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IV WORKSHOP PROBIÓTICOS, PREBIÓTICOS Y SALUD
MADRID, 31 ENERO – 1 FEBRERO 2013
NUEVA SÍNTESIS ENZIMÁTICA Y CARACTERIZACIÓN
ESTRUCTURAL DE DOS OLIGOSACÁRIDOS
POTENCIALMENTE BIOACTIVOS
M. Díez-Municioa, M. Herreroa, M. L. Jimenob, A. Montillaa, N. Corzoa, A. Olanoa, F. J. Morenoa*
(a)
Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM), Madrid, Spain.
(b) Centro Química Orgánica Manuel Lora Tamayo (CSIC), Madrid, Spain.
*e-mail: [email protected]
INTRODUCCIÓN
La producción de nuevos oligosacáridos bioactivos con actividad prebiótica suscita en la actualidad un gran interés debido a su posible
uso como ingredientes funcionales. En el presente trabajo, se describe la producción de dos oligosacáridos con potencial bioactividad,
denominados glucosil-lactosa (β-D-Gal-(1→4)-α-D-Glu-(2→1)-α-D-Glu) y lactulosacarosa (β-D-Gal-(1→4)-β-D-Fru-(2→1)-α-D-Glu),
mediante síntesis enzimática empleando una dextransacarasa (EC 2.4.1.5) de Leuconostoc mesenteroides B512-F como consecuencia
de la transferencia de la unidad de glucosa de la sacarosa (donante) a la lactosa y lactulosa (aceptores), respectivamente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reacción enzimática
Preparación de
los substratos
y la enzima
Análisis cromatográfico
LC-RID
Mezcla
Sacarosa
: Aceptor
(Lactosa o
Lactulosa)
 Columna de sílice con
grupos amino ligados.
 Fase reversa.
 Modo isocrático,
ACN/H2O 75:25.
Mezcla de
reacción
Optimización condiciones de síntesis:
 Concentración de substratos.
 Ratio Sacarosa : Aceptor.
 Concentración de enzima.
 Tiempo de incubación.
 Temperatura y pH.
Enzima
Dextransacarasa
de Leuconostoc
mesenteroides
B512-F
Purificación del
compuesto de
interés con LC-RID
con columna
semipreparativa,
para su posterior
caracterización
mediante NMR
Agilent 1220
- 1260 RID
GC-MS
Agilent 7890A 5975C MSD
quadrupole
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Glu
(donador)
1600
lactosa
1050
500
Glu’
NMR
leucrosa
fructosa
(aceptor)
-50
5
10
15
20
Tiempo (min)
0 horas
24 horas
Síntesis de lactulosacarosa
Sacarosa
Gal
sacarosa
Glu
LC-RID
sacarosa
2150
(donador)
lactulosa
Fru
(aceptor)
1600
Gal
1050
500
NMR
leucrosa
2150
glucosa
Respuesta del detector (nRIU)
LC-RID
fructosa
glucosa
Lactosa
Condiciones óptimas:
sacarosa:lactulosa 30:30 ó 20:40, en AcNa
20mM con 10 mg/LCaCl2, pH 5.2, Tª30ºC,
enzima dextransacarasa 2.4 U/mL,
tiempo de reacción: 8h.
Rendimiento lactulosacarosa: 35%
Respuesta del detector (nRIU)
Síntesis de glucosil-lactosa
Kojibiosa
Condiciones óptimas:
sacarosa:lactosa 30:30 en AcNa 20 mM
con 10 mg/L CaCl2, pH 5.2, Tª 30ºC,
enzima dextransacarasa 0.8 U/mL,
tiempo de reacción: 24h.
Rendimiento glucosil-lactosa: 50%
-50
5
10
15
20
Lactulosa
Tiempo (min)
0 horas
8 horas
Los trisacáridos glucosil-lactosa y lactulosacarosa se sintetizaron dando lugar a rendimientos en peso respecto a los aceptores
de partida de hasta un 50% y un 35%, respectivamente, bajo las condiciones óptimas de reacción.
Atendiendo a las estructuras elucidadas por RMN, ambos oligosacáridos podrían presentar actividad prebiótica debido a que se ha
descrito que el enlace α-(1→2) presenta una alta resistencia a la digestión gastrointestinal en animales y humanos.
Además, el trisacárido glucosil-lactosa, es un derivado galactosilado de la kojibiosa (2-O-α-D-glucopiranosil-D-glucosa), disacárido que
presenta un gran potencial prebiótico según diversos estudios descritos en la bibliografía. Igualmente, la lactulosacarosa, al tener
lactulosa como estructura base, es de esperar que posea las propiedades beneficiosas atribuidas a este disacárido, tales como la
estimulación selectiva de las bacterias beneficiosas en el intestino grueso y la regulación del tránsito intestinal. Asimismo, dado su mayor
peso molecular con respecto a la lactulosa, podría presentar la capacidad de ser fermentada en las zonas más distales del colon, que es
la región del intestino grueso que presenta una mayor incidencia de patologías digestivas y oncológicas.
CONCLUSIÓN
Los trisacáridos glucosil-lactosa y lactulosacarosa fueron sintetizados eficazmente siendo excelentes candidatos para su uso
como ingredientes funcionales debido a su potencial actividad prebiótica.
Referencias:
Díez-Municio, M.; Montilla, A.; Jimeno, M. L.; Corzo, N.; Olano, A.; Moreno, F. J. Synthesis and characterization of a potential prebiotic trisaccharide
from cheese whey permeate and sucrose by Leuconostoc mesenteroides dextransucrase. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 1945-53.
Díez-Municio, M.; Herrero, M.; Jimeno, M. L.; Olano, A.; Moreno, F. J. Efficient synthesis and characterization of lactulosucrose by Leuconostoc
mesenteroides B-512F dextransucrase. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 10564-71.
Agradecimientos:
Los autores agradecen la financiación otorgada por el MICINN
(proyectos 2010 FUN-C-FOOD CSD2007-00063 y AGL2011-27884)
y por la JCCLM y ERDF (proyecto POII10-0178-4685).
M.H. agradece al MICINN la concesión de un contrato “Ramón y Cajal”.
M.D.-M. agradece al CSIC la concesión de una beca JAE-predoc.