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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 Evaluación del potencial bactericida de los extractos de bacterias ácido lácticas sobre el crecimiento in vitro de E. coli, Salmonella sp. y Listeria monocytogenes. Luz Adriana Gutierrez Ramírez1, Olga Ines Montoya Campuzano2, Orlando Simon Ruiz Villadiego3. 1 MSc Microbiología, Biologa Docente Universidad Nacional sede Medellín, Directora del Grupo de investigación en Biotecnología Microbiana, Universidad Nacional. 2 Orlando Simon Ruiz Villadiego, MSc en Ciencias químicas, Químico docente Universidad Nacional sede Medellín. 3 Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Microbiología Industrial y de investigaciones. Investigación básica RESUMEN: En esta investigación se trabajó con dos cepas nativas de bacteria ácido láctica del genero Lactobacillus, aisladas de productos fermentados; que producen un extracto complejo de ácidos orgánicos, peróxidos y péptidos con actividad bactericida,. Se obtuvieron extractos de Lactobacillus plantarum y L.brevis, inoculados en caldo MRS (Man rogosa sugar), los cuales se almacenaron a diferentes tiempos de almacenamiento, temperatura y pH con actividad bactericida frente a Salmonella sp, Escherichia coli y Listeria monocytogenes. Se observó una mejor actividad antibacteriana y estabilidad de la actividad, en el extracto almacenado a las temperaturas de 0ºC y 4ºC. Sin embargo, a pH 5.5 se presentó la mejor actividad en los dos extractos producidos por las dos cepas de Lactobacillus frente a las cepas de estudio. Los extractos fueron sometidos a calentamiento 50ºC y 80ºC presentado estabilidad, propiedad que es importante pues asegura el control de bacterias patógenas en algunos procesos en la industria alimentaria, La evaluación de la naturaleza del extracto se realizó por cromatografía en capa fina comprobando que posiblemente una gran parte de la acción bactericida del extracto de L. plantarum se debe a la acción de péptidos. ABSTRACT: In this investigation one worked with two native vine-stocks of bacteria acid lactic of the genre Lactobacillus, isolated of fermented products; that produce a complex extract of organic acids, peroxides and péptidos with bactericidal activity. There were obtained extracts of Lactobacillus plantarum and L.brevis, inoculated in broth MRS (Man rogosa sugar), which were stored to different times of storage, temperature and pH with bactericidal activity opposite to Salmonella sp, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Was observed a better antibacterial activity and stability of the activity, in the extract stored to the temperatures of 0ºC and 4ºC. Nevertheless, to pH 5.5 one presented the best activity in both extracts produced by both Lactobacillus's vine-stocks opposite to the vine-stocks of study. The extracts were submitted to warming 50ºC and 80ºC presented stability, property that is important since he assures the control of pathogenic bacteria in some processes in the food industry, The evaluation of the nature of the extract was realized for cromatografía in thin cap verifying that possibly a great partreport of the bactericidal action of the extract of L. plantarum owes to the action of péptidos. Palabras clave: bacteria ácido láctica, Salmonella sp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes. Key words: bacteria acid lactic, Salmonella sp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes. INTRODUCCIÓN Las bacterias ácido lácticas se pueden encontrar como microbiota natural en la leche, carnes y hortalizas, y cuando desdoblan sus carbohidratos como fuente de carbono producen una serie de metabolitos como ácidos orgánicos, peróxidos y péptidos de bajo peso molecular, los cuales actúan como agentes antimicrobianos. El consumo de estos microorganismos y sus productos de fermentación proporcionan grandes beneficios en la salud del consumidor, por lo tanto, se han considerado probióticos1. En la industria alimentaria, el uso de los Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 extractos producidos por estos son usados como bioconservantes; siendo una alternativa para sustituir, al menos parcialmente los agentes químicos en alimentos2 En la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín se han aislado cepas de Lactobacillus con efecto probiótico3, las cuales fueron caracterizadas por API como L. plantarum y L brevis. Sin embargo, las propiedades y caracterización del extracto producido por estas bacterias, aun no han sido determinados como sustancias bactericidas y como preservativo natural de los alimentos. En esta investigación, se evaluó el efecto bactericida de los extractos de estos aislados sobre el crecimiento in vitro de Listeria monocytogenes, Salmonella sp y E. coli MATERIALES Y MÉTODOS. Los extractos se obtuvieron inoculando el microorganismo en caldo MRS a 30ºC/72h/ anaeróbicamente, estos se centrifugaron a 10.000 rpm/ 4ºC/10 min. Con el fin de evaluar el efecto al pH y la temperatura de almacenamiento sobre la actividad del extracto; este se ajustó a pHs: 3.5, 4.5, 5.5 y se almacenó a 0°C, 4°C, y 25°C durante 8, 18 y 30 días4. La cantidad de inóculo fue 1x10-12 Unidades Formadoras de Colonia (UFC). Para determinar la estabilidad de los extractos al calor, estos se sometieron a 50ºC/30min y 80ºC/10min y los resultados se compararon con un blanco no calentado de un extracto conservado a 4ºC 5. Las unidades de actividad evaluadas fueron. 1x10-1= 10.56 UA, 1/2x10-2=50.8 UA y 1/3x10-3=333.33 Unidades de actividad (UA). Una unidad de actividad es el reciproco de la mayor dilución. Las pruebas de actividad se hicieron empleando el método de difusión en pozos6. Los extractos se precipitaron con ácido tricloroacético 5%v/v, y se centrifugaron a 13,000 rpm/10 minutos, los sobrenadantes se separaron y el precipitado obtenido se lavó varias veces con solución salina estéril 0.9% p/v. Luego se disolvió con 2 ml de solución buffer fosfato (50mM, pH 7.0), y se evaluó la actividad bactericida del sobrenadante y de la fracción precipitada5. La fracción precipitada se analizó utilizando cromatografía de capa fina, en placas de Sílica gel (20 x 20 cm; Macherey Nagel, Duren, Germany); y se empleó como fase móvil una mezcla de cloroformo-metanol-H2O (65:25:4 [vol/vol/vol]), las bandas de TLC fueron marcadas bajo luz ultravioleta a 310nm, éstas fueron raspadas y disueltas en una solución buffer fosfato(50mM, pH 7.0), evaluadas separadamente para determinar la banda que tuviera mas actividad. Se realizaron los análisis de los efectos principales de pH, temperatura y almacenamiento para cada uno de los extractos con las diferentes bacterias blanco, por el análisis de superficie de respuesta estimada en el programa STATISTIC 5.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Análisis de los efectos del tiempo de almacenamiento, temperatura y pH sobre el extracto de L. brevis en el control de Salmonella sp, E.coli y Listeria monocytogenes En el grafico 1, se puede observar el comportamiento del extracto L brevis vs Salmonella, en donde la actividad no se ve afectada por el tiempo de almacenamiento; el pH, influyó proporcionalmente en el control decrecimiento de Salmonella, al aumentar éste también lo hace la actividad. Entre 4 a 10 ºC se presentaron las mejores actividades, sin embargo a temperaturas superiores a 20°C, la actividad empieza a disminuir, lo cual, es importante para el control del crecimiento de este patógeno en alimentos refrigerados, estos resultados concuerdan con los reportados por Ogunbanwo y colaboradores en el 2003, quienes afirman que la actividad de los extractos de L .brevis disminuye por encima de los 37°C pero sin perder su actividad. 11,1 10,1 ZI 9,1 8,1 7,1 6,1 8 30 Tiempo dias 0 25 Temperatura 3.5 pH 5.5 Fig. 1. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el el extracto de L. brevis en el crecimiento de Salmonella sp. ZI. Zona de inhibición. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 En la grafica 2 se observa el efecto del extracto de L. brevis contra E .coli. A temperaturas de 25ºC la inhibición es alta, pero a esta temperatura se favorecía el crecimiento de células. El tiempo de almacenamiento como el pH presentaron el mismo perfil; a medida que transcurrió el almacenamiento la actividad de este disminuyó, y al aumentar el pH el comportamiento fue igual; sin embrago, se observó que a pH de 3.5 se obtiene un buen control de E coli.. De acuerdo a los resultados obtenidos por Ogunbanwo y colaboradores en el 2003 el extracto obtenido por Lactobacillus es mas estable a temperaturas de refrigeración y congelación. Fig. 2. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el el extracto de L .brevis en el control de E. coli ZI. Zona de inhibición. En el grafico 3 se observa el comportamiento del extracto L brevis frente a L. monocytogenes. A temperaturas de 25ºC, y pH de 5.5 se puede controlar fácilmente este microorganismo, sin embargo, esta temperatura no es recomendable pues permitió el crecimiento de algunas células. Tanto la estabilidad como la actividad del extracto permaneció constante en el tiempo, estos mismos resultados fueron obtenidos por A. Mezquita en el 2002, el cual encontró que la inhibición de L .monocytogenes por bacterias ácido lácticas permaneció activa durante 28 días a temperatura de refrigeración. Grafico de efectos principales Fig. 3. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto de L brevis en el control de L. monocytogenes ZI. Zona de inhibición. Análisis de los efectos del tiempo de almacenamiento, temperatura y pH sobre el extracto de L. plantarum en el control de Salmonella sp, E.coli y Listeria monocytogenes El gráfico 4. se observa el comportamiento del extracto de L. plantarum frente a Salmonella, el cual es un poco diferente con respecto al L. brevis, en donde, la temperatura es una variable importante para su control, a 0ºC se observó la mejor inhibición y a media que esta aumentaba disminuía hasta 12°C aumentando nuevamente la actividad a 25°C, aunque estas condiciones no son las ideales porque permitió el crecimiento de algunas células que pudieron haber quedado en suspensión; en cuanto al pH se puede decir que 4.5 controla este microorganismo, sin embargo, el tiempo de almacenamiento no afectó la estabilidad del extracto. Con lo Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 anterior, se puede recomendar el extracto de L .brevis para controlar el crecimiento de Salmonella sp en alimentos de pHs ácido y refrigerados. Grafico de efectos principales: ZI Fig. 4. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto L. plantarum en el control de Salmonella sp. ZI. Zona de inhibición. En el grafico 5. se observa que el tiempo de almacenamiento no afecta la actividad, aquí la temperatura de inhibición estuvo alrededor de los 12ºC, decayendo rápidamente, el pH de 5.5 arrojó los mejores resultados. Fig. 5. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto de L. plantarum en el control de E .coli ZI. Zona de inhibición. En los extractos de L .brevis como L plantarum contra L. monocytogenes, el pH presentó un efecto importante, porque a pH de 5.5 se observaron los niveles mas altos de inhibición, en cuanto a las temperaturas las mejores fueron las de refrigeración; aunque el tiempo de almacenamiento no afectó la estabilidad del extracto a lo largo del estudio. (Grafico 6) Fig. 6. Análisis de efectos principales del tiempo la temperatura y el pH para el control de L .monocytogenes por el extracto de L. plantarum Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 Evaluación de la estabilidad al calor de los extractos En el gráfico 7 se muestra que el calor de los extractos de L. plantarum vs bacterias blanco no afecto la estabilidad, aunque los mayores de inhibición se registraron frente 50ºC, y no se encontró ningún efecto a 80ºC contra E. coli. Con relación a los ensayos de L.brevis se puede decir que hubo estabilidad con las dos temperaturas. El ser estable al calentamiento es una a propiedad que es importante pues asegura el control de estas bacterias patógenas en todos los procesos de la industria alimentaria. Los reportes realizados por Alakomi, y colaboradores en el 2000 corroboran los resultados sobre el efecto antimicrobiano de bacterias ácido lácticas evaluados de manera positiva en bacterias Gram negativas como E.coli y Gram positivas como Listeria monocytogenes. Efecto del calor sobre los Extractos de Lactobacillus en la inhibición de bacterias patógenas 10 Zonas de inhibición en mm 9 55ºC 8 80ºC 7 6 5 4 3 2 1 0 L.brevis L.plantarum L.brevis Salmonella L.plantarum E.coli L.brevis L.plantarum Listeria monocytogenes Fig. 7. Efecto del calentamiento sobre la actividad de los extractos de L. plantarum y L. brevis contra Salmonella sp, E.coli, y Listeria monocytogenes Evaluación de la Unidades de actividad de los extractos Los datos observados en el grafico 8 muestra que estos son activos frente a las bacterias en casi todas las diluciones, excepto a 3/3x10-3 o 333.33UA de L. plantarum frente a E. coli, estos datos concuerdan con los obtenidos por Owubango et al.,2003 en donde el extracto muy diluido de L .plantarum no controló E. coli, en donde el extracto sin diluir su actividad es mejor. Actividad de extractos diluidos de Lactobacillus frente a bacterias patogenas 7 10,56 50,8 333,3333333 Actividad Bactericida (AU/ml) 6 5 4 3 2 1 0 L.brevis L.plantarum Listeria monocytogenes L.brevis L.plantarum Salmonella L.brevis L.plantarum E.coli Fig. 8. Efecto del extracto centrifugado diluido de L.plantarum y L.brevis sobre patógenos Gram positivos y Gram negativos Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 Naturaleza proteica del extracto La cromatografía en capa fina determino que la fracción precipitada del extracto de L .plantarum presento actividad antimicrobiana sobre L .monocytogenes .comprobando que una gran parte de la acción bactericida se debe a la acción de péptidos. CONCLUSIONES Los extractos de: L .plantarum y L. brevis tienen efecto antimicrobiano contra Salmonella sp, Listeria monocytogenes y E .coli, y con perfiles diferentes de inhibición, sin embargo con los extractos de L .plantarum se obtuvieron los mayores halos de inhibición. Los extractos tiene actividad a 0ºC y 4ºC sin crecimiento de células vegetativas, lo cual favorece su uso como bioconservantes en la industria alimentaria. El tiempo en el que se almacena los extractos no interfiere en la estabilidad y actividad de este, por lo tanto sus condiciones pueden permanecer durante 30 días A pH de 5.5 el extracto de L .plantarum presenta inhibición sobre E .coli y Listeria; y en el extracto de L. brevis el pH no interfieren en la inhibición. Los extractos son estables al calentamiento, propiedad que es importante pues asegura el control de bacterias patógenas en algunos procesos en la industria alimentaria. Por la cromatografía en capa fina se pudo comprobar que posiblemente una gran parte de la acción bactericida del extracto de L. plantarum se debe a la acción de péptidos. AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, laboratorios de Microbiologia industrial, al CNIC BIBLIOGRAFÍA 1. Farnworth E.R. Probiotics and prebiotics. En Handbook of Nutraceutical and functional foods. 25: 407-422, 2001. 2. Cintas L.M., Casans P., Hernandez P.E. 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