiratorios, pudiendo almacenar temporalmente los
productos de desecho para ser excretados posteriormente. De acuerdo con experimentos
realizados, se ha reportado que el líquido celómico o fluido celómico de la lombriz de
tierra presenta varias actividades biológicas, tales como proteolíticas, hemolíticas,
antibacteriales, de hemaglutinación y citotóxicas (Maldonado G. A. M. 2011).
Cabe mencionar que estos componentes biológicamente activos pudieron otorgarle a las
lombrices un valor en la medicina antigua, cubriendo un rango de enfermedades que van
desde piorrea hasta la debilidad de posparto, de viruela ha ictericia e incluso
reumatismo. Las lombrices han sido usadas para reducir la fiebre debido a la actividad
15
antiperética y para pruebas de embarazo en mujeres. Incluso utilizado para curar la tos
crónica, diarrea y también para facilitar el parto (Sharma S. 2005).
Figura 1. Estructura anatómica de la lombriz de tierra
16
1.1.3. Toxicidad de fluido celómico y sus componentes
La lombriz de tierra Eisenia foetida (phylum Annelida, familia Lumbricidae) posee
cavidades en los segmentos de su cuerpo que están llenas de fluido celómico (Hrzenjak
y col. 1991). Este fluido posee varios componentes con actividad biológica, tales como
actividad hemolítica, hemaglutationica y citotóxica (Czurylo y col. 2008), bacteriostática
y bacteriolítica (Hrzenjak y col. 1991). La actividad hemolítica, es causada por varias
proteínas como las fetidinas, liseninas, eiseniaporos y hemolisinas (Procházková y col.
2006), que están implicadas en el sistema inmune de la lombriz. Presumiblemente la
función primaria de este sistema citolítico es destruir las membranas de células extrañas,
un mecanismo que causa la muerte de las células por la liberación del citosol, y es
atribuido a los celomocitos que secretan efectores humorales en el fluido celómico
(Lange y col. 1999).
Las proteínas hemolíticas de la lombriz Eisenia foetida fueron descritas por primera vez
en 1968 por Du Pasquier y Duprat quienes las nombraron Eisenia foetida andrei factor
(EFAF) y las caracterizaron en dos glicoproteínas de 40 y 45 KDa. Posteriormente, en
1997, fueron nombradas como fetidinas y mostraron actividad de peroxidasas. Además,
la unión de las fetidinas a la esfingomielina, que constituye parte de las membranas
plasmáticas de la mayoría de las células animales, forma canales de 10 nm a través de la
membrana lipídica. También ha demostrado actividad antibacteriana (Procházková
2006).
Otra proteína identificada en el FC de la lombriz Eisenia foetida fue eiseniaporo de 38
KDa. Se ha demostrado
que esta
proteína requiere de esfingomielina o
galactosilceramida para unirse a las membranas de los glóbulos rojos e inducir lisis de la
célula (Procházková 2006). Lange y col. (1999) demostraron que eiseniaporo es una
proteína que induce la formación de poros en las membranas que contienen
esfingomielina, produciendo la lisis en eritrocitos de mamífero. Estos poros se
caracterizan por ser canales de 10 nm en el exterior y 3 nm de diámetro en el interior.
17
Sin embargo puede ser inhibida por cationes y factores regulantes como la vitronectina,
heparina y lisofosfatidilcolina.
También se han descrito otras proteínas hemolíticas en el FC de la lombriz Eisenia
foetida, H1, H2 y H3, con masas moleculares de 46, 43 y 40 KDa. H1 y H2 han
mostrado poseer solo actividad lítica, mientras que H3 es capaz de ejercer actividad
lítica y hematoaglutinante (Procházková 2006).
La lisenina es una proteína bioactiva de 41KDa aislada del FC de la lombriz Eisenia
foetida, es diferente de las fetidinas, eiseniaporos y hemolisinas H1, H2, y H3. La
lisenina no ha sido reportada en otras especies animales (Kobayashi y col. 2006). Esta
proteína tiene la capacidad de unirse específicamente a la esfingomielina de la
membrana plasmática de varios tipos de células. Se ha observado es capaz de inducir
hemólisis en los eritrocitos de mamíferos, incluyendo a los humanos, citotoxicidad de
células como espermatozoides de algunas especies de invertebrados y varias especies de
vertebrados, así como células polimorfonucleares de cerdo de guinea, fibroblastos de
pollo, células del bazo y varias células tumorales. También se ha reportado toxicidad en
reptiles, anfibios, aves y mamíferos al administrarles lisenina por vía intravenosa
(Czurylo y col. 2008).
Los efectos citotóxicos pueden deberse al daño que la lisenina causa a la membrana
celular por su unión a la esfingomielina, formando poros en la membrana que alteran su
permeabilidad, provocando la muerte de la célula. Junto a esta propiedad, se ha
reportado que la lisenina puede causar efectos prominentes en la contracción del
músculo liso. Cuando se aplicó al músculo de la
aorta de rata, la toxina causó
contracciones largas y duraderas (Czurylo y col. 2008).
Cabe mencionar que se han caracterizado las moléculas encontradas en el FC, utilizando
diversos métodos analíticos, en donde se identificó la presencia de etil-nicotinato
(Rodríguez y col. 2008), el cual se ha se ha descrito que es una sustancia atrayente de
algunos insectos como los trips (El-Sayed y col. 2014).
18
1.2. Los insectos
1.2.1. Importancia de los insectos
Los insectos siempre han sido un factor importante en las vidas humanas. Ellos han
inspirado terror, fascinación, belleza y, a la vez, han sido un azote a la humanidad,
debido a que son causantes de las pérdidas de alimentos y enfermedades. No obstante, a
pesar de sus efectos negativos, dependemos de ellos para la polinización y por sus
productos. Siendo los insectos el más grande grupo de seres vivos en el planeta (75% de
todas las especies animales) (Resh y Cardé 2003). Estos organismos son tan variados en
forma y están adaptados a tan diversas condiciones de vida, que constituyen un grupo
muy especial para estudios fisiológicos. El estudio de la Fisiología constituye un campo
amplio, variado y asombroso (Llanderal y Cibrián 1983). Considérese simplemente el
hecho de que la clase de los insectos está constituida de 900,000 especies descritas
aproximadamente (Resh y Cardé 2003) que necesariamente tienen características
fisiológicas que difieren en menor o mayor grado entre sí. La necesidad de estudiar la
fisiología de los insectos es evidente, tanto por la importancia que tienen por sí misma,
como la relación con otras áreas de la entomología, así como con muy diversos campos
de la Biología. La Biología constituye parte esencial de la entomología básica y
aplicada, pues tiene relación estrecha tanto con la morfología, o el comportamiento de
los insectos, como con la toxicología de los insecticidas y otras formas decontrol de la
población de insectos (Llanderal y Cibrián 1983).
Probablemente la mejor justificación para cualquier investigación sobre insectos es que
los insectos tienen un impacto directo en la economía humana. Tan solo en los Estados
Unidos,
Causan pérdidas por billones de dólares en cultivos básicos, cultivos de frutas,
invernaderos y productos de viveros, además a productos forestales, ganado, granos
almacenados y alimentos, ropa, artículos de uso doméstico envasado y muebles, o tan
solo donde la gente intente cultivar o construir. Asimismo, pueden causar grandes
19
pérdidas de vidas humanas como vectores de patógenos, debido a que son vectores que
transmiten malaria, fiebre amarilla, dengue, tifus, varias formas de encefalitis, peste
negra, ceguera de los ríos e innumerables enfermedades que pueden debilitar o matar
(Resh y Cardé 2003).
Cabe mencionar que los insectos también generan beneficios económicos, tales como la
polinización de los cultivos, que en los Estados Unidos genera 9 billones de dólares en
ganancias cada año; además están los productos producidos por los insectos como la
miel, cera, laca, seda y otros productos que contribuyen con millones de dólares en
ganancias. También se debe mencionar el papel de los insectos en el control biológico
de las plagas y malezas, que generan ganancias adicionales (Resh y Cardé 2003).
1.2.2. Aspectos generales de la Anatomía externa de los insectos
En los insectos se reconocen tres áreas básicas de su cuerpo, que son la cabeza, el tórax
y el abdomen. Esta división se basa en las funciones que se encarga cada área de cuerpo
de insecto. La cabeza es para la orientación, ingestión y procesos cognitivos; el tórax
para la locomoción y el abdomen para la digestión y reproducción. Su cuerpo está
cubierto por un exoesqueleto endurecido que a su vez está formado por escleritos. Los
escleritos son áreas duras del cuerpo de los insectos que son llamados placas y son de
tamaños y formas variables variables (Resh y Cardé 2003).
La región cefálica o cabeza se localiza en la parte anterior del cuerpo del insecto. Se le
cataloga como el centro sensorial y alimentador del insecto. Se considera formada por la
unión de 6 a 7 segmentos o metámeros: Preantenular, antenular, intercalar,
superlingual, mandibular, maxilar y labial (Resh y Cardé 2003).
20
1.2.2.1. Región cefálica
La región cefálica se localiza en la parte anterior del cuerpo del insecto. Se le cataloga
como el centro sensorial y alimentador del insecto. Se considera formada por la unión de
6 a 7 segmentos o metámeros: Preantenular, antenular, intercalar, superlingual,
mandibular, maxilar y labial (Resh y Cardé 2003).
Desde el punto de vista filogenético la región cefálica o la cabeza de los insectos está
formada por el protocephalon que lleva los ojos, antenas y la boca, y el gnatocephalon
formado por tres segmentos cuyos apéndices se han transformado para la alimentación
(mandíbulas, maxilas y labio) (Resh y Cardé 2003).
Los anexos de la región cefálica son: Las piezas bucales (mandíbulas, maxilas y labio)
que se localizan por debajo del labrum, las antenas, los ojos compuestos y los ocelos
(Resh y Cardé 2003).
Las mandíbulas son el par anterior o primeras piezas bucales de los insectos, se localizan
por detrás del labrum. Son de forma triangular, con su superficie media provista de un
lóbulo incisivo dentado y de un lóbulo molar proximal (Resh y Cardé 2003).
Las maxilas están detrás de las mandíbulas y se componen de un Cardo, estípite,
lacinia, gálea, palpifer y palpo maxilar. Se utilizan para limpiar las antenas, palpos y
patas anteriores además de sostener el alimento (Resh y Cardé 2003).
El labio se localiza por detrás de las maxilas. Está formado por un par de apéndices muy
semejantes fusionados que representan a las segundas maxilas de los crustáceos. Está
compuesto por varias partes: Submentón, mentón, prementón glosas, paraglosas,
palpifers y palpos labiales. Es auxiliar en la retención y empuje del alimento (Resh y
Cardé 2003).
21
Figura 2. Morfología externa de la región cefálica de un insecto. A, Vista frontal de la
cabeza de Teneiopoda stali; B, Vista lateral. C, Vista posterior
22
1.2.2.2 Región de tórax
El tórax representa la segunda área del cuerpo de los insectos. En los insectos modernos,
consiste de tres segmentos denominados protórax, mesotórax y metatórax. En su
conjunto, los últimos dos, se les llama pterotórax, debido a que muchos insectos poseen
alas en estos segmentos. A la placa dorsal del protórax se le llama pronotum o
protergum, mesonoto o mesotergum a la de mesotórax y metanoto o metatergum a la del
metatórax. El tamaño y forma del protórax pueden ser muy variables, desde largas
placas como en los ortópteros, hemípteros y coleópteros, hasta reducidos en tamaño
formando una flecha entre la cabeza y el mesotórax como los himenópteros (Resh y
Cardé 2003).
El pterotórax incluye los segmentos torácicos inmediatamente posteriores del protórax.
En los insectos voladores la relación entre los segmentos torácicos implicados en el
vuelo puede ser complicado. El mesotórax y el metatórax de los insectos están separadas
por membranas. En los insectos voladores adultos muestran un mesotórax y metatórax
que están consolidadas para formar una unidad funcional modificada para volar (Resh y
Cardé 2003).
23
Figura 3. Segmentos que conforman el tórax.
1.2.2.3. Las patas de los insectos
Entre los anexos torácicos básicos que se describen se encuentran las patas, que se
presentan en número de tres pares, están articuladas en la región pleural de cada
segmento torácico. A las patas las constituyen los siguientes artejos o artículos: coxa,
trocánter, fémur, tibia y tarso (formado por 1-5 tarsómeros) y el pretarso (formado por 12 uñas) (Resh y Cardé 2003).
La coxa puede llevar dos lóbulos marginales en su base; el más largo se llama mero. El
trocánter representa el artejo basal del telopodito, casi siempre es muy pequeño y
triangular. El fémur es el artejo de mayor tamaño y el más fuerte de todos. La tibia es un
24
artejo muy delgado y el tarso es corto y se presenta casi siempre dividido (Resh y Cardé
2003).
En el pretarso se pueden localizar algunas estructuras accesorias, que son auxiliares en la
fijación o sujeción (Resh y Cardé 2003).
Figura 4. Pata de un insecto mostrando los artejos que la constituyen.
Las patas pueden variar en su forma de acuerdo a la función que desempeñen, así se
tienen varios tipos de patas de acuerdo a su función:
1) Pata saltadora.- Se caracteriza por presentar fémures muy desarrollados. Esta
modificación corresponde al tercer par. Ejemplo: Orthoptera, Siphonaptera,
Coleoptera.
2) Pata prénsil.- Pata provista de espolones y espinas agudas en fémur y tibia. Esta
modificación corresponde al primer par. Ejemplo: Mantodea.
25
3) Pata nadadora.- Sus artejos son aplanados y llevan largos cepillos de pelos en sus
bordes. Esta modificación corresponde al primero, segundo o tercer par. Ejemplo:
Hemiptera y Coleoptera acuáticos.
4) Pata excavadora.- Sus artejos son gruesos y fuertes y los artejos tibiales y tarsales
tienen forma de raspador. Esta modificación corresponde al primer par. Ejemplo:
Orthoptera y Coleoptera.
5) Pata corredora.- Con artejos muy delgados y largos. Esta modificación corresponde
al primero, segundo y tercer par. Ejemplo: Hymenoptera.
6) Pata sujetadora.- Sus artejos son gruesos con la tibia y el tarso en forma de gancho.
Esta modificación corresponde al primer par. Ejemplo: Coleoptera (Resh y Cardé
2003).
26
Figura 5. Diferentes tipos de patas por su función. A, Pata caminadora de coleóptero. B,
Pata saltadora de pulga. C, Pata prénsil de Mantis. D, Pata excavadora de un coleóptero.
E, Pata sujetadora de un coleóptero. F, Pata excavadora de coleóptero. G, Pata nadadora.
H, Pata saltadora e I, Pata suctora de coleóptero acuático.
27
1.2.2.4. Región abdominal
El abdomen está más conspicuamente segmentado que la cabeza y el tórax.
Superficialmente el abdomen es el menos especializado del cuerpo del insecto, pero hay
notables excepciones tales como las cochinillas (cocoideos). El abdomen carece de
apéndices, excepto por el cerco (órganos táctiles), los órganos reproductivos y los
apéndices pregenitales (Resh y Cardé 2003).
El abdomen de los insectos adultos consiste típicamente de 11 a 12 segmentos y es
menos esclerotizado que la cabeza y el tórax. Cada segmento abdominal está
representado por una esclerotización conocida como tergum (terguito), un esternum
(esternito), y además un pleurito. Los terguitos están separados unos de otros, del
esternito adyacente y de los pleuritos por una membrana. Los espiráculos (orificios por
donde respiran los insectos) están localizados en el área pleural (Resh y Cardé 2003).
Figura 6. Diagrama del abdomen segmentado de un insecto
28
Figura 7. Diagrama anatómico externo básico del grillo Achaeta domesticus.
29
1.2.3. Anatomía interna de los insectos
1.2.3.1. Anatomía del sistema circulatorio
Los insectos poseen un sistema circulatorio abierto, es decir, que sus órganos internos y
tejidos están bañados por la hemolinfa, que es activamente impulsado por toda la
superficie interna por bombas especializadas, pulsos de presión y movimientos del
cuerpo a través de los vasos, tubos y diafragmas, sin este constante movimiento, los
tejidos podrían morir. Los órganos y tejidos internos dependen del sistema circulatorio
para el intercambio de nutrientes, para acarrear productos de desechos y como una vía de
comunicación para mensajeros hormonales que coordinan el desarrollo y otros procesos
(Resh y Cardé 2003).
El sistema circulatorio provee de un medio en donde se libran batallas entre el insecto
hospedador
y microorganismos patógenos, entre los que incluyen bacterias, virus,
hongos e insectos parásitos. Los principales participantes en esta interacción son las
células sanguíneas o hemocitos (Resh y Cardé 2003).
El principal órgano responsable de la circulación es el vaso dorsal, el cual se extiende a
lo largo de la línea media dorsal del cuerpo y comprende dos regiones, el corazón que es
el órgano de bombeo y la aorta que funciona como un vaso conductor. En Periplaneta
americana (cucaracha común), el corazón se extiende desde el final del abdomen hasta
el primer segmento torácico, presentando dilataciones y un par de ostias verticales en
cada segmento (Llanderal y Cibrián 1983). El vaso dorsal está suspendido en el seno
pericardial, que está delimitado por la cutícula dorsal y el diafragma dorsal (en algunos
insectos). Las contracciones del vaso dorsal operan contra la fuerza del tejido conectivo
lateral, que es el responsable de la dilatación o apertura del vaso dorsal (en diástole)
seguido del golpe de contracción, también llamado sístole o contracción sistólica (Resh
y Cardé 2003).
30
El vaso dorsal de los insectos adultos tiene forma de una flecha elástica tubular llamada
aorta torácica y una larga porción abdominal que convencionalmente es llamada el
corazón del insecto (Slama K 2012). A lo largo del vaso dorsal se encuentran orificios
llamados ostias que se posicionan a cada lado y cada segmento del corazón abdominal.
Las ostias más comunes permiten fluir a la hemolinfa en el vaso dorsal y contienen
válvulas que previenen el reflujo, a estos se les conoce como ostias incurrentes. Sin
embargo algunos insectos tienen abierto sus válvulas a través del cual la hemolinfa se
mueve constantemente; a estos se les conoce como ostias excurrentes (Resh y Cardé
2003).
Figura 8. La hemolinfa llega a todos los tejidos y estructuras para asegurar la
circulación a través de los órganos pulsátiles (APO), aorta (A), vaso dorsal (DV),
diafragma dorsal (DD), válvulas ostiales (OS) y los septos (S). El cordón nervioso
ventral está asociado al diafragma ventral (VD).
El vaso dorsal está compuesto de células musculares (colectivamente llamado
miocardio) que se posicionan a veces como pares opuestos y otras veces como bandas en
espiral para formar un cilindro en el vaso dorsal. El miocardio en todos los insectos es
espontáneamente activo y usualmente inicia desde el estado embrionario. Este tipo de
31
corazón es denominado miogénico. Esto es en contraste a un corazón neurogénico como
el que presentan los crustáceos como los cangrejos y las langostas, en la que una barrera
de nervios manda impulsos nerviosos al corazón desde un ganglio central cardiaco (Resh
y Cardé 2003).
El miocardio está segmentalmente prearreglado, con varios pares de válvulas ostiales,
músculos perpendiculares y células nutritivas pericardiales. En general el corazón de los
insectos es un órgano tubular, propagando ondas de contracciones peristálticas hacia
adelante (larvas), o en dirección hacia adelante y hacia atrás, que es como se conoce al
latido retrogrado (pupas y adultos). En consecuencia, el corazón de los insectos es
mayormente usado para mezclar la hemolinfa en las cavidades cefálica, torácica y
abdominal del cuerpo del insecto. Debido al limitado, pero muy económica capacidad de
bombeo de su corazón, los insectos han desarrollado adaptaciones auxiliares
circulatorias, tales como la presencia de órganos pulsátiles de los apéndices, pulsaciones
peristálticas del intestino o fuertes pulsaciones extracardiacas hemocelómicas (Slama K
2012).
Los insectos, poseen mecanismos reguladores del corazón similares al de los humanos,
como los mecanismos miogénicos basados en la despolarización de las células
miocárdicas. El nodo atrioventricular y sinoauricular en humanos, y el nodo regulador
terminal en el corazón de los insectos. Sin embargo, hay diferencias muy importantes
entre los humanos y los insectos, entre ellas, los insectos no poseen un sistema
circulatorio cerrado; su sangre, la hemolinfa, circula a través de 3 grandes
compartimientos (cabeza, torax y abdomen) que está mutuamente interconectadas y
forman una cavidad corporal abierta o cavidad hemocelómica (Slama K 2012).
En preparaciones de corazón de insecto se ha estudiado la acción de diversas sustancias,
tales como la acetilcolina, algunas hormonas y otros productos, que puede modificar la
frecuencia cardiaca. Otro factor que altera el funcionamiento del corazón en los insectos
es la temperatura (Llanderal y Cibrián 1983).
32
Figura 9. Parte del diafragma dorsal de un “zangano” con los órganos asociados a él
vistos por abajo.
En la hemolinfa se encuentran las células nucleadas denominadas hemocitos, que
intervienen en los fenómenos de fagocitosis, transporte de nutrientes y hormonas,
desintoxicación y formación de tejido conectivo (Llanderal y Cibrián 1983).
33
1.2.3.2. Sistema muscular
El músculo es un tejido excitable y contráctil de los animales que es responsable del
movimiento y el comportamiento (Dvorkin y Cardinali2003). Aunque hay una gran
variabilidad en la estructuras y desempeño entre diferentes músculos de los insectos,
muchas
características
básicas
de
la
composición
bioquímica,
organización
ultraestructural y desempeño contráctil son comunes entre los músculos de los insectos,
además de que comparten similitudes con los vertebrados.
1.2.3.2.1. Músculo esquelético
El músculo esquelético de los insectos está formado por células elongadas, con forma de
haces y multinucleadas llamas células musculares. Estas células o fibras musculares se
insertan en el extremo del exoesqueleto. Los músculos típicamente abarcan
articulaciones del exoesqueleto y, cuando se activa, causan la flexión de la articulación.
Debido a esto, los músculos están implicados en el comportamiento, postura y la
locomoción. En adición al músculo esquelético, los insectos cuentan con músculos
viscerales que producen el movimiento del intestino, túbos de Malpighi y partes del
sistema reproductivo; también está el músculo cardiaco que causa la contracción de los
tejidos del vaso dorsal y vasos asociados al sistema circulatorio. Los músculos viscerales
y cardiacos son pequeños, en forma de huso y con un solo núcleo (Resh y Cardé 2003).
Los insectos cuentan con muchos músculos morfológicamente identificables, de los
cuales, una gran cantidad de músculos son consecuencia de la organización segmental de
los insectos y la consecutiva replicación de partes asociadas con la segmentación. Por
ejemplo, cada una de las alas que soportan las alas en la cucaracha cuentan con
aproximadamente 50 músculos separados (Resh y Cardé 2003).
En la mayoría de los músculos en los insectos, las fibras se posicionan en paralelo una
sobre otra, y cuando el músculo se contrae se acortan a lo largo del eje del haz de fibras
34
(Figura 10). En algunos músculos, en particular los músculos periféricos de las patas de
los insectos, las fibras se unen oblicuamente un extremo sobre una interna, siendo la
extensión cuticular llamada apodema (Figura 1). Cuando estos músculos se activan, los
músculos se acortan a lo largo del eje del apodema, oblicuo al eje de las fibras. La
inserción oblicua en el opodema es un recordatorio de la unión oblicua entre los
filamentos laterales y el eje principal, como en una pluma. Por lo que los músculos con
un arreglo oblicuo son llamados pinados. El arreglo pinado de los músculos incrementa
de forma efectiva el área de la sección transversal y la fuerza que los músculos puede
producir (Resh y Cardé 2003).
Figura 10. Músculo con fibras paralelas (izquierda) y fibras pinadas (derecha). Las
fibras musculares en paralelo son los músculos mesotorásicos dorsales para el vuelo en
el tettigónido Neoconocephalus robustus. La estructura oscura que pasa a través de la
superficie del músculo es la motoneurona que inerva al músculo. Los músculos con
fibras pinadas pertenece a la tibia mesotorásica extensora del grillo Teleogryllus
oceanicus. Las abreviaciones: N, motoneurona; Tr, traquea; A, apodema.
35
1.2.3.2.2. Estructura de los músculos
La máquinaria contráctil está representada por las miofibrillas, compuestas por unidades
contráctiles denominadas sarcómeras de 2,2 µm de longitud y un ancho equivalente a la
miofibrilla. Con el microscopio electrónico se puede ver una estructura electro densa
denominada disco Z que separa una sarcómera de otra. Este disco se encuentra ubicado
en una región poco densa llamada la banda I (por isotrópica) en donde solamente hay
filamentos finos. Estas bandas alternan con otras denominadas bandas A (por
anisotrópica) donde se hallan filamentos gruesos y finos, en la parte media de las bandas
A, se encuentra la banda H de menor densidad (donde solo hay filamentos gruesos). Las
distintas bandas sufren variaciones periódicas que se deben a la superposición de las
proteínas citoesqueléticas (Mohman y Heller, 2007).
Figura 11. Estriación transversa del músculo esquelético. Imagen tomada desde el
microscopio electrónico, el cual, es una sección de fibra del área del mesotórax dorsal
del músculo longitudinal del tettigoniido Neoconocephalus ensiger. La escala está
representada en 1µm. Las abreviaciones: M, mitocondria; I, banda I; Z, disco Z; A,
banda A.
36
Un sarcómero está compuesto por diferentes tipos de filamentos:
Filamentos gruesos: la miosina constituye la principal proteína del filamento grueso. La
molécula de miosina está formada por 2 cadenas polipeptídicas de 220 KD cada una
(cadenas pesadas) y por 4 polipéptidos de 20 KD cada uno (cadenas livianas). Está
organizada en tres dominios estructuralmente y funcionalmente distintos: cabeza, cuello
y cola. En el extremo amino terminal las dos cadenas pesadas presentan una estructura
globular, llamada cabeza, la que se continúa en una zona con forma en bastón, de unos
150 nm de largo, cuya porción inicial corresponde al cuello de la molécula y el resto a la
cola (Ulate y col. 2006). En el músculo estriado, cada filamento grueso es una estructura
bipolar formada por la asociación antiparalela de alrededor de 200 a 400 moléculas de
miosina. La región central del filamento está compuesta de un conjunto de colas
dispuestas en forma traslapada y antiparalela. Los filamentos gruesos son simétricos a
nivel de la región central y su polaridad se revierte a ambos lados de ambos lados de esta
zona. Las cabezas protuyen del filamento en un ordenamiento helicoidal a intervalos de
14 nm. En la molécula de miosina existen dos sitios que pueden experimentar cambios
conformacionales: uno a nivel de la unión de la cabeza con la cola y otro a nivel de sitio
en que el inicio de la cola se une al cuello de otras moléculas de miosina. Estas
modificaciones se relacionan con las interacciones que establece la miosina con ATP y
G-actina (Ulate y Ulate 2006).
Filamentos delgados: están compuestos por 3 tipos de proteínas: la actina F, que forma
una doble hélice a partir de la actina G; la tropomiosina que también tiene forma de
hebra y se asocia a cada uno de los monómeros de la actina y la troponina, que está
constituida por tres subunidades distintas: la troponina T (TnT) que se une a la molécula
de tropomiosina; la troponina l (TnT) que está unida a la actina, en una posición que
bloquea los centros de unión que existen en la actina para la miosina y la troponina C
(TnC) la cual tiene dos dominios: uno de ellos, sería el correspondiente a la terminal
amino y el otro a la terminal carboxilo; en cada uno de los dominios existen dos centros
de unión al Ca2+ (Ulate y Ulate 2006).
37
Filamentos intermedios: como la titina, la desmina y la vimentina. La titina es una
proteína fibrosa, una de las más largas que se conoce. Actúa como un muelle
manteniendo a la miosina en su posición y debido a que tiene una parte elástica, actúa
como resorte recuperando la longitud de la miofibrilla después de la contracción
muscular (Ulate y Ulate 2006).
Figura 12. Estructura de los filamentos gruesos y delgados. (a) Un filamento grueso
(arriba). Las colas de miosina forman el tallo del filamento grueso, mientras que las
cabezas de miosina se proyectan hacia los filamentos delgados circundantes. (b) los
filamentos delgados contienen actina, troponina y tropomiosina.
38
Figura 13. Organización estructural de una fibra muscular rápida de un insecto. El
dibujo está basado en la micrografía electrónica del músculo de un tettigoniido. Las
abreviaciones: A, banda A; I, banda I; M, mitocondria; SR, retículo sarcoplásmico; T,
túbulo transverso; Z, disco Z.
39
1.2.3.2.3. Inervación y activación de los múscilos
Las células nerviosas en el sistema nervioso central envían señales (axón motor) a las
fibras musculares donde hacen contacto las terminales nerviosas. Un axón motor hace
muchos contactos a lo largo de cada fibra muscular que inerva (inervación
multiterminal), de tal manera que una sola fibra muscular recibe señales de más de un
solo axón motor (inervación polineural). Los impulsos inician en el sistema nervioso
central y viajan a lo largo del axón motor provocando la liberación de señales químicas
específicas (transmisión) de las terminales del axón motor en la sinapsis. La transmisión
liberada de la mayoría de los axones motores permite la despolarización en el potencial
transmembranal de la fibra muscular por acción de la terminal nerviosa. La
despolarización de la fibra muscular inicia la contracción de la fibra muscular. El axón
motor que despolariza las fibras musculares y causa la contracción muscular es llamado
axón excitatorio. Algunos axones son denominados axones inhibitorios debido a que
liberan la transmisión que estabiliza el potencial transmembranal de la fibra muscular o
incluso la hace más grande, antagonizando así las impulsos excitatorios. Además del
impulso excitatorio e inhibitorio neural, muchos músculos reciben impulsos de neuronas
motoras moduladoras, que activan la liberación de químicos que modifican el
rendimiento del músculo, por ejemplo, el incremento de la fuerza muscular y la
velocidad de relajación (Resh y Cardé 2003).
Muchos insectos son extremadamente pequeños y por esto sus músculos han sufrido una
reducción de tamaño, la cual no ha sido proporcional en el grosor de las fibras
musculares, sino más bien una reducción en cuanto a número. Algunos músculos de
insectos pequeños están reducidos únicamente a una o dos fibras. Un prerrequisito para
el funcionamiento eficiente de tales unidades es el control gradual de la contracción de
la fibra muscular, a través de la inervación polineural y multiterminal. En los músculos
de los insectos la porción y extensión de la despolarización de la membrana muscular y
en su momento de la contracción, son dependientes de la frecuencia de exitación del
nervio motor (Llanderal y Cibrián 1983).
40
La mayoría de los músculos de artrópodos tienen un solo axón que abastece al músculo
entero e incluso pueden inervar a dos o tres fibras musculares. Otros músculos,
especialmente aquellos que en algunas ocasiones necesitan realizar contracciones
rápidas y vigorosas, tienen un segundo axón que inerva a las fibras musculares, como
sucede en los músculos de la tibia posterior de muchos ortópteros. Este axón da un
incremento en el potencial postsináptico de la unión neuromuscular, con lo que
contribuye a la elevación en la despolarización de la membrana sarcostílica de la fibra y
por consiguiente una contracción más enérgica. A este tipo de axón se le denomina
rápido y al que da respuestas de menor intensidad se le ha llamado axón lento, el cual es
el responsable de movimientos suaves, lentos y bien controlados de las tibias de las patas
saltadoras de los ortópteros durante la acción de caminar (Llanderal y Cibrián 1983).
1.2.3.2.4. Mecanismo general de la contracción del músculo
La secuencia de eventos que se produce durante una contracción del músculo es la
siguiente: inicialmente, un potencial de acción se desplaza por el sarcolema, incluidos
los túbulos T. Durante la fase de la meseta de potencial, se produce el ingreso de Ca2+ en
los miocitos a través de los canales tipo L. Este Ca2+ que ingresa funciona como
mensajero para producir la liberación de calcio del reículo sarcoplásmico. El fenómeno
se conoce como “liberación de Ca2+ inducida por Ca2+” y ocurre a través de canales que
están presentes en la membrana del retículo sarcoplásmico y que se conocen con el
nombre de receptores de rianodina tipo 2 (RyR2). Los RyR2 se localizan próximos a los
canales de Ca2+ tipo L, formando unidades funcionales llamadas “couplon”, las cuales
constan de aproximadamente 100 RyR2 junto con 25 canales tipo L. El Ca2+ que ingresa
desde el exterior celular interactúa con los RyR2 y produce su apertura. Al abrirse los
RyR2, el calcio que se encuentra almacenado dentro del RS sale, con lo que aumenta la
concentración de Ca2+ en el citosol. El Ca2+ liberado se une a la Troponina C. El
complejo Ca2+ troponina produce el el desplazamiento de la tropomiosina del surco de la
actina en que estaba ubicada. Ese desplazamiento deja descubiertos los sitios de la actina
a los cuales se unen las cabezas de la miosina (puentes cruzados) (Ulate y Ulate 2006).
41
La interacción entre la actina y las cabezas de miosina permite que ocurra el ciclo de los
puentes cruzados y de esa manera se produzca el acortamiento, es decir, la contracción.
Para que se dé este ciclo, es necesario que se hidrolice el ATP y que las cabezas de la
miosina interaccionen con los sitios descubiertos de la actina. La frecuencia de los ciclos
de los puentes cruzados determina la velocidad de acortamiento del músculo. Cuando
cesan los potenciales de acción que recorren el sarcolema, la concentración de Ca2+
citosólico comienza a disminuir, provocando que la tropomiosina cubra nuevamente los
sitios de la actina que interaccionan con los puentes cruzados. Al cubrirse los sitios de
interacción, cesa el deslizamiento y el sacómero recupera la longitud que tenía antes de
la contracción, es decir, ocurre la relajación muscular. La concentración de Ca2+
citosólico disminuye por la recaptación de calcio en el RS debida a la Ca2+- ATPasa
presente en la membrana de RS de los miocitos, o por la salida de este catión de la
célula, gracias a la Ca2+-ATPasa del sarcolema y al antiportador 3Na+/1 Ca2+ también
presente en el sarcolema. La actividad de la Ca2+-ATPasa es regulada por una proteína
llamada fosfolamban: cuando el fosfolamban está defosforilado, inhibe a esta bomba
(Ulate y Ulate 2006).
42
Figura 14. Ciclo de la contracción, las sarcómeras se acortan en ciclos repetidos,
durante las cuales las cabezas de miosina (puentes cruzados) se unen a la actina, giran y
se separan de la misma.
43
Figura 15. Función de los iones del Ca2+ en la regulación de la contracción por la
troponina y la tropomiosina (a) durante la relajación son bajos los niveles de Ca2+ en el
sarcoplasma, a causa del bombeo del retículo sarcoplásmico por las bombas de
transporte activo de Ca2+. (b) Un potencial de acción muscular se propaga a lo largo de
los túbulos T y abre los canales de liberación de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico; los
iones de calcio pasan al citosol y se inicia la contracción.
44
1.2.3.2.5. El músculo liso
Al igual que el miocardio, el tejido de músculo liso suele activarse de forma
involuntaria. (Tortora y Grabowski 2003). El musculo liso de los distintos órganos es
distinto del de la mayor parte de los demás en varios sentidos: 1) dimensiones físicas; 2)
organización en fascículos o láminas; 3) respuesta a diferentes tipos de estímulos; 4)
características de la inervación, y 5) función (Hall J. E. 2011). De los tipos de músculo
liso, el más común es el tejido de músculo liso visceral o unitario (Tortora y Grabowski
2003), el cual es una masa de cientos a miles de fibras musculares lisas que se contraen
juntas como una única unidad. Las fibras habitualmente están dispuestas en láminas o
fascículos, y sus membranas celulares están adheridas entre sí en múltiples puntos, de
modo que la fuerza que se genera en una fibra muscular se puede transmitir a la
siguiente. Además, las membranas celulares están unidas por muchas uniones en
hendidura a través de las cuales los iones pueden fluir libremente desde una célula
muscular a otra, de modo que los potenciales de acción o el flujo iónico simple sin
potenciales de acción puede viajar desde una fibra a otra y hacer que las fibras
musculares se contraigan simultáneamente. Este tipo de musculo liso también se conoce
como músculo liso sincitial debido a sus interconexiones sincitiales entre las fibras.
También se denomina musculo liso visceral porque se encuentra en la pared de la mayor
parte de las vísceras del cuerpo, por ejemplo el aparato digestivo, las vías biliares,
muchos vasos sanguíneos, entre otros (Hall J. E. 2011).
Músculo liso multiunitario está formado por fibras musculares lisas separadas y
discretas. Cada una de las fibras actúa independientemente de las demás y con
frecuencia esta inervada por una única terminación nerviosa, como ocurre en las fibras
musculares esqueléticas. Además, la superficie externa de estas fibras, al igual que en el
caso de las fibras musculares esqueléticas, está cubierta por una capa delgada de
sustancia similar a una membrana basal, una mezcla de colágeno fino y glicoproteínas
que aísla las fibras separadas entre sí. La característica más importante de las fibras
musculares lisas multiunitarias es que cada una de las fibras se puede contraer
45
independientemente de las demás, y su control se ejerce principalmente por señales
nerviosas (Hall J. E. 2011).
Figura 16. Músculo liso multiunitario (A) y músculo unitario (B)
1.2.3.2.6. Anatomía del músculo liso
El endomisio rodea a las fibras del músculo liso, que son mucho más pequeñas que las
de los músculos esqueléticos. Una sola fibra relajada de músculo liso tiene de 30 a 200
µm de longitud, es más gruesa en su posición media (3 a 8 µm) y se angosta en los
extremos. Cada fibra contiene un núcleo en forma ovalada y en ubicación central. El
sarcoplasma de las células del músculo liso posee filamentos gruesos y delgados, si bien
no están dispuestos ordenadamente en sarcómeras, a diferencia de los músculos
estriados. Las fibras del músculo liso también contienen filamentos intermedios. Puesto
46
que los filamentos no se sobreponen con regularidad, las fibras de músculo liso no
poseen estrías, de lo cual se deriva el calificativo de liso, además carecen de túbulos T y
en ellas es escaso el retículo sarcoplásmico para el almacenamiento de iones de calcio
(Tortora y Grabowski 2003). En el músculo liso también falta el “interruptor” troponina;
este lo desempeña la caldesmona, que se une a la tropomiosina parando así la interacción
actina-miosina. Este efecto inhibidor se puede anular alostéricamente mediante la unión
de Ca+2-calmodulia a caldesmona o mediante la modificación covalente de la
caldesmona vía fosforilación (Müller-Esterl 2008).
En las fibras del músculo liso, los filamentos intermedios están insertados en estructuras
llamadas cuerpos densos, que tienen una función similar a los discos Z de las fibras del
músculo estriado. Algunos cuerpos densos están dispersos en el sarcoplasma, mientras
que otros se unen en el sarcolema. Los haces de filamentos intermedios se extienden de
un cuerpo denso a otro. Durante la contracción, el mecanismo de deslizamiento de los
filamentos gruesos y delgados genera tensión, que se transmite a los filamentos
intermedios. A su vez estos filamentos tiran de los cuerpos densos insertados en el
sarcolema, lo cual produce el acortamiento de la fibra muscular. Las fibras del músculo
liso se contraen a modo similar a un sacacorchos que gira; la fibra se tuerce en una
hélice al contraerse y gira en dirección opuesta al relajarse (Tortora y Grabowski 2003).
47
Figura 17. Estructura física del musculo liso. La fibra de la parte superior izquierda
muestra los filamentos de actina que irradian desde los cuerpos densos. La fibra de la
parte inferior derecha y el diagrama del lado derecho muestran la relacion de los
filamentos de miosina con los filamentos de actina.
48
1.2.3.2.7. Comparación de la contracción del músculo liso con la
contracción del músculo estriado
Aunque la mayor parte de los músculos esqueléticos se contraen y relajan rápidamente,
la mayor parte de las contracciones del musculo liso son contracciones tónicas
prolongadas, que a veces duran horas o incluso dias. Por tanto, cabe esperar que las
características físicas y químicas de la contracción del músculo liso sean diferentes de
las del musculo esquelético. A continuación se presentan algunas diferencias:
Ciclado lento de los puentes cruzados de miosina. La rapidez del ciclado de los
puentes transversos de miosina en el musculo liso (es decir, su unión a la actina, su
posterior liberación de la actina y su nueva unión para el siguiente ciclo) es mucho más
lenta que en el musculo esquelético; de hecho, la frecuencia es tan baja como 1/10 a
1/300 de la del músculo esquelético. A pesar de todo, se piensa que la fracción de
tiempo que los puentes cruzados permanecen unidos a los filamentos de actina, que es
un factor importante que determina la fuerza de la contracción, está muy aumentada en
el músculo liso (Hall J. E. 2011).
La fuerza máxima de contracción muscular es a menudo mayor en el musculo liso
que en el músculo esquelético. A pesar de la escasez relativa de filamentos de miosina
en el musculo liso, y a pesar del tiempo lento de ciclado de los puentes cruzados, la
fuerza máxima de contracción del musculo liso es con frecuencia mayor que la del
músculo esquelético, hasta 4 a 6kg/cm2 de área transversal para el musculo liso, en
comparación con 3 a 4kg para el músculo esquelético. Esta gran fuerza de la contracción
del músculo liso se debe al periodo prolongado de unión de los puentes cruzados de
miosina a los filamentos de actina (Hall J. E. 2011).
Tensión-relajación del musculo liso. Otra característica importante del musculo liso,
especialmente del tipo unitario visceral de musculo liso de muchos órganos huecos, es
su capacidad de recuperar casi su fuerza de contracción original segundos a minutos
49
después de que haya sido alargado o acortado. Por ejemplo, un aumento súbito del
volumen de la vejiga urinaria, que produce distensión del musculo liso de la pared de la
vejiga, produce un gran aumento inmediato de presión en la vejiga. Sin embargo, en los
15 s a 1 min siguientes, a pesar de la distensión continuada de la pared de la vejiga, la
presión casi recupera su nivel original. Posteriormente, cuando se aumenta el volumen
en otro escalón, se produce de nuevo el mismo efecto (Hall J. E. 2011).
Por el contrario, cuando se produce una reducción súbita de volumen, la presión
disminuye drásticamente al principio, aunque después aumenta en un plazo de otros
pocos segundos o minutos hasta el nivel original o casi hasta el mismo. Estos fenómenos
se denominan tensión-relajación y tensión-relajación inversa. Su importancia es que,
excepto durante breves periodos de tiempo, permiten que un órgano hueco mantenga
aproximadamente la misma presión en el interior de su luz a pesar de grandes cambios
de volumen a largo plazo (Hall J. E. 2011).
1.2.3.3. Anatomía del sistema digestivo
El sistema digestivo consiste del canal alimentario y glándulas salivales, es responsable
de todos los pasos para el procesamiento de los alimentos: digestión, absorción y
liberación de heces fecales. Estos pasos ocurren a lo largo del intestino que consta de
tres partes, una anterior (intestino anterior), una media (intestino medio) y otra posterior
(intestino posterior). El intestino posee células cubiertas por una cutícula en el intestino
anterior y posterior, mientras que en el intestino medio, las células poseen una estructura
similar a una película conocida como membrana peritrófica. Las glándulas salivales
están asociadas con el intestino anterior y son importantes para la entrada de la comida,
pero usualmente no para la digestión (Resh y Cardé 2003).
50
1.2.3.3.1. Morfología y función del intestino
La figura 16 muestra un diagrama general del intestino del insecto. El intestino anterior
inicia en la boca e incluye el cibarium (la cavidad preoral formado por las partes de la
boca), la faringe, el esófago y el estómago (una porción dilatada como en la figura 17 A
o un divertículo como en la figura 17 K). El estómago es un órgano de almacenaje en
muchos insectos y también en otros, es un sitio para la digestión. El intestino anterior
está cubierto por una cutícula que no es permeable a moléculas hidrofílicas y en algunos
insectos está reducido a un tubo recto (Figura 17 F). El proventrículo es un órgano de
trituración en algunos insectos, mientras que en la mayoría de los insectos, está provista
de una válvula que controla la entrada de alimento al intestino medio; el cual es el
principal sitio de digestión y absorción de nutrientes (Resh y Cardé 2003).
Figura 18. Diagrama general del intestino de un insecto
51
El intestino medio incluye un simple tubo (ventrículos) a partir del cual los ciegos
gástricos en forma de sacos pueden ramificarse. En la mayoría de los insectos el
intestino medio está cubierto con una estructura anatómica en forma de película
(membrana peritrófica) que separa el contenido del lumen en dos compartimientos: el
espacio endoperitrófico (dentro de la membrana peritrófica) y el espacio ectoperitrófico
(fuera de la membrana peritrófica) (Resh y Cardé 2003).
La región del esfínter (píloro) separa al intestino medio del intestino posterior, los tubo
de Malpighi se ramifican fuera del intestino y son órganos excretores que
individualmente está vacíos en el intestino y pueden unirse para formar un uréter
(Figura 17 B); pero en algunas especies está ausente (Figura 17 O) (Resh y Cardé
2003).
El intestino posterior incluye el íleon, el colon y el recto (que están implicados en la
absorción de agua e iones), terminando con el ano. El intestino posterior está cubierto
por una cutícula (usualmente impermeable); aunque en algunos insectos lo tiene
reducido a un tubo recto (Figura 17 G), en otros, está modificada como una cámara de
fermentación (Figura 17 F) o barriga (Figura 17 D) (Resh y Cardé 2003).
52
Figura 19. Tipos de intestinos en la mayoría de insectos: Ad, adulto; AV, ventrícluo
anterior (intestino medio); C, estómago; Co, colon; E, esófago; F, cámara de
fermentación; FC, cámara de filtración; G, intestino medio; I, íleon; La, larva; M, tubos
de Malpighi; P, proventrículos; Pa, panza; PV, ventrículo posterior (intestino medio); R,
recto; V, ventrículo.
53
1.2.4. Aspectos generales de los Ortópteros
Los ortópteros (orden Ortóptera), que incluyen saltamontes, grillos y saltamontes
longicornios, incluye 30,000 especies descritas, los cuales en su mayoría son lo
suficientemente grandes para ser vistos. Aunque este orden puede ser encontrado en
muchos hábitats, incluyendo cuevas, ambientes acuáticos, e incluso en glaciares, entre
otros. Se caracterizan por tener tórax con un gran pronoto, un par de patas saltadoras
(Tercer par de patas), primer par de alas modificado a tecminas, los machos con órganos
estridulantes (Resh y Cardé 2003).
El nombre de este orden de insectos, Orthoptera, es derivado del griego ortos y pteron,
que quiere decir “alas derechas”; sin embargo poseen muchos nombre comunes, entre
ellos destacan el de los saltamontes y grillos. La clasificación más común divide a los
ortópteros en dos grandes grupos: los Ensifera, que incluyen a varias clases de grillos de
cueva, los saltamontes y los verdaderos grillos; y los Caelifera, los saltamontes con
cuernos cortos, los urogallos langostas y otros (Resh y Cardé 2003).
Los saltamontes, chapulines y grillos se encuentran usualmente alimentándose de la
vegetación, en campo abierto, pero otros, como los grillos camello, son depredadores
que cazan en la noche. Algunas especies de grillos y saltamontes son encontrados en
árboles y arbustos. Los grillos topo (Tridactylidae), son acuáticos y usan sus patas
posteriores para nadar (Resh y Cardé 2003).
Este orden tiene importancia económica, debido a que varias especies de langostas son
consideradas como pestes causando cada año severos daños en los campos y praderas de
los Estados Unidos, afectando las planicies del norte y este de Washington, el este de
Minesota y del sur al norte de Texas (Resh y Cardé 2003).
54
Figura 20. Diferentes especies de ortópteros: B, Xanthogryllacris punctipennis; C,
Hadenoecus puteanus; D, Schizodactylus monstrosus; E, Apote notabilis; F, Henicus
prodigiosus ;G, Dianemobius fascipes; H, Oecanthus pellucens,; I, Stolliana sabulosa
55
1.2.5. Aspectos generales de los Coleópteros
Los coleópteros (orden Coleoptera) que incluyen escarabajos y gorgojos, son el orden
más grande en el reino animal, tiene aproximadamente tantas especies como todo el
reino de las plantas, incluyendo a demás algas y hongos. Las especies de este orden
ocupan hábitats tanto terrestres, como acuáticos; algunas son ectoparásitas; otras son
endoparásitas (Arnett H. 2000). Los escarabajos comprenden el 25% de todos los
animales y plantas descritos. Se han descubierto aproximadamente 350 000 especies,
siendo el orden de seres vivos más grande sobre la tierra (Resh y Cardé 2003).
Se caracterizan por tener alas modificadas llamados élitros que son duros y protegen sus
alas posteriores
que son delicadas. Poseen patas de tipo corredoras, cavadoras y
nadadoras que les permite adaptarse a diversos hábitats (Resh y Cardé 2003).
La mayoría de los escarabajos son herbívoros, fungívoros o depredadores carnívoros
tanto en el estadio larvario como en los adultos. Muchos son considerados como pestes
en nuestras casas, en el bosque, en el campo y productos almacenados; no obstante,
algunas especies son consideradas beneficiosas al ser empleadas como agentes de
control biológico (Resh y Cardé 2003).
El nombre técnico de los escarabajos es Coleoptera y fue acuñado por Aristóteles,
basándose en lo duro que son las alas en forma de escudo de los coleópteros (coleo =
escudo + ptera = alas). Aunque muchos otros órdenes de insectos poseen alas protectores
endurecidas, los escarabajos son considerados como un grupo monofilético que se
caracterizapor lo siguiente:
1.- Un ciclo de vida donde los estadios larvarios se separan del desarrollo adulto por un
estadio de pupa.
2.- Poseen alas endurecidas llamados élitros (alas anteriores), que lindan medialmente.
El vuelo es impulsado por las alas metatorácicas, que se doblan longitudinalmente y por
56
lo general transversalmente para luego unirse bajo los élitros cuando el escarabajo está
caminando o descansando. El escutelo mesotorácico es visible como un triángulo y está
situado en medio, entre las bases de los dos élitros.
3.- La forma del cuerpo generalmente es deprimida, por lo que las patas están situadas
en la superficie ventral del cuerpo. Las bases de las patas o coxas están metidas dentro
de las cavidades formadas por una pesada esclerotización torácica.
4.- Los esternitos son mucho más pesados y esclerotizados que los terguitos
5.- Sus antenas generalmente poseen 11 o menos segmentos (Resh y Cardé 2003).
Figura 21. Vista dorsal de un coleóptero.
57
2. HIPÓTESIS
H0: El fluido celómico de la lombriz Eisenia foetida aumenta la frecuencia cardiaca en
los insectos del orden Coleoptera y Orthoptera.
H0: El fluido celómico de la lombriz Eisenia foetida puede afectar la locomoción de los
insectos del orden Coleoptera y Orthoptera.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Evaluar los efectos tóxicos del fluido celómico de la lombriz Eisenia foetida en los
insectos de orden Coleoptera y Orthoptera mediante pruebas de evaluación fisiológicas
como son las preparaciones cardiacas y neuromusculares de la pata de dichos
organismos.
3.2. Objetivos específicos
Evaluar los efectos tóxicos del fluido celómico de lombriz Eisenia foetida sobre el vaso
dorsal de los insectos del orden Coleoptera y Orthoptera.
Evaluar los efectos tóxicos del fluido celómico de lombriz Eisenia foetida sobre el
músculo de la pata trasera de los insectos del orden Coleoptera y Orthoptera.
4. JUSTIFICACIÓN
La implementación de métodos y recursos innovadores para el control y manejo de
plagas, tanto en el sector agropecuario como industrial o incluso a nivel municipal es
una demanda que la sociedad ha requerido desde tiempos remotos, siendo en la
actualidad una demanda creciente para el control de plagas resistentes, y de pesticidas
que ya no pueden estar en el mercado. En este trabajo se pretende obtener información
58
de los efectos del fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia foetida en la fisiología
de dos especies de insectos pertenecientes a dos órdenes diferentes, y que cuentan con
algunas especies consideradas como insectos plaga. Además, proveer de un
conocimiento para posteriores investigaciones, ya sea para entender la acción de uno o
varios compuestos del fluido celómico que pudieran servir como biopesticidas. Así
mismo, nos permite estudiar el daño fisiológico causado a los artrópodos.
59
5. MATERIALES Y MÉTODO
5.1. Obtención de los organismos
En este proyecto se utilizaron lombrices adultas de la especie Eisenia foetida para la
obtención del fluido celómico. Estos organismos se cultivaron en el laboratorio Lainus T
del edificio 203 de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (UAA), en un medio de
crecimiento bajo condiciones de humedad del 80% a una temperatura de 25 °C y con
una dieta a basada en cáscaras de melón, sandía y plátano.
En los experimentos se usaron insectos adultos de la especie Achaeta domesticus o grillo
común (Figura 20); con un peso promedio de 0.3 g y la especie Tenebrio molitor o
escarabajo tenebrio (Figura 21); con un peso promedio de 0.1 g. Se usaron estas
especies de insectos debido a la facilidad con que se pueden obtener en las tiendas de
mascotas. Los grillos se mantuvieron en un topper plástico de 80 x 50 cm de base y 30
cm de altura a una temperatura 25 °C y 30% de humedad. Fueron alimentados a base de
croquetas de rata y perro, sobras de manzanas y plátanos. Los tenebrios fueron
cultivados en un contenedor de unicel de 70 x 40 cm de base y 20 cm de altura a 25 °C y
30% de humedad; se mantuvieron en un medio rodeado de salvado de trigo con el que se
alimentaron.
Figura 22. Achaeta domesticus
Figura 23. Tenebrio molitor
60
5.2. Obtención del fluido celómico
Se trabajó con fluido celómico liofilizado (FCL) y extracto de fluido celómico fresco
(FCF). El FCL se adquirió de tubos previamente preparados en el laboratorio LAINUS T
del edificio 203 de la UAA, estos se mantuvieron a una temperatura de -20 °C en tubos
de ensayo.
En tanto que el FCF se obtuvo mediante estimulación eléctrica de
lombrices, a las que previamente se retiraron del medio de crecimiento, luego se
colocaron en una caja de Petri para ser lavadas con agua destilada; posteriormente se
depositaron en otra caja de Petri y se mantuvieron en ayunas durante 24 horas, cumplido
este tiempo, las lombrices fueron estimuladas eléctricamente. El FCF fue colectado en
tubos Eppedorf con solución salina para insectos (solución Ringer para insectos).
5.3. Prueba del efecto del fluido celómico en el modelo de vaso dorsal de
insecto
En las pruebas del vaso dorsal de los insectos de las especies A domesticus y T molitor
se utilizó FCL, el cual se diluyó en solución salina para insectos (solución Ringer), cuya
preparación es descrita por Llanderal y Cibrian (1983), para posteriormente ser
fraccionado en las concentraciones de 1 mg/Kg, 0.8 mg/Kg, 0.6 mg/Kg y 0.4 mg/Kg. La
solución Ringer para insectos se utilizó como prueba control.
Para fijar a los insectos, se anesteciaron con éter, después se procedió a separar las patas
de los insectos cortando desde las coxas y las alas anteriores (élitros en el caso de los
tenebrios) desde donde comienza la articulación de estas. Posteriormente se utilizó
plastilina para fijar las alas posteriores, la cabeza y la parte mas distal del abdomen a una
placa de parafina, con el fin de evitar movimientos bruscos de los organismos.
Una vez fijados los animales, se procedio a registrar el experimento en video utilizando
un microscópio estereoscópico adaptado con una cámara; en donde se registró en video
la zona drosal del mesotorax en los grillos, y en los tenebrios la zona dorsal del segundo
61
segmento. Se registraron 20 minutos por cada experimento, siendo los primeros 10
minutos de control, donde no se le administró ninguna solución, se pausó el video para
administrar la solución usando una microjeringa Hamilton de 10 µL, del cual se sumistró
un volumen de 5µL de solución salina y FCL y posteriormente se volvió a registrar el
video durante 10 minutos. El FC fue inyectado en el área dorsal a un costado del vaso
dorsal; detrás del metatorax en los grillos y en los tenebrios detrás del segundo segmento
abdominal. Se hicieron 6 repeticiones por cada solución.
A
B
E
C
D
Figura 24. Material utilizado en la preparación fisiológica de vaso dorsal del grillo y de
tenebrio. A) Eter etílico con el que se anesteció a los grillos (A. domesticus) y tenebrios
(T. molitor) en una caja de petri. B) grillo fijado en una placa de parafina C)
Microscópio estereocopio acoplado con una cámara. D) Mesotorax de grillo tomada
desde el microscopio estereoscopio. E) Segundo segmento abdominal dorsal del
tenebrio.
62
Los videos fueron analizados en el programa Movie Make; se contabilizaron las
contracciones por minuto del vaso dorsal manualmente utilizando una calculadora
CASIO y se comparó el tiempo control contra el tiempo posterior a la adminitración de
la solución.
La apertura del vaso dorsal se midió tomando imágenes fotograficas del video, mediante
el softeare Movie Maker, en la cual se tomaron 4 fotografías por cada minuto registrado
y se midió la apertura del vaso dorsal usando el programa ImageJ el cual midio usando
las parámetros de 100 µm equivalentes a 29.155 pixeles.
5.4. Prueba del fluido celómico en el modelo neuromuscular de la pata
trasera
del insecto
En esta preparación los insectos (grillos y tenebrios) fueron anestesiados, después se
fijaron a una placa de parafina; posicionando el cuerpo del insecto apuntando el lado
ventral hacia arriba; se utilizó plastilina parafijar la cabeza, la parte mas distal del
abdomen y las patas a la placa de parafina, con excepción de la pata trasera derecha del
insecto. Esto, con el propósito de evitar movimientos bruscos por parte del insecto
fijado.
Posteriormente se procedió a amarrar con un hilo la pata trasera derecha del insecto en la
zona del tarso. El hilo fue unido a un transductor de fuerza acoplado fisiografo, que
envió los datos a una computadora, que a su vez, registró los datos de la fuerza de
contracción de la pata trasera derecha del insecto. Para registrar la fuerza contracción de
la pata del insecto, su usó el software LabVIEW de National Instruments. Además, se
utilizó un estimulador de fisiógrafo unido a un cable con dos puntas de cobre en el
extremo, estos fueron posicionados de manera separada en las región ventral del
protorax y el mesotorax del insecto. De esta manera, el estimulador mandó impulsos
eléctricos a los insectos para posteriormente registrar las contracciones de la preparación
en la computadora.
63
Se mantuvo un periodo de control de 5 minutos en la que no se administró dosis alguna,
terminado este tiempo, se inyectó la dosis control o de fluido celómico. El FCL fue
administrado en las dosis de 0.8 mg/Kg, 1.6 mg/Kg, 3.2 mg/Kg y 6.4 mg/Kg; siendo la
solución Ringer para insectos el tratamiento control. Una vez administrada la dosis, se
registró en el fisiógrafo durante 15 minutos. Se hicieron 6 repeticiones por cada dosis.
C
B
A
Figura 25. Preparación neuromuscular del grillo. A) Insecto fijado a la placa de
parafina. B) Electrodos de cobre. C) Transductor
64
5.5. Determinación de la dosis letal 50 del fluido celómico
En la prueba para determinar la dosis letal 50 (DL50), se usó fluido celómico fresco
(FCF) diluido en solución salina para insectos; en la cual se hicieron 4 tubos como se
muestra en la tabla 1. En los tubos 1 y 2 se extrajo FCF de 2 lombrices por cada tubo;
mientras que en los tubos 3 y 4 se obtuvo FCF de 3 lombrices.
Inicialmente los organismos fueron anestesiados, después se fijaron los insectos
posicionando el cuerpo del grillo ventralmente hacia arriba. Utilizando plastilina se pegó
la zona de la cabeza y parte del protorax del cuerpo a la placa de parafina, así como las
patas y la zona más distal del cuerpo del grillo. Con una microjeringa se administró un
volumen de 5µL de extracto crudo de fluido celómico a cada grillo. Las dosis fueron
inyectadas en el intestino anterior de los grillos. Una vez administrado la dosis
correspondiente, se pasaron los grillos a una caja de petri con un algodón húmedo y se
esperó durante 48 horas. Se usó solución Ringer para insectos como la dosis control en
esta prueba.
Muestra
Cantidad de fluido
Volumen (mL)
celómico (g)
Tubo 1
0.162
1
Tubo 2
0.058
1
Tubo 3
0.66
0.5
Tubo 4
0.987
0.5
Tabla 1. Diferentes concentraciones de FCF que se usaron en la determinación de la
DL50, en la que se utilizaron 6 grillos por dosis.
65
Figura 26. Grillo fijado en placa de parafina en posición ventralmente hacía arriba
Figura 27. Grillos encerrados en cajas de petri después de habérseles administrado el
FCF
66
5.6. Prueba de efectos de la lisenina en el modelo de vaso dorsal de
insecto
La lisenina fue obtenida de Sigma-Aldrich de un peso de 50µg, desués fue diluida en
solución salina isotónica, para luego ser fraccionada y producir dos diferentes dosis; la
primera de 100ng en 2µL y la segunda dosis de 200ng en 4µL. Las dosis de lisenina
fueron empleadas para las pruebas de vaso dorsal en grillo y la preparación
neuromuscular de la pata trasera del grillo. Estas pruebas se siguieron con el mismo
procedimiento aplicado con el fluido celómico.
5.7. Prueba Estadística
Se aplicó análisis de varianza (ANOVA) usando el software GraphPad Prism versión 6
en las pruebas del ritmo del vaso dorsal, apertura del vaso dorsal y en la preparación de
la pata trasera de grillo y tenebrio. Se comparó el periodo control contra el periodo
posterior a la administración de la dosis (Solución Ringer, FCL y Lisenina) de cada
insecto. Además, se evaluó el porcentaje intensidad de fuerza ejercida por la pata prasera
de los grillos y tenebrios a partir de los datos obtenidos de la preparación neuromuscular
de la pata trasera del grillo y del tenebrio, tomando la media del tiempo control de cada
experimento como el cien porciento y se analizó el periodo posterior a la administración
de la dosis de cada organismo mediante la prueba ANOVA de dos vías y prueba de
Dunnett.
La Dosis letal 50 (DL50) se determinó utilizando el software GraphPad Prism versión 6,
y la Dosis efectiva 50 (DE50) se determinó aplicando la prueba ANOVA en cada uno de
los experimentos de la apertura del vaso dorsal, en la que se comparó el periodo control
contra el periodo posterior a administración de la dosis de cada grillo. No se determino
EC50 en el tenebrio debido a que solo en dos de las cuatro dosis de fluido celómico se
presentaron efectos.
67
6. RESULTADOS
6.1. Efectos del fluido celómico liofilizado en la frecuencia del vaso
dorsal del grillo y del tenebrio
Al administrar el fluido celómico liofilizado (FCL) en el área dorsal del modelo de vaso
dorsal de insecto en las concentraciones de 0.4, 0.6, 0.8 y 1mg/Kg. Se observó que el
efecto en el grillo (Achaeta domesticus) hubo un descenso significativo en el ritmo de la
contracción del vaso dorsal a las concentraciones de 0.6, 0.8 y 1 mg/Kg (figura 26). Este
efecto se pudo observar inmediatamente después de haber sido administradas las dosis
de FCL, y se registró el efecto desde el minuto 11, siendo los primero 3 minutos donde
se observaron los efectos más marcados. Sin embargo, los grillos mostraron una
tendencia a recuperarse desde el minuto 16, pero sin llegar a igualar o superar al registro
al registro previo a la administración de la dosis.
Por otro lado, en el modelo de vaso dorsal de tenebrio (Tenebrio molitor) no se
observaron efectos significativos en ritmo del vaso dorsal en ninguna de las
concentracioes de FCL (figura 27). No se consideró como efecto significativo a pesar de
que en la dosis de 0.6 y 0.8 mg/Kg se observa un incremento en la frecuencia del vaso
dorsal; esto debido a que también en los tenebrios a los que se les administro la dosis
control se presenta este mismo efecto.
68
69
Figura 28. Efecto del FCL en el modelo de vaso dorsal de grillo comparado con la
dosis de solución control, en la que se grafica el número de contracciones contra el
tiempo en minutos. La dosis de 0.4 mg/Kg de FCL no presenta un efecto significativo;
mientras que la dosis de 0.6 mg/Kg presenta un efecto significativo en la disminución
del ritmo del vaso dorsa (P<0.0001); de igual manera para las dosis de 0.8 (P<0.0001) y
1 mg/Kg (P<0.001). (ANOVA preuba Tukey p<0.05).
70
71
Figura 29. Comparación de la dosis de FCL contra la solución control en el modelo de
vaso dorsal de tenebrio. No se observaron efectos significativos en el ritmo del vaso
dorsal del tenebrio en ninguna de las cuatro dosis de FCL (ANOVA preuba Tukey
p<0.05).
72
6.2. Análisis del efecto del fluido celómico en la apertura del vaso
dorsal en el grillo y el tenebrio
Se observó que en la preparación del modelo de vaso dorsal de grillo se produjo un
efecto vasocontrictor después de adminstrada las dosis de FCL, el cual se confirma al
compararse el periodo control contra el periodo posterior a la administración de la dosis
de FCL. El efecto vasoconstrictor en este modelo fue significativo para todas las
concentraciones de FCL (figura 28) y se presenta desde el primer minuto después de
administrarse estas dosis. Además, se observa que el efecto vasoconstrictor del vaso
dorsal del grillo se mantiene en todo el periodo posterior a la administración de la dosis
con FCL, con excepción de la dosis de 0.4 mg/Kg que muestra una tendencia a
recuperarse desde el minuto 15.
En el modelo de vaso dorsal de tenebrio los efectos al administrar el FCL fueron
similares a los observados en el grillo. Al igual que en los experimentos con el modelo
de vaso dorsal de grillo, en los tenebrios se presenta el efecto vasoconstrictor desde el
primer minuto posterior a la administración de la dosis de FCL. Este efecto fue
significativo a las dosis de 0.6, 0.8 y 1 mg/Kg (figura 29). Sin embargo, en las dosis de
0.6 y 0.8 mg/Kg se puede observar claras tendencias a recuperar el diámetro normal del
vaso dorsal; pero en la dosis de 1 mg/Kg no se observa una tendencia a recuperarse del
efecto vasocontrictor durante todo el periodo posterior a administración de esta dosis.
73
74
Figura 30. Efecto del FCL sobre la apertura del vaso dorsal del grillo a diferentes dosis
(ANOVA preuba Tukey p<0.05).
75
76
20
19
17
18
15
16
14
12
13
9
10
11
7
8
5
6
4
2
3
1
Figura 31. Gráficas del efecto del FCL en la apertura del vaso dorsal de tenebrio a
diferentes concentraciones. Las dosis de 0.6, 0.8 y 1 mg/Kg mostraron diferencias
significativas con respecto a su periodo control (ANOVA prueba Tukey p<0.05).
.
77
6.3. Análisis del efecto del fluido celómico en la preparación
neuromuscular de la pata trasera del grillo y del tenebrio
La aplicación del FCL al modelo de insecto completo, produjo efectos en la preparación
neuromuscular del grillo (figuras 30 y 31). Que se caracterizan por presentar una
disminución sin recuperación en la intensidad de la contracción de la pata trasera del
grillo comparado al periodo control (5 min). En la figura 30, se muestran las diferencias
de las tendencias
entre el tratamiento control comparado con cada uno de los
tratamientos con dosis de FCL en el grillo. En todas las concentraciones de FCL (0.8,
1.6, 3.2 y 6.4 mg/Kg) se observaron efectos significativos sin recuperación de la
intensidad de fuerza de contracción de la pata trasera del grillo, siendo la dosis de 6.4
mg/Kg la concentración de FCL que más disminuyó la intensidad de la fuerza de
contracción de la pata trasera del grillo (figura 31).
Al administrar el FCL en la preparación neuromuscular del tenebrio, se observó un
disminución de la intensidad de la contracción de la pata trasera de estos insectos; siendo
este efecto significativo en las concentraciones de 0.8, 3.2 y 6.4 mg/Kg. En la figura 32
se observa que tanto los tenebrios del tratamiento control, como los tenebrios del
tratamiento con las dosis de FCL tienden a disminuir la intensidad de la contracción de
la pata trasera conforme pasa el tiempo posterior a la administración de las dosis; sin
embargo, en la figura 33 se observa que en las dosis de 0.8, 3.2 y 6.4 mg/Kg se produjo
una disminución en la intensidad de la contracción de la pata trasera aún mayor que la
que ocurre en el tratamiento control al pasar los 15 minutos posteriores al administrar la
dosis con solución Ringer para insectos. Las concentración de 6.4 mg/Kg produjo la
mayor disminución de la intensidad de la contracción, seguido de la dosis de 3.2 mg/Kg
de FCL.
78
79
Figura 32. Efecto del FCL en la preparación neuromuscular de grillo. Se comparó las
tendencias entre la dosis control contra cada una de las dosis de FCL. Todas las dosis de
FCL tuvieron efectos significativos (ANOVA preuba Tukey p<0.05).
80
Figura 33. Gráficas del porcentaje de fuerza de la pata trasera del grillo posterior a la
administración de las dosis. Todas las dosis de FCL tuvieron efectos significativos
comparados con el tratamiento control. Siendo la dosis de 6.4 mg/Kg la concentración
que más disminuyó la intensidad de fuerza de contracción de la pata trasera del grillo
(ANOVA prueba Dunnet p<0.01).
81
82
Figura 34. Gráficas del efecto del FCL en la preparación neuromuscular de tenebrio. No
se observaron efectos significativos debido a que en el tratamiento control al igual que
los tratamientos con FCL la intensidad de fuerza disminuye (ANOVA preuba Tukey
p<0.05).
83
*
Porcentaje de la intensidad de la pata trasera del tenebrio
Control Ringer
Dosis 3.2 mg/Kg
150
Dosis 6.4 mg/Kg
100
50
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Tiempo (min)
Figura 35. Gráfica del porcentaje de intensidad de fuerza de la pata trasera del tenebrio
posterior a la administración de las dosis. Las concentraciones de 0.8, 3.2 y 6.4 mg/Kg
de FCL tuvieron efectos significativos comparados con el control. La dosis de 6.4
mg/Kg tuvo el efecto más significativo comparado las demás dosis (ANOVA prueba
Dunnet p<0.05).
84
6.4. Efecto de la lisenina en la preparación del vaso dorsal y
neuromuscular de la pata trasera del grillo
Se administró en la preparación de vaso dorsal del grillo 100 y 200 ng de lisenina, en el
cual no se observaron alteraciones significativas en la frecuencia cardiaca del vaso
dorsal en ninguna de las dos dosis de lisenina (figura 34). Por otro lado, en la apertura
del vaso dorsal si se identificaron efectos significativos en las dos dosis de lisenina, con
características semejantes a las observadas con las dosis de FCL (figura 35).
En la preparación neuromuscular de la pata trasera del grillo se observaron efectos quese
caracterizaron por una disminución de la intensidad de la fuerza de contraccion, las
cuales fueron similares a los efectos observados con el FCL en la preparación
neuromuscular del grillo. Estos efectos fueron significativos en 100 y 200 ng de lisenina
(figuras 36 y 37).
En la figura 37 se puede observar que la dosis de 200 ng de lisenina muestra una mayor
intensidad de fuerza que la dosis de 100 ng de lisenina, lo cual puede deberse a que los
grillos que se usaron en esta prueba eran mas fuertes que la maoría de los grillos usados
en las anteriores pruebas. Lo anterior se corrobora al comparar los grillos del tratamiento
control contra los grillos de la dosis de 200 ng de lisenina (figura 36).
85
Figura 36. Gráficas del fecto de la lisenina en la frecuencia del vaso dorsal del
grillo,comparada con el tratamiento control (ANOVA preuba Tukey p<0.05).
86
Figura 37. Efecto de la lisenina en la apertura del vaso dorsal del grillo. La lisenina
disminuyó significativamente la apertura del vaso dorsal en el grillo (ANOVA prueba
Tukey p<0.05).
87
Figura 38. Gráficas del efecto de la lisenina sobre la preparación neuromuscular del
grillo (ANOVA prueba Tukey p<0.05).
88
Figura 39. Gráficas del porcentaje de fuerza de la pata trasera del grillo posterior a la
administración de las dosis de lisenina. Todas las dosis de lisenina tuvieron efectos
significativos comparados con el tratamiento control (ANOVA prueba Dunnet p<0.05).
89
6.5. Determinación de la DE50 Y DL50
La dosis efectiva 50 (DE50) se determinó tomando las concentraciones de las pruebas de
la preparación del vaso dorsal del grillo usando FCL. En la figura 38 se grafican los
parámetros para determinar la DE50 que fue de 5.083 x10-4 mg/g.
La dosis letal 50 (DL50) se determino utilizando FCF extraido de la lombriz Eisenia
foetida y administrado a los grillos, teniendo un periodo de prueba de 48 horas. Se
utilizaron 4 diferentes concentraciones de FCF (figura 39) para determinar la DL50,
Respuesta
(%)
cuyo valor fue de 1.486 x10-4 mg/g.
Muertes
(%)
Figura 40. Gráfica para determinar la DE50 del grillo.
Figura 41. Gráfica para determinar la DL50 utilizando FCF en grillos.
90
DISCUSIÓN
En este trabajo de tesis se plantea el considerar que uno o más componentes del FC de la
lombriz de tierra Eisenia fetida como probables cadidatos a estudios, para desarrollar
nuevos productos de control de plagas de insectos. Para ello, es necesaio recurrir a la
Fisiología, que constituye parte esencial de la Entomología básica y aplicada, pues tiene
relación con otras ramas de la Biología como la Toxicología y, por lo tanto, la
toxicología de los insecticidas y otras formas de control de población de los insectos
(Llanderal y Cibrián 1983). Entendiendo que los insecticidas son tóxico que interactúa
con una macromolécula vital del insecto inactivándola (Wilson T. G. 2003).
Desde 1960, los paises industrializados han utilizado a los pesticidas sintéticos, pero este
uso se ha vuelto significativamente menor, debido a factores como el amplio rango de
daño que causan tanto a la salud humana como al ambiente, y ademas, el excesivo uso
profiláctico que se ha dado a estas sustancias dieron como consecuencia la resistencia a
los pesticidas (Chandler y col. 2011). No obstante, el incremento de la demanda por la
producción de alimentos sustentables, junto con el incremento de la restricción en la
aplicación de agentes de control químico, han dado como resultado la necesidad de
aplicar métodos alternativos para combatir a las pestes de insectos (Sørensen y col.
2012).
Una herramienta alternativa para el control de plagas son los biopesticidas, que se les
ha definido como “agentes producidos en masa por organismos vivos, y cuyo objetivo es
el control de las pestes de insectos de los cultivos agrícolas”. Los biopesticidas se
clasifican en tres diferentes grupos de acuerdo a la sustancia activa: i) microorganismos,
que incluyen sutancias producidas por bacterias, virus, hongos y oomicetos, ii)
bioquímicos, que incluyen metabolitos secundarios de las plantas y iii) semiquímicos,
que inluyen sustacias como las feromonas de lo insectos (Chandler y col. 2011).
91
No podemos descartar el potencial de los venenos, toxinas y otras secreciones que los
animales producen, debido a la gran cantidad de aplicaciones que poseen y que faltan
por decubrir. El veneno en los animales, son sustancias utilizadas para autodefensa o
depredación y liberadas normalmente por modeduras o picaduras (Jaramillo y col.
2006). Existe evidencia de la coevolución entre la dieta y el efecto del veneno, que
proveen pruebas de la evolución adaptativa de los componentes del veneno de las
especies de animales (Richards y col. 2011). El mejor ejemplo de lo anterior, son los
arácnidos, cuyos venenos contienen una basta cantidad de sustancias biológicamente
activas, algunas de las cuales son toxinas (Fitches y col. 2004).
La lombriz de tierra Eisenia fetida, un ejemplo de invertebrado que produce un veneno,
puede utilizar el FC, como un veneno defensivo, cuyo principal objetivo, hasta ahora
descrito, es contra microorganismos (Sharma y col. 2005). De hecho la vermicomposta,
un producto de las lombrices, puede ser considerado como un agente biopesticida,
debido a que se ha demostrado que puede proteger a las plantas de microorganismos
patógenos (Sharma y col. 2005); otras pruebas han demostrado que las plantas con
sustrato tratado con vermicomposta son menos suceptibles a ser invadidas por pestes de
artrópodos (Cardoza Y. J. 2010).
Si bien ya se han hecho investigaciónes sobre la toxicicidad del FC en invertebrados,
Kobayashi y colaboradoes (2001) reportaron que el FC no es tóxico para estos
organismos, incluidos los insectos. Ellos trabajaron con varias especies de insectos
pertenecientes a cuatro órdenes diferentes, que son: Hemiptera, Odonata, Diptera y
Coleoptera, a los cuales se les expuso al FC en medios acuosos. Sin embargo, nosotros
inyectamos FC al modelo de cuerpo íntegro de insecto, demostrando que es tóxico para
los insectos de la especie Achaeta domesticus (Orden Orthoptera) y Tenebrio molitor
(Orden Coleoptera), tal como puede observarse tanto en las pruebas en las que se
observan efectos tóxicos en el grillo y el tenebrio e incluso en la prueba para determinar
la DL50 en el grillo. El mecanismo de toxicidad del FC por el cual los organismos
mueren no es claro (Maldonado G. A. M. 2011); sin embargo, componentes como la
lisenina, pueden aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, dando como
92
consecuencia la activación de las vías de señalización de la apoptosis (Bakr y col. 2003);
sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que otros componentes del FC
participen en la intoxicación y muerte de estos insectos.
Cabe mencionar que al comparar la DL50 con FCF contra la DE50 con FCL, podemos
observar que el primero posee un valor de concentración menor que el segundo. Si bien
se ha reportado que el FCL produce sus efectos más rápido que el FCF (Maldonado G.
A. M. 2011), lo que explica por qué se observaron efectos desde el primer minuto de
administrado el FCL. Entonces el FCL debería ser el que posea el menor valor. Además,
los insectos a los cuales se les administró la lisenina pura en 100 y 200 ng no murieron.
Lo anterior, nos plantea la posibilidad de que los insectos posean resistencia a la
lisenina; además, pueden ser otros los componentes del FC los que producen la muerte
en los insectos y que pueden perderse (al menos parte) durante el proceso de
liofilización o incluso tener una acción retardada en los insectos. Esto último puede ser
la razón por la cual tuvimos que aplicar la prueba de DL50 en un periodo de 48 horas.
Con lo que podríamos explicar porque Kobayashi y colaboradoes (2001) no encontraron
efectos tóxicos en los insectos con los que trabajaron, y no debido a que los insectos no
posean esfingomielina.
Las investigaciones que se han realizado con FC o lisenina para describir sus efectos
fisiológicos, solo se han aplicado a vertebrados o preparaciones de tejidos de los mismos
(Kobayashi y colaboradoes 2001), por lo que esta es la primera investigación en la que
se reportan alteraciones fisiológicas en invertebrados causados por el FC. No obstante,
los efectos que se reportan en este proyecto son similares a otras investigaciones en las
que usaron modelos de vertebrados.
Existen otras investigaciones aplicadas al mismo tipo de modelo de vaso dorsal de
insecto, tal como el trabajo de Maestro y colaboradoes (2011), quienes reportan que la
leucomiosupresina, un péptido miembro de la familia de los miosupresores y cuya
función es la de regular del ritmo cardiaco en los insectos, tiene la capacidad de
disminuir el ritmo de la frecuencia del vaso dorsal en la cucaracha (Blattella germánica)
93
inhibiendo la amplitud y la frecuencia de la contracción del vaso dorsal. Ellos reportaron
alteraciones comparables a los que obtuvimos con los grillos al administrar el FCL, en la
que se puede observar una disminución de frecuencia cardiaca del vaso dorsal cuya
tendencia es a recuperarse. Sin embargo, este proyecto es el primero en reportar los
únicos modelos de insectos en la que se aplicó el FC. El FCL y la lisenina demostraron
que pueden causar alteraciones en el vaso dorsal de los grillos y tenebrios; por un lado,
alterando el ritmo del de las contracciones del vaso dorsal en los grillos, y por otro lado,
causando vasoconstricción del vaso dorsal en los grillos y los tenebrios, tal como se
observa en los resultados.
Se observó una disminución de la frecuencia cardiaca del vaso dorsal de los grillos que
se presentó a los pocos segundos de administrar la dosis de FCL, y se mantuvo durante
todo el periodo de registro, el cual fue muy similar a las alteraciones descritas por
Maldonado G. A. M. (2011), en la que reporta que el FCL y el FCF administrado por vía
intravenosa disminuyen la frecuencia cardiaca de las ratas Wistar, en las concentraciones
de 0.4, 0.8, 9 y 20 mg/Kg
En esta investigación demostramos que el FC posee sustancias capases de generar
efectos muy interesantes y que han sido poco descritos. La propiedad del FC de alterar el
ritmo de las contracciones del vaso dorsal en los grillos e igualmente disminuir la
frecuencia cardiaca en las ratas (Maldonado G. A. M. 2011) nos muestra posibles
semejanzas entre los vertebrados y los insectos, y es que a pesar de que los insectos no
poseen músculos cardiacos como los vertebrados, siendo los músculos del vaso dorsal
más parecidos a los del músculo liso, tanto el vaso dorsal, como el corazón de los
vertebrados son miogénicos (Sláma Karel 2012), es decir, que los impulsos eléctricos
que desencadenan la contracción, tanto del vaso dorsal de los insectos, como en el
corazón de los vertebrados, se originan de células musculares o células musculares
modificadas (Hill y col. 2006); a diferencia del resto de los invertebrados que poseen un
corazón neurogénico (Kumar Ashok 2007), es decir, que los impulsos eléctricos que
producen el ciclo de la contracción se originan en neuronas (Hill y col. 2006). Este
efecto producido por el FC en el vaso dorsal es la posible razón por la cual los grillos
94
murieron en la prueba para determinar la DL50, y es una posible razón por la que las
lombrices, así como otros invertebrados no mueran por el FC, tal como en la
investigación hecha por Kobayashi y colaboradoes (2001) en sus pruebas para
determinar la DL50 en invertebrados, debido a que el FC de algún modo aún no descrito,
puede alterar el ritmo de las contracciones en corazones miogénicos, por lo que se debe
hacer más investigación sobre el FC para identificar la o las sustancias que producen la
disminución en la frecuencia cardiaca en los organismos con corazones miogénicos.
Sin embargo, en los tenebrios no mostraron alteraciones significativas en la frecuencia
cardiaca del vaso dorsal. Las posibles causas de esto, probablemente se deban a que los
tenebrios posean una mayor resistencia al FC que los grillos, de tal manera que los
tenebrios necesiten una mayor concentración de FCL para encontrar alteraciones
significativas en su en la frecuencia cardiaca de su vaso dorsal, o que el vaso dorsal de
los Coleópteros no sea miogénico. Otro punto importante que cabe señalar, es que la
lisenina no produjo alteraciones en la frecuencia cardiaca del vaso dorsal del grillo, lo
que puede sugerir que el FC puede tener uno o varios componentes capaces de ejercer
esta alteración.
Se observó un efecto vaso constrictor sostenido en el vaso dorsal del grillo y del tenebrio
producto de la administración del FCL y la lisenina, el cual también es reportado por
Maldonado G. A. M. (2011) al evaluar el efecto del FCF y FCL en los anillos de aorta de
las ratas Wistar. Otras investigaciones como el de Sekizawa y colaboradores (1997),
reportan que la proteína lisenina es capaz de causar contracción en el músculo liso de los
anillos de aorta, mientras que Czurylo y colaboradores (2008) reportar que la lisenina es
capaz de alterar la actividad de la ATPasa actomiosina en presencia de la proteína
caldesmona impidiendo que se desfosforile, por lo que el músculo liso no se relaja y
mantiene una contracción sostenida. Aunque no se descarta que el FC pueda tener otros
mecanismos de acción.
El otro punto importante en nuestros resultados es la alteración en la intensidad de
fuerza de la pata trasera de los grillos y tenebrios, que disminuyo en todas las
95
concentraciones de FCL, siendo este efecto dosis-dependiente, Además se observó que
la lisenina también produjo este efecto en las dosis de 100 y 200 ng, por lo que
atribuimos esta alteración a la proteína lisenina. A la fecha no se han reportado que la
lisenina tenga la capacidad de alterar al músculo estriado esquelético, y mucho menos
alteraciones en los músculos de los invertebrados, lo que recalca la falta de
conocimiento sobre los mecanismos de acción de esta proteína. La lisenina es más
conocida por su capacidad de provocar citotoxicidad en una gran cantidad de células
como los espermatozoos de vertebrados e invertebrados (Kobayashi y col. 200); otras
como los leucocitos polimorfonucleares del cerdo de guinea, globulos rojos de
vertebrados, fieroblastos de pollo e incluso, células tumorales del bazo ((Kobayashi y
col. 2004); sin embargo, poco se ha estudiado sobre las alteraciones fisiológicas que esta
proteína puede causar en las células sin provocar la muerte celular. Tal es el caso del
efecto que ejerce la lisenina en los filamentos delgados del músculo liso que describe
Czurylo y colaboradores (2008); en cuyo trabajo describe el posible mecanismo de
acción de la lisenina en el músculo liso. Donde por un lado, las moléculas de lisenina
producen poros en la membrana del músculo liso, y por otro lado, otras moléculas de
lisenina se unen al complejo actomiosina con caldesmona produciendo una contracción
sostenida en el músculo liso. Sin embargo, el músculo esquelético no posee la molécula
caldesmona en sus filamentos delgados. Probablemente la calmodulina que se encuentra
en los músculos esqueléticos no es reconocido por la lisenina y por ende, no ejerce los
mismos efectos que se observan en el músculo liso, produciendo únicamente poros en
las células musculares de donde puede escaparse los iones de calcio, dando como
consecuencia, una disminución de la fuerza de contracción de pata trasera de los grillos
y tenebrios.
Cabe mencionar que en otras pruebas (que no se reportan en los resultados) se aplicó el
FCL en la preparación neuromuscular del músculo gastrocnemio de ranas toro, en donde
se hicieron dos registros. En el primer registro se aplicó FC y solución salina con Calcio
y se observó una disminución de la fuerza de contracción, pero sin agotar al músculo. En
la segunda preparación, se administró FCL con solución salina sin calcio, y se registró
96
una disminución de la intensidad de fuerza de contracción del músculo, cuya tendencia
era al agotamiento de este.
Tomando en cuenta los resultados obtenidos por los efectos del FC en las preparaciones
de vaso dorsal y neuromuscular, podemos suponer que el FC causa alteraciones solo en
las células musculares. En las células musculares lisas causando alteraciones dentro de
la célula en el complejo ATPasa actomiosina (Czurylo y colaboradores 2008) como ya
se mencionó; sin embargo, otra posible causa pueda deberse a que el FC pueda
desencadenar segundos mensajeros dentro de la célula muscular a través de la
estimulación de las proteínas G que se encuentran en la membrana celular, tal como
ocurre con la epinefrina (Jimenez y Merchant 2003), dando como consecuencia, que el
vaso dorsal o incluso los vasos sanguíneos de los vertebrados se contraigan, pero esta
posibilidad queda descartada si se considera que la adrenalina también aumenta la
frecuencia cardiaca (Lorenzo y col. 2008) y cualquier corazón miogénico (Kumar Ashok
2003). Además, la lisenina no se une a membranas de células con alta polaridad
(Shogomori y Kbayashi 2007) como ocurre en las células neuronales, lo que descarta
cualquier posibilidad de que de que los efectos registrados en estas preparaciones
fisiológicas se deban a cualquier alteración proveniente del sistema nervioso. Finalmente
estos argumentos podrían apoyar nuestra hipótesis de que el FC causa huecos en la
membrana de las células de músculo estriado esquelético, dando como consecuencia, el
escape de iones Ca2+ de las células y con ello, que la fuerza de contracción disminuya.
97
CONCLUSIÓN
Tomando como base los resultados reportados en este proyecto, podemos concluir lo
siguiente:
•
El fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia fetida es tóxico para los
insectos del orden Orthoptera y Coleoptera, mostrando sus efectos a muy bajas
concentraciones.
•
El fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia fetida es capaz de disminuir la
frecuencia cardiaca de los insectos del orden Orthoptera, sin embargo, no
produce alteraciones en los tenebrios. No obstante, no se observó que la lisenina
fuera el componente del fluido celómico causante de esta alteración, por lo que
se desconoce cuál es el agente y el mecanismo por el cual la frecuencia cardiaca
disminuye en presencia de fluido celómico.
•
El fluido celómico altera la frecuencia en los corazones miogénicos por
componentes y mecanismos que aún se desconocen.
•
La lisenina es un componente del fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia
fétida, capaz de ejercer vaso construcción en los insectos del orden Orthoptera y
Coleoptera.
•
El fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia fétida disminuye la intensidad
de la contracción de los músculos de la pata trasera de los insectos del orden
Orthoptera y Coleoptera y es dependiente de la dosis, encontrándose que
probablemente la lisenina es el agente causante de este efecto.
98
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