Download indicador de peroxido de hidrogeno que utiliza un enzima y un

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 233 571
51 Int. Cl. : G01N 33/52
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C12Q 1/28
G01N 31/22
A61L 2/28
C12Q 1/22
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 01310672 .9
86 Fecha de presentación: 20.12.2001
87 Número de publicación de la solicitud: 1217373
87 Fecha de publicación de la solicitud: 26.06.2002
54 Título: Indicador de peróxido de hidrógeno que utiliza un enzima y un colorante.
30 Prioridad: 21.12.2000 US 745212
73 Titular/es: ETHICON, Inc.
U.S. Route 22 West
Somerville, New Jersey 08876, US
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.06.2005
72 Inventor/es: Morrison, Todd;
Thralls, Veronica V. y
Jurik, Franklin
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 233 571 T3
16.06.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Indicador de peróxido de hidrógeno que utiliza un enzima y un colorante.
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Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un método y dispositivo para detectar peróxido de hidrógeno.
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Existen muchas aplicaciones en las que es deseable medir la concentración de peróxido de hidrógeno. Por ejemplo,
en la industria alimentaria el peróxido de hidrógeno se usa para esterilizar las latas metálicas para la preparación de
alimentos enlatados. Es crítico asegurar una aplicación apropiada del peróxido de hidrógeno a tales latas para mantener
la seguridad alimentaria apropiada. El peróxido de hidrógeno también se usa como un agente desinfectante químico
para cámaras estériles. Lo más importante, el peróxido de hidrógeno se usa para esterilizar los dispositivos industriales
y médicos. En tal aplicación, el peróxido de hidrógeno se puede aplicar como una disolución líquida o preferiblemente
como un vapor. El vapor de peróxido de hidrógeno se puede combinar con la aplicación de un campo de plasma.
Tales sistemas se describen más plenamente en la Patente de EE.UU. números 4.643.876 y 4.756.882. Un sistema
tal comercialmente disponible es el esterilizador marca STERRAD® de Advanced Sterilization Products de Irvine,
California.
En el STERRAD y sistemas similares, típicamente los instrumentos que se han de esterilizar primero se limpian,
secan y después se envuelven en una envoltura a prueba de bacterias, transmisible al vapor tal como una bolsa de
TYVEK® (olefina de filamento continuo)/MYLAR (película de poliestireno) o envoltorio de la sala central de suministros (envoltorio CSR). Los instrumentos se colocan en una cámara de esterilización y se evacua el gas de la cámara
para poner la cámara a una presión de vacío. Se introduce el vapor de peróxido de hidrógeno en la cámara y se pone en
contacto con los instrumentos para esterilizarlos. La potencia añadida a través de radiación electromagnética u otros
medios crea un plasma de peróxido de hidrógeno, preferiblemente al final del ciclo. Después de que se retira la fuente
de energía usada para crear el plasma, los iones del plasma se recombinan para formar oxígeno y agua.
El procedimiento de esterilización se puede controlar de varias maneras. Por ejemplo, se pueden colocar indicadores biológicos en diversas posiciones por toda la cámara de esterilización para evaluar el procedimiento de esterilización. Un indicador biológico típico se muestra en la patente de EE.UU. número 5.552.320 por Smith. En general,
un indicador biológico contiene una cantidad conocida de un organismo vivo de ensayo. Después del procedimiento
de esterilización, el organismo se cultiva para ver si algunos de los organismos de ensayo han sobrevivido al procedimiento de esterilización. Un procedimiento de cultivo tal necesariamente supone un retraso, normalmente de un día o
más.
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Un método alternativo de controlar la operación del ciclo de esterilización es ensayar la presencia y cantidad
de vapor de peróxido de hidrógeno en la cámara de esterilización. Si se alcanza la cantidad deseada de peróxido
de hidrógeno en la cámara, al menos se puede asumir que el dispositivo de esterilización funciona como se desea.
Preferiblemente, la evaluación sería instantánea de manera que si un ciclo particular del procedimiento de esterilización
falla en alcanzar la cantidad necesaria de vapor de peróxido de hidrógeno, se puede repetir el ciclo inmediatamente.
Existen tiras reactivas para ensayar la presencia de peróxido de hidrógeno, pero generalmente son deficientes en
evaluar el nivel de exposición.
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El documento US-A-5.110.012 describe el uso de sales de compuestos de hidrazona solubles en agua para la
determinación colorimétrica de peróxido de hidrógeno.
Compendio de la invención
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La presente invención proporciona un método y dispositivo para determinar rápida y fácilmente la presencia de
peróxido de hidrógeno y más preferiblemente la cantidad de la exposición integrada al peróxido de hidrógeno.
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Un método, según la presente invención, detecta la exposición integrada del peróxido de hidrógeno en una atmósfera. El método comprende colocar un sustrato capaz de absorber el peróxido de hidrógeno de la atmósfera, poner
en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno, hacer reaccionar el peróxido de hidrógeno con un colorante
intermedio y una enzima para producir un cromóforo indicativo de la exposición integrada de peróxido de hidrógeno
en la atmósfera, y correlacionar el cromóforo con la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
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Preferiblemente, el colorante intermedio comprende una pareja de colorantes de hidrocloruro de la hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB). También preferiblemente, la enzima
es peroxidasa.
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El colorante intermedio preferiblemente comprende un aceptor de oxígeno, tal como uno de los siguientes: o-dianisidina, o-toluidina, bencidina, ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), hidrazona del 3-metil-2-benzotiazolinona más N,N-dimetilanilina, fenilo más 4-aminofenazona, 2,4-dicloro-fenol sulfonado más 4-aminofenazona,
hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona más ácido 3-(dimetilamino)benzoico, 2-metoxi-4-alil fenol, o 4-aminoantipireno-dimetilanilina
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El sustrato preferiblemente es un receptor poroso. El sustrato puede llevar el colorante intermedio antes de la etapa
de poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno. Alternativamente, el colorante intermedio se puede
añadir al sustrato después de poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
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Un método para correlacionar el cromóforo con la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera
comprende leer el cromóforo con un espectrofotómetro. Alternativamente, se puede comparar con una carta de colores.
Igualmente, la enzima puede estar en el sustrato antes o después de poner en contacto el sustrato con el peróxido de
hidrógeno.
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El sustrato se puede hidratar, preferiblemente después de la etapa de exponer el sustrato al peróxido de hidrógeno.
Se puede añadir al sustrato un agente espesante, tal como cola blanca.
El método mencionado anteriormente es particularmente útil en conexión con las etapas de eliminar el aire de la
atmósfera y generar el vapor de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
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Breve descripción de los dibujos
La presente invención se puede entender más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada cuando
se lee junto con los dibujos adjuntos, en los que:
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Fig. 1 es una vista en perspectiva de una realización de un dispositivo de ensayo según la invención;
Fig. 2 es un diagrama esquemático de bloques de un aparato que se puede emplear en la práctica de la invención;
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Fig. 3 es una vista en perspectiva de una realización preferida del dispositivo de ensayo de la presente invención
colocado en un sistema de medida;
Fig. 4 es una vista en planta ampliada de una realización preferida del dispositivo de ensayo de la presente invención
colocado en un sistema de medida;
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Fig. 5 es una gráfica que traza una curva de calibración polinómica de la presente invención;
Fig. 6 es una gráfica que traza una medida de la reflectancia de un dispositivo de ensayo según la invención frente
al volumen de peróxido de hidrógeno; y
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Fig. 7 es una gráfica que muestra las cinéticas de los reactivos con diversas cantidades de peróxido de hidrógeno
inyectado.
Descripción detallada de la invención
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La presente invención proporciona un dispositivo y metodología mejorados rápidos y simples para determinar la
exposición al peróxido de hidrógeno. Como se muestra en la Fig. 1, un indicador 10 comprende una almohadilla matriz
hidrófila 11 a la que está ligado uno o más reactivos que cambian la reflectancia de la matriz cuando se detecta peróxido
de hidrógeno. El reactivo comprende una enzima y un sistema colorante que produce un producto que absorbe luz junto
con la enzima. Es el producto que absorbe luz el que cambia la señal de reflectancia del sistema matriz. Se puede usar
peroxidasa como enzima para esta invención.
El cambio en la reflectancia durante un periodo predeterminado de tiempo como resultado de la formación del
producto de la reacción se relaciona después con la cantidad de peróxido de hidrógeno en la matriz, que a su vez se
corresponde con la exposición integrada de peróxido de hidrógeno, es decir, la concentración de peróxido de hidrógeno
durante el tiempo de exposición de la matriz al peróxido de hidrógeno. La exposición integrada depende tanto de la
concentración de peróxido de hidrógeno como de la extensión del tiempo de exposición. Es el área integrada bajo la
curva de concentración frente al tiempo de exposición. Por lo tanto, el ensayo con alta concentración de peróxido y
corto tiempo de exposición puede producir la misma exposición integrada que el ensayo a baja concentración y largo
tiempo de exposición. Por supuesto, la intensidad de la fuente luminosa usada para analizar la muestra es también
cuidadosamente monitorizada y regulada, para asegurar la repetibilidad de la medida.
Típicamente, la almohadilla matriz 11 estará sujeta a un soporte con el fin de darle forma física y rigidez, aunque
esto puede no ser necesario. Por ejemplo, en el indicador 10, un soporte o mango plástico 12 transporta la delgada
almohadilla matriz hidrófila 11 por medio de un adhesivo 13 que sujeta directa y firmemente la almohadilla 11 al
mango 12. Una apertura 14 en el soporte plástico 12 adyacente a la almohadilla 11 permite aplicar el líquido a un lado
de la almohadilla 11 y que la luz se refleje desde el otro lado.
La almohadilla matriz 11 debería ser absorbente del peróxido de hidrógeno de una manera controlada. Cuando se
expone a una atmósfera de peróxido de hidrógeno durante una cantidad dada de tiempo, la cantidad de peróxido de
hidrógeno absorbido en la almohadilla 11 indica la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
Varios factores controlan cuanto peróxido de hidrógeno se absorbe en la almohadilla, siendo los más importantes: la
concentración de peróxido de hidrógeno en la atmósfera, la concentración de otras sustancias, tales como vapor de
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agua, que puedan ser absorbida por la almohadilla 11 y el tiempo durante el que la almohadilla 11 está expuesta.
De ese modo, la almohadilla 11 exhibe una función de integración que está relacionada con la concentración de
peróxido de hidrógeno durante el tiempo. La cantidad total de peróxido absorbido en la almohadilla 11 depende en gran
medida del sustrato de la almohadilla 11. Se requiere calibración diferente para sustrato diferente. Si la almohadilla
11 es demasiado absorbente, puede absorber demasiado peróxido e interferir en el procedimiento de esterilización o
desinfección. Por otra parte, si la almohadilla 11 falla en absorber el peróxido de hidrógeno o se satura fácilmente
con peróxido de hidrógeno, puede no indicar correctamente la cantidad correcta de peróxido de hidrógeno en la
atmósfera.
Un material preferido para la almohadilla 11 comprende material celulósico, nylon y otras sustancias capaces de
absorber peróxido de hidrógeno. El uso de superficies de poliamida para formar el elemento reactivo 11 proporciona
varias de las características deseadas en la presente invención. Es hidrófilo (es decir, absorbe vapor de peróxido de
hidrógeno y disoluciones hidratantes rápidamente), no se deforma al mojarse (con el fin de proporcionar una superficie
plana para la lectura de la reflectancia), es compatible con enzimas (con el fin de comunicar buena estabilidad de
anaquel), absorbe un volumen de muestra limitada por volumen unitario de membrana (necesario con el fin de mostrar
un rango dinámico extendido de medidas), y muestra suficiente resistencia en húmedo para permitir la fabricación
rutinaria.
La Fig. 2 muestra un sistema en el que el reactivo se aplica a un lado del indicador 10 con la abertura 14 en el
mango de apoyo 12 mientras que la luz se refleja y se mide en el otro lado de la almohadilla 11. Se pueden emplear
otras estructuras distintas a la representada. La almohadilla 11 puede tener distintas conformaciones y formas, sujetas
a las limitaciones proporcionadas en la presente memoria. La almohadilla 11 debería ser accesible al menos por una
superficie y preferiblemente por las dos superficies.
Adicionalmente, la almohadilla hidrófila 11 puede estar sujeta al soporte 12 por cualquier medio conveniente, por
ejemplo, una agarradera, grapa o adhesivos; sin embargo, en el método preferido está unida al apoyo. La unión se
puede hacer con cualquier adhesivo no reactivo, por un método térmico en el que la superficie del apoyo se funde
lo suficiente para atrapar algo del material usado en la capa hidrófila, o por métodos de unión por microondas o
ultrasonidos que igualmente funden las almohadillas de muestra hidrófila al soporte.
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La interacción entre el peróxido de hidrógeno y los reactivos en la almohadilla 11 produce un cambio visual.
Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno puede reaccionar con un colorante intermedio o precursor, en una reacción
catalizada o no catalizada, para producir una forma oxidada del intermedio o precursor. Este material oxidado puede producir el producto coloreado o reaccionar con un segundo precursor para formar el colorante final. Ejemplos
no limitantes de reactivos incluyen peroxidasa y un aceptor de oxígeno tal como: o-dianisidina; o-toluidina; o-tolidina; bencidina; ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), hidrazona del 3-metil-2-benzotiazolinona más
N,N-dimetilanilina, fenilo más 4-aminofenazona, 2,4-dicloro-fenol sulfonado más 4-aminofenazona, hidrazona del
3-metil-2-benzotiazolinona más ácido 3-(dimetilamino)benzoico, 2-metoxi-4-alil fenol; y 4-aminoantipireno-dimetilanilina. Ejemplos adicionales del tipo indicador simple incluyen 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina, o-toluidina y goma
de guaica; parejas de indicadores útiles incluyen 4-aminoantipirina con 2-metil indol, 4,5-dicloro-2-hidroxibencensulfonato (DCHBS) o (CNSP). Una pareja corriente de colorantes es hidrocloruro de la hidrazona del 3-metil-2benzotiazolinona (MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB); tal pareja de colorantes y su uso en un sistema de medida para medir los niveles de glucosa en sangre se describe en la patente de EE.UU. número 5.059.394.
Se puede usar una pareja de colorantes que comprende la hidrazona del 3-metil-2-benzotiazolinona en forma libre
o en forma ácida (MBTH) y 8-anilino-1-naftalensulfonato, en forma ácida o de sal (ANS) en lugar del par corriente de colorantes MBTH-DMAB. Es menos soluble después de la oxidación y, por lo tanto, proporciona un punto
final más estable, con mínimo desteñido del colorante, comparado con la pareja de colorantes de MBTH-DMAB
oxidados.
La patente de EE.UU. número 5.563.031 describe un sistema adicional de reactivos que comprende una pareja de
colorantes capaz de formar un cromóforo después de oxidarse con peróxido de hidrógeno u otro agente oxidante; la
pareja de colorantes comprende el compuesto:
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en el que R se selecciona entre el grupo compuesto por alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heterociclo,
amina cuaternaria o restos de ácidos orgánicos e Y se selecciona entre el grupo compuesto por NO2 , SO3 − , H, halógeno,
alquilo o SiZ3 en el que Z es alquilo o arilo. Preferiblemente, Y es H. En una realización preferida R es:
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en el que cualquiera de los R1 , R2 y R3 se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por H, alquilo,
arilo, sililo, halógeno, hidróxido, mercaptido, alcóxido, tioalcóxido, amina, sulfonato o carboxilato; y X se selecciona
entre el grupo compuesto por amina, sulfonato o carboxilato.
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La sustancia peroxidativamente activa en la composición de ensayo es preferiblemente peroxidasa obtenida de
fuentes naturales tales como rábano picante y patata. Se pueden usar otras sustancias que tienen actividad peroxidativa, que incluyen compuestos inorgánicos que tienen actividad peroxidasa tales como mezclas de yoduro potásico
y molibdato sódico, así como otros yoduros, tales como yoduros sódico y amónico, y otros molibdatos, tales como
molibdatos potásico y amónico. Además, se pueden usar urohemina y varias otras sustancias porfirinas que tienen
actividad peroxidativa. Con ellas se pueden usar diversos compuestos formadores de complejos que activan las metaloporfirinas, pero que no actúan por si mismas, tales como 2-aminobenzotiazol, piridina, bipiridilo, bipiridilpiridina,
ácido nicotínico o similares. Otras sustancias que no son enzimas pero que tienen actividad peroxidativa incluyen
compuestos tales como sulfocianato de hierro, tanato de hierro, ferrocianuro ferroso, sulfato de cromo y potasio y
similares.
También se pueden añadir a la composición componentes adicionales tales como tampones, agentes tensioactivos
y estabilizantes. El pH, y por lo tanto la adición de una sustancia tampón, puede determinar el tono de color de una
forma particular de un componente indicador. Por ejemplo, el Naranja Ácido 8 se oxida de naranja a un color paja
pálido a pH 7,5, pero se oxida a un amarillo (pálido) a pH 9,5. El Rojo Nitro se oxida de púrpura a un marrón débil
a pH 7,5, pero se oxida a un marrón azulado débil a pH 9,5. Una condición de pH puede ser más deseable que otra
para producir el intervalo deseado de tonos. Se conocen muchas sustancias tampón para los expertos en la técnica
y se pueden usar, dado que no interfieren con la acción de la peroxida y el peróxido de hidrógeno, para oxidar los
componentes indicadores. Cada uno de los colorantes y parejas de colorantes descritos anteriormente se han descrito
previamente en la técnica anterior con respecto al análisis de analitos en muestras de suero tales como glucosa en
sangre. En tales sistemas, una enzima adicional, tal como gluconasa, reacciona con el analito para producir peróxido
de hidrógeno en relación con la cantidad de analito presente. Los reactivos descritos anteriormente después miden el
contenido de peróxido de hidrógeno para determinar el contenido de analito en la muestra de suero. En ese tiempo, no
eran conocidas para la medida de la exposición de peróxido de hidrógeno en una atmósfera.
El indicador 10 se puede construir y operar de varias formas. Por ejemplo, se puede suministrar sin ningún reactivo
en la almohadilla 11. En esta realización, el indicador 10, sin reactivos, se expone a la atmósfera de peróxido de
hidrógeno y después de tal exposición se aplica a la almohadilla 11 una disolución acuosa que contiene a los reactivo,
o disoluciones separadas de cada uno de los componentes reactivos, para iniciar la reacción. Como se mostrará más
adelante, la reacción continua con el tiempo y es preferible tomar una medida del cambio de color en un momento
específico después de hidratar la almohadilla 11 con los reactivos. Alternativamente, uno o más de los reactivos pueden
estar en la almohadilla 11 mientras se expone el indicador 10 a la atmósfera de peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, la
almohadilla 11 puede estar ya impregnada con el receptor de oxígeno antes de exponer el indicador a la atmósfera de
peróxido de hidrógeno, en cuyo caso la almohadilla simplemente necesita hidratarse con una disolución de peroxidasa
para comenzar la reacción. La almohadilla 11 puede contener tanto la peroxidasa como el receptor de oxígeno antes
de exponer el indicador a la atmósfera de peróxido de hidrógeno, en cuyo caso la almohadilla simplemente necesita
hidratarse con agua para comenzar la reacción. Dependiendo de la cantidad disponible de peróxido de hidrógeno y
agua en la atmósfera, puede ser preferible para conseguir un control mejor omitir la peroxida en la almohadilla 11
hasta estar listo para comenzar la reacción. Demasiado peróxido de hidrógeno puede desactivar o inhibir la enzima, y
demasiada agua puede iniciar la reacción demasiado pronto.
El método de análisis de esta invención preferiblemente se atiene a un cambio en la absorbancia espectral, medida
por reflectancia difusa, que depende de la exposición integrada del peróxido de hidrógeno presente en la almohadilla
11. Después de que el indicador 10 se ha expuesto a una atmósfera de peróxido de hidrógeno, la almohadilla 11 se
hidrata después en presencia de la peroxidasa y del aceptor de oxígeno, iniciándose de ese modo la reacción. Se debe
medir cuidadosamente el tiempo para la medida desde el comienzo de la hidratación, o se puede medir la absorbancia
durante un tiempo para determinar cuando la reacción ha alcanzado un punto predeterminado para la medida. La
absorbancia en esta aplicación se refiere no sólo a luz dentro del intervalo visual de longitudes de onda sino también
fuera del intervalo visual de longitudes de onda, tal como radiación infrarroja y ultravioleta. De estas medidas de
absorbancia se puede calibrar una escala de desarrollo de color en términos de nivel de peróxido de hidrógeno.
Se puede fabricar un instrumento adecuado, tal como un espectrofotómetro de reflectancia difusa con software
apropiado, para leer automáticamente la reflectancia a ciertos tiempos, calcular la velocidad de cambio de la reflectan5
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cia, y, usando factores de calibración, obtener los niveles de peróxido de hidrógeno. Un dispositivo tal 60 se muestra
esquemáticamente en la Fig. 2, con una realización física mostrada en las Fig. 3 y 4. Al menos una fuente de luz 5,
por ejemplo, un diodo emisor de luz (LED) de alta intensidad, proyecta un rayo de luz sobre la almohadilla 11. Una
porción sustancial de esta luz (al menos 25%, preferiblemente al menos 35% y más preferiblemente al menos 50%, en
ausencia del producto de reacción) se refleja de forma difusa de la almohadilla de reactivo y se detecta con un detector
de luz 6, por ejemplo un fototransmisor que produce una corriente de salida proporcional a la luz que recibe.
La fuente de luz 5 y/o el detector 6 se pueden adaptar para generar o responder, si se desea, a una luz de longitud
de onda particular. La salida del detector 6 pasa a un amplificador 7, por ejemplo, un circuito integrado lineal que
convierte la corriente del fototransmisor en un voltaje. La salida del amplificador 7 puede alimentarse a un circuito de
muestreo y retención 8. Éste es una combinación de circuito integrado lineal/digital que muestrea o sigue el voltaje
analógico del amplificador 7 y, con la orden procedente del microprocesador 20, cierra o retiene el voltaje al nivel de
ese momento.
Un convertidor analógico a digital 19 toma el voltaje analógico procedente del circuito de muestreo y retención
8 y lo convierte a, por ejemplo, un número digital binario de doce bits con la orden del microprocesador 20. El microprocesador 20 puede ser un circuito integrado digital. Cumple las siguientes funciones de control: 1) cronometrar
el tiempo para todo el sistema; 2) lectura de la salida del convertidor analógico/digital 19; 3) junto con el programa
y la memoria de datos 21, almacenar los datos correspondientes a la reflectancia medida a intervalos de tiempo específicos; 4) calcular los niveles de peróxido de hidrógeno de las reflectancias almacenadas; y 5) emitir los datos al
visualizador 22. La memoria 21 puede ser un circuito integrado digital que almacena los datos y el programa operativo
del microprocesador. El dispositivo visualizador y generador de informes 22 puede tener diversos formatos de copia
permanente y copia transitoria. Preferiblemente comprende un indicador visual, tal como un cristal líquido (LCD) o
visualizador LED, pero también puede ser una impresora de cinta, señal audible, o similar. Si se desea, el instrumento
también puede incluir un interruptor de arranque-parada y puede proporcionar una salida de tiempos audible o visible
para indicar los tiempos para aplicar las muestras, hacer lecturas, etc.
En la presente invención, el propio circuito de reflectancia se puede usar para iniciar el cronometraje midiendo
la disminución de la reflectancia que tiene lugar cuando la porción acuosa de la disolución de suspensión aplicada a
la almohadilla de reactivos 11 migra a la superficie en la que se mide la reflectancia. Típicamente, el dispositivo de
medida se enciende en el modo “listo” en el que las lecturas de reflectancia se hacen automáticamente a intervalos
estrechamente espaciados (típicamente aproximadamente cada 0,2 segundos) de la tira reactiva sin reaccionar, típicamente blanca grisácea, sustancialmente seca. Típicamente, la medida inicial se hace antes de penetrar la matriz con
el fluido hidratante pero se puede hacer después de que el fluido se haya aplicado en un lugar del elemento reactivo
distinto a donde se ha de medir la reflectancia. El valor de reflectancia se evalúa por el microprocesador, típicamente
mediante valores sucesivos almacenados en memoria y después comparando cada valor con el valor inicial sin reaccionar. Cuando la disolución acuosa penetra la matriz reactiva, la disminución en la reflectancia señala el comienzo de
la medida del intervalo de tiempo. Se pueden usar las disminuciones de reflectancia de 5-50% para iniciar el cronometraje, típicamente una disminución de aproximadamente 10%. De esta forma simple hay una sincronización exacta
entre el medio de ensayo que alcanza la superficie en la que se toman las medidas y la iniciación de la secuencia de
lecturas, sin requerimientos de actividad por el usuario.
Como puede verse adicionalmente en las Fig. 3 y 4, si se desea, la tira reactiva 10 se puede guiar óptimamente en
una ranura 50 en la máquina de barrido 60 colocando una muesca 15 en el indicador 10 en aproximadamente el punto
medio de su borde superior. Moviendo la muesca 15 contra el poste 65, el indicador 10 pivotará alrededor del poste
65 en la ranura 15, de modo que sus bordes 16 encajarán en los lados 55 de la ranura 50. Por supuesto, esto también
alineará repetitivamente el agujero 14 sobre un centro de ensayo 80 que comprende al menos un LED 5 en la máquina
de barrido 60. Esto asegura que el agujero 14 que contiene una muestra tendrá una dosis uniforme de luz incidente
para el análisis.
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Preferiblemente se coloca sobre los sistemas ópticos una tapa u otra cubierta retirable 90 para proteger la unidad
de la luz ambiente. Aunque el procedimiento de inicialización puede comenzar con luz, la luz solar directa o la luz
ambiente de alta intensidad tiende a inhibir los resultados. La tapa 90 no necesita ser hermética a la luz, es suficiente
con que simplemente proteja la almohadilla 11 de la luz directa.
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La secuencia de medida se inicia después presionando un botón en el aparato de medida que activa el microcomputador para tomar una medida de la luz reflejada de la almohadilla reactiva sin reaccionar, llamada una lectura Rw . Se
retira después la tapa 90 y se aplica una disolución hidratante al indicador 10, típicamente mientras se registra la tira
reactiva 10 con los sistemas ópticos y el dispositivo de lectura. Como se describió anteriormente, la disolución hidratante puede contener algunos o todos los reactivos, o los reactivos se pueden incorporar en la almohadilla 11 haciendo
uso de agua desionizada como agente hidratante. Se prefiere que la tira reactiva se mantenga siendo registrada por los
sistemas ópticos con el fin de minimizar la manipulación. Después se cierra la tapa 90.
Se puede hacer una evaluación particularmente precisa del nivel de peróxido de hidrógeno usando la corriente de
fondo, es decir, la corriente procedente del fotodetector con la energía conectada pero sin luz reflejada procedente de
la almohadilla reactiva, con el fin de hacer una corrección de fondo.
Sin embargo, con una ligera modificación del procedimiento este valor se puede medir (o normalizar) con cada
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análisis para resultados más precisos. Cada LED se enciende antes de la hidratación de la almohadilla 11. Se mide
después un valor de reflectancia del indicador 10, con la tapa protectora de luz 90 cerrada. Si esta medida es diferente
de la medida original del valor de reflectancia, se aumenta la potencia al LED de manera que la reflectancia será la
misma. La razón para instituir este método es doble. Primero, la intensidad de la luz que emiten los diodos variará
en gran medida de LED a LED, incluso cuando el LED de medida es nuevo. Segundo, la eficacia del LED variará
tanto con la temperatura como con la vida del LED. Con este método, los resultados son repetitivos en la misma
escala.
Los datos brutos necesarios para calcular un resultado en un ensayo de peróxido de hidrógeno son una corriente
de fondo presentada como una reflectancia de fondo Rb , como se describió anteriormente; una lectura del indicador
sin tratar 10, Rw , que es aproximadamente 95% opaco a la luz y también se describió anteriormente; y una medida
del punto final, Rf . Usando las realizaciones preferidas descritas en la presente memoria, el punto final no es particularmente estable y debe ser cronometrado de forma precisa desde la hidratación. La medida del punto final, Rf ,
depende del tiempo desde la hidratación. Se requieren curvas de calibración diferentes con tiempos de hidratación
diferentes. Los resultados experimentales indican que una lectura de reflectancia a los 30 segundos, R30 , es adecuada
para determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno en la almohadilla 11. Una vez se determina el tiempo y se establece la calibración, el medidor descrito en la presente memoria lleva a cabo la medida automáticamente en el tiempo
predeterminado.
Los datos brutos se usan para calcular los parámetros proporcionales a la integración del peróxido de hidrógeno
que se puede visualizar más fácilmente que las medidas de reflectancia. Se puede usar si se desea una transformación logarítmica de la reflectancia análoga a la relación entre la absorbancia y la exposición integrada de peróxido
de hidrógeno observada en espectroscopía de transmisión (Ley de Beer). Ha probado ser particularmente útil una
simplificación de las ecuaciones de Kubelka-Monk, derivadas específicamente para la espectroscopía de reflectancia. En esta derivación K/S se relaciona a la exposición integrada de peróxido de hidrógeno con K/S definido por la
Ecuación 1.
(K/S)t = (1 − R*)2 /(2 x R*)
(1)
30
R* es la reflectancia tomada en un punto temporal final particular t, y es la fracción absorbida del rayo de luz
incidente descrito por la Ecuación 2, en la que Rt es la reflectancia en el punto final, R30 .
35
R* = (Rt − Rb ) / (Rw − Rb )
(2)
R* varía desde 0 para luz no reflejada (Rb) a 1 para luz totalmente reflejada (Rw). El uso de la reflectividad en
los cálculos simplifica en gran medida el diseño del medidor porque hacen innecesarios una fuente y un circuito de
detección sumamente estables, ya que estos componente se monitorizan con cada medida de Rw y Rb .
40
Para una lectura a una sola longitud de onda, K/S se puede calcular a los 30 segundos, (K/S)30 . Las curvas de
calibración que relacionan estos parámetros con las medidas de la exposición integrada de peróxido de hidrógeno
(HPIE) se pueden describir de manera precisa por la ecuación polinómica de tercer orden esbozada en la Ecuación
3.
45
HPIE = a0 + a1(K/S) + a2(K/S)2 + a3(K/S)3
50
(3)
La Tabla 1 muestra la reflectancia de fondo, Rb , la reflectancia del indicador sin reaccionar, Rw , la reflectancia del
punto final medido después de 30 segundos, R30 , la reflectividad a los 30 segundos , R*, y la derivada K/S a los 30
segundos, (K/S)30 , con diversas cantidades de peróxido de hidrógeno añadido a la almohadilla 11. La Figura 5 muestra
el K/S a los 30 segundos frente a la curva de calibración de peróxido de hidrógeno con los coeficientes a0, a1, a2 y a3
iguales a -21,567, 11,966, 12,78 y 0,1391 respectivamente.
55
60
65
7
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TABLA 1
Coeficientes para el polinomio de tercer orden ajustados de las curvas de calibración a una sola longitud de onda
5
10
15
20
25
30
El sistema 60 incorpora dos diodos 5. Si los diodos 5 se seleccionan para emitir luz a diferentes longitudes de onda,
se pueden cancelar matemáticamente las interferencias en la medida de la muestra. Esto está descrito de manera más
elaborada en la patente de EE.UU. número 5.304.468.
La invención que se ha descrito ahora de forma general, se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos
específicos que se presentan sólo con propósitos de ilustración y que no se han de considerar limitantes de la invención
a no ser que así se especifique.
Ejemplo 1
Procedimiento con la Tira reactiva ONE TOUCH™ con peróxido de hidrógeno/plasma de gas
35
40
45
50
55
Se procesaron tiras reactivas de la marca ONE TOUCH™ para ensayo de glucosa en sangre en el esterilizador
STERRAD® de peróxido de hidrógeno en fase vapor/plasma de gas para intentar cuantificar la exposición integrada
del peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) difundido en un paquete de ensayo. Estos paquetes de ensayo comprenden dispositivos que tienen un espacio interior que comunica fluidamente con el exterior del paquete de ensayo a través de
una restricción de difusión tal como un camino tortuoso que simula la dificultad en difundir un vapor estéril en los
dispositivos reales. El paquete de ensayo usado para este estudio es similar al paquete de ensayo de esterilización de la
patente de diseño de EE.UU. 325.442. La tira reactiva ONE TOUCH™ envuelta en TYVEK/MYLAR que contenía el
colorante (MBTH y DMAB) y la enzima (peroxidasa) se colocó en el compartimiento central del paquete de ensayo.
Se colocaron en la cámara con el paquete de ensayo dos cargas hospitalarias simuladas con dispositivos metálicos
y plásticos representativos. Todas las tiras se evaluaron a ciclos de 25 minutos de difusión y 15 minutos de plasma
con diferentes volúmenes de inyección de H2 O2 del 59%. Después de cada procedimiento, la tira reactiva se retiró
del paquete de ensayo y se hidrató con agua que contenía aproximadamente 17% de cola blanca marca ELMER (una
emulsión de resina de acetato de polivinilo). La lectura se tomó 30 segundos después de la etapa de hidratación. La
cola se usa como un agente espesante para que el líquido no se extienda sobre la tira reactiva. Como se muestra en la
figura 6, se observó que las tiras reactivas estándar de la marca ONE TOUCH™ para glucosa en sangre pueden ser
demasiado sensibles para ciertos volúmenes de peróxido inyectado. Con inyección de peróxido menor que 1250 µl, el
colorante indicador que reviste las tiras reactivas ONE TOUCH™ reacciona con el peróxido de hidrógeno para formar
un color azul con la ayuda enzimática de peroxidasa después de la hidratación. Con altos volúmenes de inyección de
H2 O2 del 59% (> 1.250 µl), las tiras reactivas de la marca ONE TOUCH™ experimentaron un “blanqueamiento” del
reactivo que las revisten. Se llevaron a cabo después estudios para identificar este fenómeno de “blanqueamiento”, y
para diseñar una disolución más apropiada.
Ejemplo 2
60
65
Nivel de colorante aumentado
Para evaluar si el mecanismo de blanqueo era una variable dependiente de la cantidad de colorante presente, se
ensayaron tiras reactivas con doble cantidad de colorante indicador. Con bajos volúmenes de inyección de H2 O2 del
59% (< 1.250 µl), estas nuevas tiras reactivas produjeron aproximadamente el doble de cambio de color que las tiras
reactivas normales (Véase la Fig. 6). Sin embargo, a niveles de peróxido de hidrógeno más elevados, la formación de
color se paró. Se observó un punto de corte definido. Esta degradación del colorante puede indicar otro mecanismo de
desactivación entre el peróxido de hidrógeno y los reactivos. Sin embargo, la incapacidad para leer las tiras reactivas
procesadas fue debida a insuficiente colorante indicador.
8
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Ejemplo 3
Cinética de los reactivos
5
10
15
También se evaluó la velocidad de reacción de las tiras reactivas procesadas. Las tiras reactivas se emplearon en
ciclos medios (como en el ejemplo 1) variando los volúmenes de inyección; y después se leyeron con un programa de
medida y captura. Como se muestra en la figura 7, se observó claramente que conforme aumenta la exposición integrada de peróxido de hidrógeno, disminuye la velocidad de reacción; y el mecanismo se interrumpió completamente
con 2.500 µl de H2 O2 del 59%. Aparentemente, con altos volúmenes de inyección de peróxido de hidrógeno, uno de
los ingredientes de las tiras reactivas debe desaparecer, inhibirse o desactivarse durante el procedimiento con peróxido
de hidrógeno/plasma de gas. A bajos niveles de inyección de peróxido de hidrógeno (250 µl y 500 µl), quedan en la
tira reactiva todavía suficiente colorante y enzima para producir el color azul. Cuando se introdujo más peróxido de
hidrógeno en la cámara (750 µl, 1.000 µl y 1.500 µl), tardó más tiempo en producirse el color azul. Esto indica que
la reducción tanto del colorante como de la enzima disminuye el mecanismo que produce el color azul. Cuando se
inyectó en la cámara 2.500 µl de peróxido de hidrógeno del 59%, no se pudo producir color azul. Aparentemente, el
colorante o la enzima deben desaparecer, inhibir o desactivar en un grado en el que no se puede formar el compuesto
azul. Como se muestra en el ejemplo 2, aumentando el nivel de colorante no mejoró la aparición de color a altos
volúmenes de inyección. Este fenómeno apunta a la desaparición, desactivación o inhibición de la enzima por los altos
niveles de peróxido de hidrógeno.
20
Ejemplo 4
Efecto del colorante (MBTH/DMAB) y la enzima (peroxidasa)
25
SE colocaron diez tiras reactivas ONE TOUCH™ envueltas en TYVEX/MYLAR en diez paquetes de ensayo. Para
maximizar el efecto del procedimiento de peróxido de hidrógeno/plasma de gas, el ciclo se llevó a cabo sin la carga
simulada y se procesó con 50 minutos de difusión y 15 minutos de ciclo de plasma mediante el esterilizador marca
STERRAD de peróxido de hidrógeno/plasma de gas con una inyección de 2.500 µl de H2 O2 del 59%, y se sometieron
diez muestras sin procesar a un análisis por duplicado.
30
Análisis uno
Concentraciones de MBTH/DMAB por HPLC
35
40
La cantidad de cada uno de los dos componentes del colorante (MBTH y DMAB) se determinaron por HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) en las tiras reactivas de ensayo marca ONE TOUCH™ tratadas (2.500 µl) y no
tratadas (Tabla 2). Ambos componentes del colorante se habían reducido aproximadamente 25% en las tiras reactivas
procesadas. Sin embargo, sobre la base de datos anteriores esta reducción no debería tener un impacto significativo
sobre el desarrollo del color en las tiras reactivas. Parecía haber suficiente colorante para desarrollar las tiras reactivas
tratadas al nivel dado de peróxido de hidrógeno.
TABLA 2
Análisis por HPLC de tiras reactivas tratadas y no tratadas
45
50
55
60
65
9
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Nótese que los niveles de DMAB y MBTH son áreas de los picos relativos al patrón interno.
Análisis dos
5
10
Análisis de peroxidasa por COBAS
El nivel de peroxidasa en las tiras reactivas se analizó usando COBAS, un analizador de enzimas fabricado por
Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN. El nivel de peroxidasa se vio afectado dramáticamente en las tiras
reactivas tratadas (Tabla 3). La actividad de la peroxidasa se redujo 96,2%. Esta reducción en la actividad de la
peroxidasa significaría que la alta exposición integrada del peróxido de hidrógeno desactiva (elimina) suficiente enzima
como para impedir el desarrollo del color azul.
TABLA 3
Análisis por COBAS de los niveles de enzima
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 5
Estudio de peroxidasa y tiempos
50
55
Se llevaron a cabo ensayos procesando tiras reactivas de la marca ONE TOUCH™ a cuatro volúmenes de inyección
(1.250, 1.450, 1.800 y 2.500 µl) en el esterilizador. Se evaluaron seis tiras reactivas por ciclo. La carga y las condiciones
del ensayo fueron las mismas que en el ejemplo 1. Se desarrollaron dos tiras reactivas inmediatamente después de
completarse el ciclo: una con DI H2 O (agua desionizada) y otra con disolución de peroxidasa (0,03% en peso). A
baja exposición integrada de peróxido de hidrógeno, ambas disoluciones desarrollaron las tiras reactivas (véase la
Tabla 4). A mayor exposición integrada de peróxido de hidrógeno (>1.500 µl), no se observó cambio de color en
las tiras reactivas tratadas cuando se hidrató con DI H2 O (toda la peroxidasa se desactivó). Sin embargo, se formó
instantáneamente un color azul oscuro en las mismas tiras reactivas sin tratar cuando se hidrataron con disolución de
peroxidasa. Este experimento confirmó que altos niveles de peróxido de hidrógeno desactivan la peroxidasa.
60
65
Con el fin de entender el efecto del tiempo en las tiras reactivas tratadas, se analizaron dos tiras reactivas a las 24
horas y dos a las 48 horas. No hubo cambio de color en ninguna de las tiras reactivas desarrolladas con DI H2 O. Pero
todas las tiras tratadas se volvieron azul oscuro en un instante cuando se desarrollaron con disolución de peroxidasa.
Esto sugiere que con el tiempo el peróxido de hidrógeno continúa eliminando la peroxidasa activa de las tiras reactivas,
y que el peróxido de hidrógeno es estable en las tiras reactivas al menos durante 48 horas después de completarse el
ciclo.
10
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TABLA 4
Análisis cualitativo de la actividad del peróxido de hidrógeno con el tiempo con la enzima peroxidasa
5
10
15
20
25
30
35
Comentarios:
• Los tres primeros volúmenes de inyección a los 5 min de ensayo cambiaron de blanco a algo de tonalidad
azul. Sin embargo, las tiras reactivas desarrolladas con peroxidasa cambiaron a un color azul mucho más
oscuro.
40
45
• La velocidad de reacción para las tiras reactivas desarrolladas con peroxidasa es más rápida que con DI
H2 O.
• Con altos volúmenes de inyección (2.500 µl) las tiras reactivas no se pueden desarrollar con DI H2 O. Se
desactiva toda la peroxidasa.
• El peróxido continúa eliminando a la enzima peroxidasa con el tiempo. Volúmenes de inyección más bajos
(1.250 µl, 1.440 µl, y 1.800 µl) no se desarrollaron con agua (no cambio de color) a las 24 y 48 horas, al
contrario que después de 5 min.
50
55
60
65
• El peróxido no abandona la superficie de nylon de las tiras reactivas con el tiempo. Las tiras reactivas se
desarrollaron con peroxidasa hasta 48 horas después del ensayo.
Se llevó a cabo también otro ensayo para medir la velocidad de reacción en las tiras no tratadas. Se evaluaron
tres volúmenes de inyección (500, 1.450, y 2.500 µl); dos tiras por ciclo. Se observó que a volúmenes de inyección
más bajos las tiras reactivas que se desarrollaron con disolución de peroxidasa fueron significativamente más rápidas
que las tiras reactivas tratadas con volúmenes de inyección mayores. Se cree que la peroxidasa remanente en las tiras
reactivas cuando se trataron con bajo nivel de peróxido de hidrógeno potenció el desarrollo del color. La tira tratada
con alta exposición integrada de peróxido de hidrógeno sólo se puede desarrollar con la adición de disolución de
peroxidasa debido a la desactivación de la peroxidasa en la tira reactiva durante el procedimiento con peróxido de
hidrógeno/plasma de gas.
Parece que la desactivación de la peroxidasa a alta exposición integrada de peróxido de hidrógeno impide la
reacción de copulación del colorante en el sistema de esterilización. Entendiendo el mecanismo real de la reacción,
se pueden hacer modificaciones a las tiras reactivas y al medidor marca ONE TOUCH™ para obtener una lectura
cuantitativa de peróxido de hidrógeno presente en cualquier área de la cámara. El colorante y la enzima pueden
estar en la tira reactiva antes o añadirla después del procedimiento con peróxido de hidrógeno o con peróxido de
hidrógeno/plasma de gas. La tira reactiva se puede usar para determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno en la
11
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5
10
disolución acuosa de peróxido de hidrógeno o en el procedimiento de peróxido de hidrógeno en fase vapor. Para el
procedimiento de peróxido de hidrógeno en fase vapor o el procedimiento de peróxido de hidrógeno/plasma de gas, se
necesita hidratar la tira reactiva después del procedimiento para iniciar el cambio de color. La disolución de hidratación
puede comprender al agente espesante para evitar que el líquido se extienda en el sustrato. El agente espesante puede
comprender goma blanca o cualquier otro producto químico que aumente la viscosidad de la disolución pero que no
interfiera la reacción química o la lectura de la reflectancia.
La invención que ahora ha sido descrita en su totalidad, será evidente a un experto normal en la técnica que se le
pueden hacer muchas modificaciones y cambios sin salirse del alcance de la invención como se define en las siguientes
reivindicaciones.
15
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30
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REIVINDICACIONES
5
1. Un método para detectar la exposición integrada del peróxido de hidrógeno en una atmósfera, comprendiendo
el método las etapas de:
colocar un sustrato capaz de absorber peróxido de hidrógeno en la atmósfera;
poner en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno;
10
leer el peróxido de hidrógeno con un colorante intermedio y una enzima para producir un cromóforo indicativo de
la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera; y
correlacionar el cromóforo con la exposición integrada de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
15
2. Un método según la reivindicación 1, en el que el colorante intermedio comprende una pareja de colorantes de
hidrocloruro de la hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) y ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB).
3. Un método según la reivindicación 1, en el que la enzima es peroxidasa.
20
4. Un método según la reivindicación 1, en el que el colorante intermedio comprende un aceptor de oxígeno.
5. Un método según la reivindicación 4, en el que el aceptor de oxígeno se selecciona entre el grupo compuesto
por:
25
o-dianisidina;
o-toluidina;
30
o-tolidina;
bencidina;
ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
35
hidrazona del 3-metil-2-benzotiazolinona más N,N-dimetilanilina;
fenilo más 4-aminofenazona;
40
2,4-dicloro-fenol sulfonado más 4-aminofenazona;
hidrazona del 3-metil-2-benzotiazolinona más ácido 3-(dimetilamino)benzoico;
2-metoxi-4-alil fenol; y
45
4-aminoantipireno-dimetilanilina
6. Un método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un receptor poroso.
50
7. Un método según la reivindicación 1, en el que la etapa de correlacionar el cromóforo con la exposición integrada
de peróxido de hidrógeno en la atmósfera comprende leer el cromóforo con un espectrofotómetro.
8. Un método según la reivindicación 1, en el que la etapa de correlacionar el cromóforo con la exposición integrada
de peróxido de hidrógeno en la atmósfera comprende comparar el cromóforo con una carta de colores.
55
60
9. Un método según la reivindicación 1, en el que el colorante intermedio está en el sustrato antes de poner en
contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
10. Un método según la reivindicación 1, en el que el colorante intermedio se añade al sustrato después de poner
en contacto el sustrato con el peróxido de hidrógeno.
11. Un método según la reivindicación 1, en el que el colorante intermedio tiene un primer color.
12. Un método según la reivindicación 1, en el que el cromóforo es la aparición de un segundo color.
65
13. Un método según la reivindicación 1, en el que el cromóforo es la desaparición del primer color.
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14. Un método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende eliminar el aire de la atmósfera y generar
vapor de peróxido de hidrógeno en la atmósfera.
5
15. Un método según la reivindicación 1, en el que la enzima está en el sustrato antes de poner en contacto el
sustrato con el peróxido de hidrógeno.
16. Un método según la reivindicación 1, en el que la enzima se añade al sustrato después de poner en contacto el
sustrato con el peróxido de hidrógeno.
10
17. Un método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende hidratar en el sustrato.
18. Un método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende añadir el agente espesante al sustrato.
19. Un método según la reivindicación 19, en el que el agente espesante comprende goma blanca.
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