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Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre 2016
3er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT
Acapulco, Guerrero 21-23 de Septiembre 2016
Memorias
Análisis y comparación del nivel de expresión de ezrina en líneas celulares
tumorales cervicales.
Ricardo Alonso Galeana Ascencio (Becario)
[email protected]
Unidad Académica Preparatoria No. 16, Universidad Autónoma de Guerrero.
Marco Antonio Leyva Vázquez (Asesor)
[email protected]
Miguel Ángel Mendoza Catalán (Asesor)
[email protected]
Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero.
Introducción
El cáncer cervical es una alteración celular que se origina en el epitelio del cuello del útero y se
manifiesta inicialmente a través de lesiones precursoras, habitualmente de lenta y progresiva
evolución (Ministerio de Salud., 2005).
El cáncer cervical empieza creciendo lentamente; los tejidos normales del cuello uterino pasan por
un proceso conocido como displasia, durante el cual empiezan a aparecer células anormales
precursoras del cáncer, que normalmente son asintomáticas (Instituto de Salud del Estado de
México, 2016).
El factor de riesgo más importante para el cáncer de cuello uterino es la infección con el virus del
papiloma humano (VPH) (American Cancer Society, 2016). Prácticamente todos los casos
de cáncer cervical son causados por infecciones por VPH, y solo dos tipos, el 16 y el 18, son
responsables de casi 70% de todos los casos (Instituto Nacional del Cáncer (NIH), 2015).
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Muchas moléculas de señalización y proteínas reguladoras se localizan en la membrana celular, lo
que lo convierte en un punto focal para la generación, organización y dinámica de la corteza de
actina, y por lo tanto para la morfogénesis celular. (Marco Fritzsche, 2013).
Los resultados de varios estudios sugieren que Ezrina puede jugar un papel clave en el desarrollo
tumoral, invasión, y la metástasis, probablemente a través de regulación de la adhesión moléculas,
la participación en la transducción de señal celular, y señalización a otros canales de la membrana
celular en el tumor. Ezrina está sobre-expresado en el cáncer de cuello de útero, y su expresión está
estrechamente relacionada con metástasis y mal pronóstico. (Jienan Kong, 2016)
Objetivos
•
Determinar el nivel de expresión de Ezrina y su localización en células C33A, Hela, SiHa
y HaCaT para poder conocer la diferencia de expresión en las diversas líneas celulares.
 Conocer el nivel de expresión de Ezrina en las líneas celulares tumorales cervicales.
 Conocer la ubicación de Ezrina dentro de la célula y poder compararla entre las
líneas celulares tumorales cervicales.
Metodología
Inmunofluorescencia.
El método de inmunofluorescencia, es una técnica de laboratorio que identifica la presencia de
diversas sustancias gracias a los anticuerpos que se han vuelto fluorescentes. Coloreando los
anticuerpos y observándolos con una luz especial, es fácil de detectar e identificar las sustancias
sobre las que se fijan. Este método se utiliza para encontrar bacterias o anticuerpos en muestras
biológicas. (Kioskea , 2014)
a) Preparación de las muestras.
1) Se retiró el cubreobjetos del medio y se colocó en una portaobjetos limpio.
2) Se permeabilizaron las muestras con PBS-TRITÓN 0.2% por 5 minutos. Se lavó con
PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno.
b) Bloqueo de uniones inespecíficas.
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3) Se realizó el bloqueo de las uniones inespecíficas colocando 20 ul de PBS+BSA 0.1%
durante 30 minutos a cada portaobjetos.
c) Incubación de los anticuerpos.
4) Se agregaron 20µl del anticuerpo primario Anti-Ezrina 1:100 a cada una de las
muestras, y se dejaron reposar durante una hora dentro de la cámara húmeda.
5) Se lavaron con PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno.
6) Se agregaron 20µl del anticuerpo secundario Anti-Mouse 1:50 a cada una de las
muestras, y dejamos reposarla durante 2hrs dentro de la cámara húmeda.
7) Se lavaron con PBS por 3 intervalos de 5 minutos cada uno.
d) Montaje con DAPI.
8) Se realizó el montaje con DAPI, colocando una gota de éste en un portaobjetos nuevo y
se colocó el cubreobjetos de manera invertida. Dejamos en reposo toda la noche.
e) Observación en el microscopio.
9) Las laminillas se observaron en el microscopio de epiflourescencia en objetivos 40x y
60x.
Western Blot.
Técnica analítica, ampliamente utilizada para el estudio de proteínas. Este método permite la
detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. Con la técnica de Western Blot se
puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones posttraducionales como la fosforilación, y ser utilizada para comparar cuantitativamente los niveles de
proteína entre muestras. (Advansta Corporation, 2011)
a) Preparación de las muestras.
1) Se cuantificaron las proteínas totales.
2) Se colocó el volumen necesario para que hubiese 50µg de proteínas totales equivalente
a 6µl y se agregó 1.5 µl de buffer de muestra 4x
3) Se preparó el gel y a la par los reactivos.
b) Electroforesis en gel de acrilamida.
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4) Se añadió el marcador de peso molecular y las proteínas totales en los pocillos del gel.
5) El gel se colocó dentro de una cámara de electroforesis con buffer de corrida, y se
realizó la electroforesis durante una hora a 80 volts fijos, mientras las proteínas pasaban
al gel separador, una vez sucedido esto se incrementó la potencia a 120 volts.
c) Transferencia.
6) El gel se colocó dentro del casssette de transferencia en el siguiente orden: esponja,
papel filtro, gel, membrana, papel filtro y esponja. Este procedimiento se realizó en
húmedo.
7) Se colocó dentro de la cámara de transferencia con buffer de transferencia, y se realizó
la transferencia durante tres horas a 60 volts fijos.
d) Bloqueo de uniones inespecíficas.
8) Se retiró la membrana y se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS Leche 5%
durante 1 hora
e) Tinción con Rojo de Ponceau.
9) Se realizó la tinción con Rojo de Ponceau para verificar que la transferencia de las
proteínas del gel a la membrana se haya realizado de manera correcta.
f) Incubación de anticuerpos.
10) La membrana se incubó con el anticuerpo primario Anti-Ezrina a una dilución 1:1000
durante toda la noche a 4°C.
11) Posteriormente, se incubó el anticuerpo secundario Anti-Mouse 1:1000 durante dos
horas a temperatura ambiente.
12) Se realizaron diez lavados con PBS por intervalos de 10 minutos.
g) Detección.
13) Se colocaron 500 µl de Luminol en la membrana para realizar la detección
quimioluminiscente, colocándola en el C-Digit por 12 minutos.
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Resultados.
Inmunofluorescencia.
Western Blot
Expresión de Ezrina total
Nivel de expresión
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Líneas celulares
805
Ha
Si
He
La
C3
3A
Ha
Ca
t
0.0
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Conclusiones
Mediante la técnica de Inmunofluorescencia y Western Blot se pudo conocer la localización y el
nivel de expresión de Ezrina respectivamente dentro de las líneas celulares tumorales cervicales.
Referencias bibliográficas
Advansta Corporation. (2011). Análisis de Proteínas. Barcelona: ecogen.
American Cancer Society. (29 de 1 de 2016). American Cancer Society. Obtenido de
www.cancer.org
Dugdale, D. C. (9 de marzo de 2012). University of Maryland. Obtenido de
http://umm.edu/health/medical/spanishency/articles/cancer
Instituto de Salud del Estado de México. (4 de julio de 2016). Gobierno del Estrado de México.
Obtenido de http://salud.edomexico.gob.mx/html/article.php?sid=1011
Instituto Nacional del Cáncer (NIH). (19 de Febrero de 2015). Instituto Nacional del Cáncer
(NIH). Obtenido de http://www.cancer.gov/espanol/cancer/causasprevencion/riesgo/germenes-infecciosos/hoja-informativa-vph
Jienan Kong, C. D. (2016). Ezrin contributes to cervical cancer progression through. Oncotarget,
Vol. 7, No. 15, 19631, 19631.
Jienan Kong1, 2. C. (s.f.).
Kioskea . (Julio de 2014). Kioskea.net. Obtenido de http://salud.ccm.net/faq/7939inmunofluorescencia-definicion#q=Inmunofluorescencia&cur=1&url=%2F
Marco Fritzsche, R. T. (27 de Noviembre de 2013). Biophysical Journal. Obtenido de
http://www.cell.com/biophysj/fulltext/S0006-3495(13)05796-2
Ministerio de Salud. (2005). Cáncer Cérvico Uterino. Santiago: Guías Clínicas Auge.
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