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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005
Evaluación del potencial bactericida de los
extractos de bacterias ácido lácticas sobre el
crecimiento in vitro de E. coli, Salmonella sp. y
Listeria monocytogenes.
Luz Adriana Gutierrez Ramírez1, Olga Ines Montoya Campuzano2, Orlando Simon Ruiz
Villadiego3.
1 MSc Microbiología, Biologa Docente Universidad Nacional sede Medellín, Directora del Grupo de investigación en
Biotecnología Microbiana, Universidad Nacional.
2 Orlando Simon Ruiz Villadiego, MSc en Ciencias químicas, Químico docente Universidad Nacional sede Medellín.
3 Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Microbiología Industrial y de investigaciones.
Investigación básica
RESUMEN: En esta investigación se trabajó con dos cepas nativas de bacteria ácido láctica del genero
Lactobacillus, aisladas de productos fermentados; que producen un extracto complejo de ácidos orgánicos,
peróxidos y péptidos con actividad bactericida,. Se obtuvieron extractos de Lactobacillus plantarum y L.brevis,
inoculados en caldo MRS (Man rogosa sugar), los cuales se almacenaron a diferentes tiempos de
almacenamiento, temperatura y pH con actividad bactericida frente a Salmonella sp, Escherichia coli y Listeria
monocytogenes. Se observó una mejor actividad antibacteriana y estabilidad de la actividad, en el extracto
almacenado a las temperaturas de 0ºC y 4ºC. Sin embargo, a pH 5.5 se presentó la mejor actividad en los dos
extractos producidos por las dos cepas de Lactobacillus frente a las cepas de estudio. Los extractos fueron
sometidos a calentamiento 50ºC y 80ºC presentado estabilidad, propiedad que es importante pues asegura el
control de bacterias patógenas en algunos procesos en la industria alimentaria,
La evaluación de la naturaleza del extracto se realizó por cromatografía en capa fina comprobando que
posiblemente una gran parte de la acción bactericida del extracto de L. plantarum se debe a la acción de
péptidos.
ABSTRACT: In this investigation one worked with two native vine-stocks of bacteria acid lactic of the genre
Lactobacillus, isolated of fermented products; that produce a complex extract of organic acids, peroxides and
péptidos with bactericidal activity. There were obtained extracts of Lactobacillus plantarum and L.brevis,
inoculated in broth MRS (Man rogosa sugar), which were stored to different times of storage, temperature and
pH with bactericidal activity opposite to Salmonella sp, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Was
observed a better antibacterial activity and stability of the activity, in the extract stored to the temperatures of 0ºC
and 4ºC. Nevertheless, to pH 5.5 one presented the best activity in both extracts produced by both
Lactobacillus's vine-stocks opposite to the vine-stocks of study. The extracts were submitted to warming 50ºC
and 80ºC presented stability, property that is important since he assures the control of pathogenic bacteria in
some processes in the food industry, The evaluation of the nature of the extract was realized for cromatografía in
thin cap verifying that possibly a great partreport of the bactericidal action of the extract of L. plantarum owes to
the action of péptidos.
Palabras clave: bacteria ácido láctica, Salmonella sp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes.
Key words: bacteria acid lactic, Salmonella sp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias ácido lácticas se pueden encontrar como microbiota natural en la leche, carnes y hortalizas, y
cuando desdoblan sus carbohidratos como fuente de carbono producen una serie de metabolitos como ácidos
orgánicos, peróxidos y péptidos de bajo peso molecular, los cuales actúan como agentes antimicrobianos. El
consumo de estos microorganismos y sus productos de fermentación proporcionan grandes beneficios en la
salud del consumidor, por lo tanto, se han considerado probióticos1. En la industria alimentaria, el uso de los
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extractos producidos por estos son usados como bioconservantes; siendo una alternativa para sustituir, al
menos parcialmente los agentes químicos en alimentos2
En la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín se han aislado cepas de Lactobacillus con efecto
probiótico3, las cuales fueron caracterizadas por API como L. plantarum y L brevis. Sin embargo, las
propiedades y caracterización del extracto producido por estas bacterias, aun no han sido determinados como
sustancias bactericidas y como preservativo natural de los alimentos. En esta investigación, se evaluó el efecto
bactericida de los extractos de estos aislados sobre el crecimiento in vitro de Listeria monocytogenes,
Salmonella sp y E. coli
MATERIALES Y MÉTODOS.
Los extractos se obtuvieron inoculando el microorganismo en caldo MRS a 30ºC/72h/ anaeróbicamente, estos
se centrifugaron a 10.000 rpm/ 4ºC/10 min. Con el fin de evaluar el efecto al pH y la temperatura de
almacenamiento sobre la actividad del extracto; este se ajustó a pHs: 3.5, 4.5, 5.5 y se almacenó a 0°C, 4°C, y
25°C durante 8, 18 y 30 días4. La cantidad de inóculo fue 1x10-12 Unidades Formadoras de Colonia (UFC).
Para determinar la estabilidad de los extractos al calor, estos se sometieron a 50ºC/30min y 80ºC/10min y los
resultados se compararon con un blanco no calentado de un extracto conservado a 4ºC 5. Las unidades de
actividad evaluadas fueron. 1x10-1= 10.56 UA, 1/2x10-2=50.8 UA y 1/3x10-3=333.33 Unidades de actividad (UA).
Una unidad de actividad es el reciproco de la mayor dilución. Las pruebas de actividad se hicieron empleando
el método de difusión en pozos6.
Los extractos se precipitaron con ácido tricloroacético 5%v/v, y se centrifugaron a 13,000 rpm/10 minutos, los
sobrenadantes se separaron y el precipitado obtenido se lavó varias veces con solución salina estéril 0.9% p/v.
Luego se disolvió con 2 ml de solución buffer fosfato (50mM, pH 7.0), y se evaluó la actividad bactericida del
sobrenadante y de la fracción precipitada5. La fracción precipitada se analizó utilizando cromatografía de capa
fina, en placas de Sílica gel (20 x 20 cm; Macherey Nagel, Duren, Germany); y se empleó como fase móvil una
mezcla de cloroformo-metanol-H2O (65:25:4 [vol/vol/vol]), las bandas de TLC fueron marcadas bajo luz
ultravioleta a 310nm, éstas fueron raspadas y disueltas en una solución buffer fosfato(50mM, pH 7.0),
evaluadas separadamente para determinar la banda que tuviera mas actividad. Se realizaron los análisis de los
efectos principales de pH, temperatura y almacenamiento para cada uno de los extractos con las diferentes
bacterias blanco, por el análisis de superficie de respuesta estimada en el programa STATISTIC 5.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Análisis de los efectos del tiempo de almacenamiento, temperatura y pH sobre el extracto de L. brevis
en el control de Salmonella sp, E.coli y Listeria monocytogenes
En el grafico 1, se puede observar el comportamiento del extracto L brevis vs Salmonella, en donde la actividad
no se ve afectada por el tiempo de almacenamiento; el pH, influyó proporcionalmente en el control
decrecimiento de Salmonella, al aumentar éste también lo hace la actividad. Entre 4 a 10 ºC se presentaron las
mejores actividades, sin embargo a temperaturas superiores a 20°C, la actividad empieza a disminuir, lo cual,
es importante para el control del crecimiento de este patógeno en alimentos refrigerados, estos resultados
concuerdan con los reportados por Ogunbanwo y colaboradores en el 2003, quienes afirman que la actividad de
los extractos de L .brevis disminuye por encima de los 37°C pero sin perder su actividad.
11,1
10,1
ZI 9,1
8,1
7,1
6,1
8
30
Tiempo dias
0
25
Temperatura
3.5
pH
5.5
Fig. 1. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el el extracto de L. brevis
en el crecimiento de Salmonella sp.
ZI. Zona de inhibición.
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En la grafica 2 se observa el efecto del extracto de L. brevis contra E .coli. A temperaturas de 25ºC la inhibición
es alta, pero a esta temperatura se favorecía el crecimiento de células. El tiempo de almacenamiento como el
pH presentaron el mismo perfil; a medida que transcurrió el almacenamiento la actividad de este disminuyó, y al
aumentar el pH el comportamiento fue igual; sin embrago, se observó que a pH de 3.5 se obtiene un buen
control de E coli.. De acuerdo a los resultados obtenidos por Ogunbanwo y colaboradores en el 2003 el extracto
obtenido por Lactobacillus es mas estable a temperaturas de refrigeración y congelación.
Fig. 2. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el el extracto de L .brevis
en el control de E. coli
ZI. Zona de inhibición.
En el grafico 3 se observa el comportamiento del extracto L brevis frente a L. monocytogenes. A temperaturas
de 25ºC, y pH de 5.5 se puede controlar fácilmente este microorganismo, sin embargo, esta temperatura no es
recomendable pues permitió el crecimiento de algunas células. Tanto la estabilidad como la actividad del
extracto permaneció constante en el tiempo, estos mismos resultados fueron obtenidos por A. Mezquita en el
2002, el cual encontró que la inhibición de L .monocytogenes por bacterias ácido lácticas permaneció activa
durante 28 días a temperatura de refrigeración.
Grafico de efectos principales
Fig. 3. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto de L brevis en
el control de L. monocytogenes
ZI. Zona de inhibición.
Análisis de los efectos del tiempo de almacenamiento, temperatura y pH sobre el extracto de L.
plantarum en el control de Salmonella sp, E.coli y Listeria monocytogenes
El gráfico 4. se observa el comportamiento del extracto de L. plantarum frente a Salmonella, el cual es un poco
diferente con respecto al L. brevis, en donde, la temperatura es una variable importante para su control, a 0ºC
se observó la mejor inhibición y a media que esta aumentaba disminuía hasta 12°C aumentando nuevamente la
actividad a 25°C, aunque estas condiciones no son las ideales porque permitió el crecimiento de algunas
células que pudieron haber quedado en suspensión; en cuanto al pH se puede decir que 4.5 controla este
microorganismo, sin embargo, el tiempo de almacenamiento no afectó la estabilidad del extracto. Con lo
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anterior, se puede recomendar el extracto de L .brevis para controlar el crecimiento de Salmonella sp en
alimentos de pHs ácido y refrigerados.
Grafico de efectos principales: ZI
Fig. 4. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto L. plantarum
en el control de Salmonella sp.
ZI. Zona de inhibición.
En el grafico 5. se observa que el tiempo de almacenamiento no afecta la actividad, aquí la temperatura de
inhibición estuvo alrededor de los 12ºC, decayendo rápidamente, el pH de 5.5 arrojó los mejores resultados.
Fig. 5. Análisis del efecto del tiempo de almacenamiento, la temperatura y el pH sobre el extracto de L.
plantarum en el control de E .coli
ZI. Zona de inhibición.
En los extractos de L .brevis como L plantarum contra L. monocytogenes, el pH presentó un efecto importante,
porque a pH de 5.5 se observaron los niveles mas altos de inhibición, en cuanto a las temperaturas las mejores
fueron las de refrigeración; aunque el tiempo de almacenamiento no afectó la estabilidad del extracto a lo largo
del estudio. (Grafico 6)
Fig. 6. Análisis de efectos principales del tiempo la temperatura y el pH para el control de L .monocytogenes
por el extracto de L. plantarum
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Evaluación de la estabilidad al calor de los extractos
En el gráfico 7 se muestra que el calor de los extractos de L. plantarum vs bacterias blanco no afecto la
estabilidad, aunque los mayores de inhibición se registraron frente 50ºC, y no se encontró ningún efecto a 80ºC
contra E. coli. Con relación a los ensayos de L.brevis se puede decir que hubo estabilidad con las dos
temperaturas. El ser estable al calentamiento es una a propiedad que es importante pues asegura el control de
estas bacterias patógenas en todos los procesos de la industria alimentaria. Los reportes realizados por
Alakomi, y colaboradores en el 2000 corroboran los resultados sobre el efecto antimicrobiano de bacterias ácido
lácticas evaluados de manera positiva en bacterias Gram negativas como E.coli y Gram positivas como Listeria
monocytogenes.
Efecto del calor sobre los Extractos de Lactobacillus en la inhibición de
bacterias patógenas
10
Zonas de inhibición en mm
9
55ºC
8
80ºC
7
6
5
4
3
2
1
0
L.brevis
L.plantarum
L.brevis
Salmonella
L.plantarum
E.coli
L.brevis
L.plantarum
Listeria monocytogenes
Fig. 7. Efecto del calentamiento sobre la actividad de los extractos de L. plantarum y L. brevis contra
Salmonella sp, E.coli, y Listeria monocytogenes
Evaluación de la Unidades de actividad de los extractos
Los datos observados en el grafico 8 muestra que estos son activos frente a las bacterias en casi todas las
diluciones, excepto a 3/3x10-3 o 333.33UA de L. plantarum frente a E. coli, estos datos concuerdan con los
obtenidos por Owubango et al.,2003 en donde el extracto muy diluido de L .plantarum no controló E. coli, en
donde el extracto sin diluir su actividad es mejor.
Actividad de extractos diluidos de Lactobacillus frente a bacterias patogenas
7
10,56
50,8
333,3333333
Actividad Bactericida (AU/ml)
6
5
4
3
2
1
0
L.brevis
L.plantarum
Listeria monocytogenes
L.brevis
L.plantarum
Salmonella
L.brevis
L.plantarum
E.coli
Fig. 8. Efecto del extracto centrifugado diluido de L.plantarum y L.brevis sobre patógenos Gram positivos y
Gram negativos
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Naturaleza proteica del extracto
La cromatografía en capa fina determino que la fracción precipitada del extracto de L .plantarum presento
actividad antimicrobiana sobre L .monocytogenes .comprobando que una gran parte de la acción bactericida se
debe a la acción de péptidos.
CONCLUSIONES
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Los extractos de: L .plantarum y L. brevis tienen efecto antimicrobiano contra Salmonella sp, Listeria
monocytogenes y E .coli, y con perfiles diferentes de inhibición, sin embargo con los extractos de L
.plantarum se obtuvieron los mayores halos de inhibición.
Los extractos tiene actividad a 0ºC y 4ºC sin crecimiento de células vegetativas, lo cual favorece su uso
como bioconservantes en la industria alimentaria.
El tiempo en el que se almacena los extractos no interfiere en la estabilidad y actividad de este, por lo tanto
sus condiciones pueden permanecer durante 30 días
A pH de 5.5 el extracto de L .plantarum presenta inhibición sobre E .coli y Listeria; y en el extracto de L.
brevis el pH no interfieren en la inhibición.
Los extractos son estables al calentamiento, propiedad que es importante pues asegura el control de
bacterias patógenas en algunos procesos en la industria alimentaria.
Por la cromatografía en capa fina se pudo comprobar que posiblemente una gran parte de la acción
bactericida del extracto de L. plantarum se debe a la acción de péptidos.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, laboratorios de Microbiologia industrial, al CNIC
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