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Rol neurotóxico del óxido nítrico
en la
Retinopatía del Prematuro
Resumen
La hipoxia-isquemia por asfixia perinatal (AP) es causa de lesiones en la retina,
pudiendo llevar a la ceguera por retinopatía proliferativa isquémica (RPI), patología
que incluye a la retinopatía del prematuro (ROP). Previamente demostramos por
estudios de microscopía óptica y electrónica, utilizando un modelo experimental de
AP, signos de neurodegeneración y la formación de una membrana epirretinal con
gliosis y neovascularización. El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol del óxido
nítrico (NO) como posible factor desencadenante de estas alteraciones, haciendo una
curva de tiempo en su expresión y actividad a los 7, 15, 21, 30 y 60 días postnatal en
ratas sometidas a AP; analizando la aplicación de hipotermia como estrategia
terapéutica. Con inmunohistoquímica para nNOS (óxido nítrico sintasa neuronal)
encontramos que a partir de los 21 días, aumenta significativamente la
inmunomarcación de neuronas amácrinas y ganglionares de retinas sometidas a AP.
Esto fue coincidente con el análisis de homogenatos de retina, en que aumenta
significativamente también a los 21 días la actividad enzimática y expresión de nNOS
por western blot. Por inmunofluorescencia múltiple observamos colocalización nNOST-OH (tirosina hidroxilasa) en células amácrinas y ganglionares, que liberarían NO en
exceso afectando a las propias neuronas ganglionares y a la astroglía (células de Müller
y glía perivascular). En AP además, la astroglía se marca intensamente con GFAP
(proteína gliofibrilar ácida) y N-Tyr (nitrotirosina), un marcador de nitrosilación
proteica por impacto del NO. Estos datos indican que, como resultado de la AP, se
genera una cascada de eventos moleculares neurotóxicos en la retina, evidenciables a
partir de los 21 días. En los animales sometidos a AP en condiciones de hipotermia no
se desarrollaron alteraciones, poniendo de manifiesto su potente efecto protector.
En conclusión, proponemos que el NO es un desencadenante de daño retiniano
y que una profundización en el estudio del efecto de la hipotermia podría permitir el
desarrollo de terapias tempranas que eviten el daño y mejoren la calidad de vida del
paciente.
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Introducción
La asfixia perinatal (AP), posee una incidencia de entre 2 a 4 casos por cada l000
nacimientos a término, relación que aún no se logró reducir a pesar de los avances en el
cuidado obstétrico y perinatal (Hill l99l, Younkin l992). Aproximadamente cuatro
millones de recién nacidos al año sufren esta afección, de los cuales una tercera parte
fallece, otro tercio se desarrolla normalmente, y el tercio restante sufrirá daños
neurológicos, entre los cuales se incluyen diferentes grados de retinopatía isquémica
(Hill l99l, Younkin l992; WHO report, 1991). En países subdesarrollados además, la AP
es un problema aún más grave, debido a que las precauciones o los cuidados no son
aplicados en forma adecuada (Costello, 1994).
La gravedad sufrida durante el parto no se relaciona con un pronóstico de
morbo-mortalidad, y es así como en casos de AP graves pueden no desarrollarse
lesiones neurológicas mientras que casos leves pueden terminar en parálisis cerebral o
muerte. Por otro lado, todo parece indicar que debe existir una predisposición para
desarrollar una lesión en el sistema nervioso central (SNC).
El crecimiento y desarrollo normal de un feto depende de un adecuado
intercambio de gases, nutrientes y productos de deshecho con la placenta y si estos
mecanismos no funcionan apropiadamente se establece una insuficiencia de los
requerimientos fetales. En este caso es preponderante el aporte de oxígeno, el que si
escasea o falta transitoriamente, llevará a un estado de asfixia aguda o crónica. En la
mayoría de los casos de AP, la causa de difícil identificación, y entre las conocidas las
más comunes incluyen la compresión de cordón umbilical, malas maniobras
obstétricas, placenta previa, desprendimiento de placenta, envejecimiento placentario,
hemorragia y/o anemia materna, toxemia gravídica, e infarto placentario. El síndrome
de distrés respiratorio y la apnea neonatal representan también causas de AP.
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En conclusión, la AP se encuentra entre aquellas afecciones que inducen un
estado de hipoxia-isquemia global en el SNC, siendo la gravedad de las secuelas
dependientes del grado de severidad y el tiempo en que se mantiene el arresto de
oxígeno. Entre las secuelas que se harán evidentes a corto o largo plazo se destacan el
Síndrome de Déficit de Atención e Hiperactividad (DSM-III, American Psychiatric
Association, 1987), epilepsias, retardo mental, la parálisis cerebral o espasticidad;
alteraciones auditivas y visuales (Younkin, 1992). Entre las últimas, la retina es
particularmente sensible a la isquemia, siendo sus capas más internas (limitante
interna, fibras del nervio óptico, células ganglionares, plexiforme interna y nuclear
interna) las más sensibles. Si bien numerosas hipótesis se han postulado acerca de esta
sensibilidad diferencial en respuesta a la noxa hipóxica ninguna de éstas ha sido
totalmente confirmada (Osborne, 2004).
Numerosos mecanismos han sido involucrados en el daño neuronal en la AP.
Entre los más importantes se encuentran la liberación de aminoácidos excitatorios
(Choi, 1987, Loidl, 1993), la generación de radicales libres (ROS), la liberación de óxido
nítrico y otros neurotransmisores, la acumulación de ácido láctico, el masivo ingreso de
calcio a las células, la degradación de los fosfolípidos de membranas y
lipoperoxidación (Farooqui, 1994) y las alteraciones en el citoesqueleto axonal
(neurofilamentos) (Cebral, 2006).
Estos mecanismos inician una cascada de eventos moleculares que conducen a
la muerte celular por apoptosis o necrosis. En este proceso, el ácido glutámico produce
una sobreactivación de sus receptores, incluyendo entre ellos los NMDA y AMPA
(Farooqui, 1991), generando un incremento del influjo de calcio y en consecuencia la
liberación de óxido nítrico (NO) por activación de la óxido nítrico sintasa (NOS). El NO
fue propuesto como causante de daño cerebral durante la isquemia (Beckman, 1991;
Dawson, 1991). Finalmente la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS),
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inducen la activación de lipasas, fosfolipasas, proteasas y proteínas kinasas. Dado que
la retina es un órgano compuesto por tejido nervioso, es particularmente vulnerable al
daño oxidativo, debido a su alta concentración de ácidos grasos rápidamente
peroxidables.
Aunque los daños excitotóxico y oxidativo pueden ocurrir independientemente,
hay una buena correlación entre la formación de ROS y la activación del receptor
glutamatérgico (Choi, 1987; Coyle, 1993). Los antioxidantes por ejemplo atenúan la
neurotoxicidad mediada por receptor de glutamato en cultivos celulares, esto indicaría
que la formación de ROS y la liberación de glutamato estarían relacionados en una
serie de eventos moleculares que provocan muerte neuronal durante la isquemia
(Dykens, 1987; Chan, 1990; Monyer, 1990; Pellegrini-Giampietro, 1990).
Por otro lado, hemos visto que el sexo de los animales sometidos a AP cobra
importancia, ya que los machos son más lábiles al daño hipóxico-isquémico (Loidl,
2000). Soustiel y col. (2005) han observado que en las hembras, el estradiol contribuiría
en un efecto neuroprotector ante un evento isquémico, al modular la expresión de Bcl-2
mediante receptores específicos.
Retinopatía desencadenada por AP
La AP puede desarrollar en casos severos, diferentes grados de retinopatías,
pudiendo llevar a la ceguera. En nuestro laboratorio, utilizando un modelo
experimental de AP en ratas, encontramos una histopatología compatible con la
descripción de retinopatía proliferativa isquémica (RPI), caracterizada por presentar
neovascularización e hipertrofia glial de las células de Müller en las capas más internas
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de la retina (zona epirretinal), como se observa en diferentes afecciones tales como
diabetes mellitus, oclusión de venas retinales y retinopatía del prematuro (ROP) (Rey
Funes, 2003). En países con tasas de mortalidad infantil de entre 1 y 6 ‰ la ROP está
emergiendo como la mayor causa de la ceguera evitable en los niños (Palmer, 1991,
Wright, 1998; Gilbert, 2001).
Retinopatía del prematuro (ROP)
Los niños con riesgo de desarrollar ROP son aquellos prematuros de bajo peso
colocados en incubadoras en condiciones de hiperoxia y los que reciben
oxigenoterapia. En el prematuro menor de 32 semanas, la estructura vascular de la
capa coroides se completa en períodos tempranos de la vida fetal y es el sustento
nutricio de las capas de la retina. El tejido coroideo es altamente vascularizado, y es
conocido que carece de la capacidad de autorregular el aporte de oxígeno en casos de
mayor flujo sanguíneo o aumento de la PaO2 (Hardy, 2000), por lo cual la hiperoxia de
las incubadoras, a la que son expuestos los bebés nacidos en forma prematura, resulta
tóxica. Esto es particularmente nocivo en los prematuros, ya que sus tejidos, al ser
inmaduros, no tienen eficazmente desarrolladas sus defensas antioxidantes, como los
sistemas enzimáticos superóxido dismutasa, catalasa y glutation peroxidasa (Jancov,
2001).
El desarrollo de la ROP consta de dos fases. La primera, se caracteriza por una
lesión de tipo oxidativa que daña el endotelio y oblitera los vasos en formación,
resultando en un área avascular observable en la periferia de la retina. El bajo
metabolismo en esta última zona, es la responsable de inducir la segunda fase, en que
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se desencadena neovascularización debida a la liberación de factores angiogénicos y de
crecimiento celular y vascular como el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF), como respuesta a la hipoxia (Hardy, 2000; Jancov, 2001; Smith, 2003).
Actualmente estamos viendo que la adrenomedulina, además de ser un vasodilatador,
jugaría también un papel importante como factor estimulante de la angiogénesis (Rey
Funes, 2006)
Rol del NO como neurotóxico inductor de RPI:
El NO es una molécula gaseosa que puede actuar como un mensajero
intracelular o un radical y se lo encuentra en varios sistemas celulares: células
endoteliales, macrófagos y neuronas. La enzima responsable de su síntesis, la óxido
nítrico sintetasa (NOS), difiere en los tres sistemas mencionados, presentando
isoenzimas que son denominadas nNOS, eNOS y iNOS (Bredt, 1990) respectivamente,
siendo las dos primeras constitutivas y la última inducible. La nNOS puede
considerarse específica de su cofactor nicotin-amida-adenina-dinucleótido-fosfato
diaforasa neuronal (NADPH-d) (Dawson, 1991; Hope, 1991), lo cual hace posible
localizar NOS mediante el método histoquímico de NADPH-d (Thomas y Pearse,
1964). La nNOS es calcio-calmodulina dependiente y produce NO a partir de Larginina.
El depender de la calmodulina sugiere que el NO sólo se sintetiza luego del
incremento de Ca++ intracelular, lo cual llevó a la hipótesis de que su activación se
encuentra ligado a receptores NMDA que contienen canal iónico para Ca++ (Moncada,
1993; Dawson, 1994).
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La síntesis de iNOS es independiente de la concentración de Ca++ y es activada
cuando se requieren grandes cantidades de NO durante un período prolongado, como
ante eventos de isquemia, lo cual puede producir aún mayor daño neuronal (Chao,
1992). Por ello, existe controversia acerca del rol del NO como neuroprotector o
neurotóxico, y de acuerdo a numerosos trabajos, parece comportarse de una u otra
manera según el estado de oxidorredución en que se encuentra (Lipton y Stamler,
1994).
Se ha establecido que el NO cerebral aumenta como respuesta a la estimulación
de los receptores ionotrópicos de aminoácidos excitatorios tipo NMDA, impactando
sobre la guanilato ciclasa soluble citosólica de las células blanco, con la consiguiente
formación de GMPc. El rol de este segundo mensajero en la acción del NO aún no está
claro.
Respecto del daño neuronal provocado por un proceso de hipoxia-isquemia, se
ha planteado que existe una población neuronal que muere durante la isquemia, pero
la muerte de otras células no ocurre inmediatamente sino que se requiere de horas o a
veces días para que esto suceda (Kirino, 1982; Pulsinelli, 1982). A este tipo particular de
muerte neuronal se la denomina muerte neuronal “postergada” (Dragunow y Preston,
1995). Esto provee una ventana temporal durante la cual la muerte celular podría ser
reducida si se aplica un tratamiento eficaz.
Aunque el NO es un mensajero intracelular relevante, cuando es generado en
altas concentraciones, durante un proceso hipóxico-isquémico, puede desencadenar
una cascada neurotóxica (Palmer, 1987; Dawson y Snyder, 1994; Dawson y Dawson,
1996; Moncada, 1993), al reaccionar con el anión superóxido, originando peroxinitrito
(ONOO-) que es altamente reactivo y que en su forma protonada decae rápidamente
formando OH y NO2 (Beckman, 1990). Además el NO por sí mismo puede ser tóxico
para las neuronas (Garhtwaite, 1991).
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Estrategia terapéutica:
Evidentemente el tratamiento más efectivo para las afecciones producidas por
la AP sería la prevención. Sin embargo, dadas las causas que la provocan, es
imprescindible la evaluación de otras estrategias terapéuticas preventivas del daño
neurológico y oftalmológico a largo plazo.
Tratamiento hipotérmico:
A partir de estudios previos en el laboratorio, la disminución de la temperatura
de 37°C a 15°C resulta en un significativo aumento en la sobrevida de los animales
experimentales sometidos a la AP. Cuando la AP se induce a baja temperatura (15°C),
casi el 100% de la camada experimental sobrevive más allá de los 100 minutos de
asfixia (Loidl y col., 1993; 1997; 1998). Además la hipotermia durante la AP tiene un
efecto preventivo de las consecuencias de la AP a largo plazo. Este hallazgo concuerda
con los estudios experimentales que demuestran que las bajas temperaturas protegen
las neuronas que fueron sometidas a isquemia cerebral transitoria. El efecto protector
estaría relacionado en un principio con la reducción de las demandas energéticas
cerebrales y el consecuente ahorro en el consumo de ATP (Young, 1983). También, el
tratamiento hipotérmico retrasaría la instalación de una acidosis extracelular por
acumulación de lactato, el cual fue propuesto como neurotóxico (Nedegaard, 1991).
Se han realizado algunas aplicaciones clínicas combinando hipotermia y
presión positiva de oxígeno en recién nacidos asfícticos que prometieron ser muy
exitosas (Westin, 1971). Así, existen antecedentes de experiencias clínicas en que
neonatos asfícticos fueron inmediatamente colocados en agua a una temperatura de 8 a
14°C hasta que presentaron respiración espontánea no asistida. Luego de este
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tratamiento se los controló durante 3 años evaluando su desarrollo; resultando
normales en todos los casos, incluso sin presentar episodios convulsivos (Dunn y
Miller, 1969). No queda claro por qué estos estudios no han tenido mayor repercusión
médica siendo que la muerte post-asfixia es cercana al 35%. Aunque no hay
controversias en cuanto a que una larga exposición al frío es perjudicial, no existen
evidencias de que una disminución transitoria de la temperatura corporal lo sea. Estas
evidencias clínicas históricas fueron prácticamente olvidadas hasta que a principio de
los años 80 la hipotermia vuelve a tomar vigencia como agente neuroprotector en el
infarto cerebral (Globus, 1987, Globus, 1989).
En experimentos previos del laboratorio, se ha observado que la AP a 37°C (en
condiciones de normotermia) presenta una mortalidad del 100% luego de 22 minutos
de asfixia. Sin embargo, a 15°C el 100% de los animales sobrevive. Por lo tanto la
mortalidad producida por AP (a 37°C) puede ser disminuida al cambiar la temperatura
(Loidl, 1997).
Como se mencionó anteriormente, en el laboratorio se ha demostrado que la
hipotermia protege de los cambios ultraestructurales en neuronas (necrosis y
citomegalia neuronal a los 6 meses de edad) (Loidl, 1997). Por otro lado la inducción de
la AP en condiciones de hipotermia previene la formación de astrocitosis reactiva así
como la hipertrofia de neuronas que expresan NADPH-d que se observan a largo plazo
en animales asfícticos.
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Objetivos
Los objetivos propuestos fueron los siguientes:
 Estudiar la participación del NO como posible agente neurotóxico
involucrado en el desarrollo del daño hipóxico-isquémico en la retina.
 Analizar las consecuencias que desencadena el NO a nivel molecular,
bioquímico y estructural en diferentes edades de animales que fueron
expuestos a AP.
 Evaluar la aplicación de hipotermia como estrategia terapeútica.
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Materiales y Métodos
Modelo de desarrollo de RPI por asfixia perinatal (AP):
Animales
En todos los casos se utilizaron ratas de la cepa Sprague-Dawley, con calidad
genética y sanitaria certificada en el bioterio del Instituto de Biología y Medicina
Experimental, siguiendo las normas internacionales de FELASA (Federation of
European Laboratory Animal Science Associations).
Todos los procedimientos relacionados con el manejo y tratamiento de los
animales fue realizado de acuerdo con la guía de cuidados para animales de
laboratorio (revisada en 1996) de los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados
Unidos de Norteamérica (National Institute of Health Guiñe for the Care and Use of
Laboratory Animals - Publications No. 80-23).
Inducción de la asfixia
Se utilizaron ratas preñadas (n = 52) en el último día de gestación (22 días). Las
mismas fueron anestesiadas con hidrato de cloral 28% P/V (0.1ml/100g/peso); y
rápidamente histerectomizadas. Posteriormente, los fetos aún contenidos dentro del
útero extirpado, se sumergieron durante 20 minutos en: agua a 37°C (asfixia perinatal
severa en normotermia, AP) o agua a 15°C (AP en hipotermia, HIP). Inmediatamente
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luego de la AP, los fetos fueron extraídos del útero, secados de sus fluidos y
estimulados manualmente a respirar, siendo un signo importante de su recuperación el
boqueo o “gasping” (Fig. 1)
Se procedió entonces a ligar el cordón umbilical, y se mantuvo bajo observación
a los animales durante los 40-80 minutos posteriores al alumbramiento manual. Los
sobrevivientes fueron colocados con una rata madre sustituta (la cual tuvo cría
normalmente el mismo día), reemplazando parte de sus recién nacidos por los
experimentales asfícticos previamente identificados. Se consideraron animales
experimentales únicamente aquellos que cumplieron con los siguientes parámetros:
(1) longitud occipitocaudal > 41 mm;
(2) peso > 5 g.
En experimentos previos (Loidl, 1998) ha sido determinado que el porcentaje de
sobrevida de los animales depende del tiempo y de la temperatura en que se induce la
AP. En la AP en normotermia (37°C), existe un 100% de sobrevida hasta 15 min., 20%
de sobrevida a los 20 minutos y 0% de sobrevida más allá de los 22 min. En cambio, en
condiciones de hipotermia (15°C), la sobrevida se extiende dramáticamente hasta un
100% a los 100 minutos, siendo 0% recién más allá de los 145 min. Además, ha sido
observado que las ratas hembras presentan una sobrevida significativamente mayor
que los machos sometidos a AP en condiciones de normotermia.
En el presente estudio se utilizaron solamente ratas macho para evitar la
influencia de los estrógenos, generándose los siguientes grupos experimentales:
a) Controles nacidos por cesárea (CTL),
b) AP durante 20 minutos a 37°C (AP).
c) AP durante 20 minutos a 15°C (HIP).
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El modelo animal utilizado ha sido aprobado por los Comités de Ética del
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME), Buenos Aires, Argentina; del
Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia; de la UCLA, San Diego, Estados Unidos de
Norteamérica y del Akademisch Ziekenhuis Maastricht (AzM), Maastricht, Países
Bajos.
Obtención del tejido
Cuando los animales sometidos a AP (en condiciones de normotermia e
hipotermia), y sus controles, cumplieron los 60 días de edad, estos fueron anestesiados
con hidrato de cloral 28% P/V (0.1ml/100g/peso) por vía intraperitoneal, enucleados y
sacrificados. Luego, se descartaron los polos anteriores de los ojos y los cristalinos, para
facilitar la fijación de los polos posteriores que contienen las retinas. La fijación se
realizó por inmersión de las mismas en una solución de paraformaldehído al 4% en
buffer fosfato 0,1M pH 7,4 por 24 horas a 4°C. Luego se procedió con el material de
estudio de la siguiente manera:
Procesamiento de los tejidos para Microscopia Optica (M.O.)
Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia
Los bloques de tejido fueron crioprotegidos en sacarosa al 10%, 20% y 30%
durante 3 días sucesivos. Los bloques fueron posteriormente embebidos en Tisseu
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tec®, congelados a –70°C y cortados en secciones de 20 µm de espesor con un crióstato
Leitz “Lauda”. Las mismas se montaron en portaobjetos que previamente se
incluyeron en gelatina al 1,5% y se procesaron para las siguientes técnicas:
Inmunohistoquímica: Técnica de Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)
Detalles de esta técnica se pueden encontrar en Sternberger & Sternberger´s
PAP, 1986.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos (Ac) primarios:
a) Ac anti-nNOS (isoforma neuronal de la enzima óxido nítrico sintasa), anticuerpo
policlonal de conejo en una dilución de 1:1000.
b) Ac anti-iNOS (isoforma inducible de la enzima óxido nítrico sintasa) anticuerpo
policlonal de conejo en una dilución de 1:2500.
c) Ac anti-Ntyr (nitrotirosina), anticuerpo policlonal de conejo en una dilución de
1:3000 La Ntyr es un marcador de la nitrosilación de proteínas, blanco del NO
(Uttenthal, 1998).
La batería de Ac para el estudio del NO y sus diferentes isoformas, y de la
Nitrotirosina fue suministrada por el Laboratorio del Prof. Dr. Rodrigo García,
Instituto Cajal, CSIC, Madrid, España.
Inmunofluorescencia simple y doble
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:
a) Ac anti nNOS policlonal de conejo en una dilución de 1:3000
b) Ac anti tirosina hidroxilasa (TOH) monoclonal de ratón en una dilución de 1:25
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c) Ac anti iNOS policlonal de conejo en una dilución de 1:2500
d) Ac anti GFAP monoclonal de ratón en una dilución de 1:500
e) Ac anti Ntyr policlonal de conejo en una dilución de 1:1000
Los anticuerpos secundarios fluorescentes que se utilizaron:
a) Ac Streptavidina Alexa Fluor 660 conjugate rojo (Molecular Probes) en una dilución
de 1:1000
b) Ac α-rabbit CY2, verde (Sigma) en una dilución de 1:1000
Detalles de esta técnica se pueden encontrar en Rodrigo, 1996.
Inmunofluorescencia múltiple
Se utilizaron los Ac primarios arriba mencionados con el agregado del Ac DAPI
(marcador específico de núcleos) en una dilución de 1:1000. Como Ac secundarios se
utilizaron el FITC (Ac anti-mouse IgG) y Rhodamine red anti-rabbit en una dilución de
1:300. Por último, las secciones fueron fotografiadas en un microscopio confocal Leica
con filtros verde, azul y rojo.
Procesamiento del tejido para actividad enzimática de la NOS
Esta técnica se basa en la medida indirecta de la concentración de óxido nítrico
a través de la medición de la actividad enzimática de la proteína óxido nítrico sintasa
(NOS). Se siguieron los pasos de Radomski, 1993 y Rodrigo et al. 2001.
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Procesamiento del tejido para Western blot
Se siguió el procedimiento descripto por Rodrigo, et al 2001.
Obtención del tejido
Se extrajeron las retinas, se pesaron y luego fueron colocadas en tubos
Eppendorf: Inmediatamente los tejidos fueron congelados sobre hielo seco y
conservados en un congelador de -70ºC hasta su homogenización.
Homogenización:
Los tubos conteniendo el tejido experimental fueron colocados sobre hielo y de
acuerdo al peso del mismo se agregó buffer de homogenización (HOBF) en una
proporción de 1:3 (3 ml de buffer por gramo de tejido). Los tejidos fueron sonicados
durante 15 segundos y los homogenatos obtenidos fueron centrifugados a 15.000 r.p.m.
durante 30 minutos. El sobrenadante se recolectó en tubos Eppendorf, trabajándose
siempre en frío.
Determinación de proteínas
La concentración de proteínas fue determinada por el método de Bradford
(Bradford, 1976) utilizándose albúmina (BSA) como estándar. Este proceso se basa en la
propiedad del reactivo de Bradford de producir en presencia de aminoácidos una
solución coloreada que tiene una absorbancia máxima a los 595 nm. La BSA se utilizó
para generar una curva patrón con cantidades conocidas de proteína. La absorbancia
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fue determinada luego de 5 minutos de realizada la reacción en un espectrofotómetro
7520 Microplate Reader (Cambridge Technology, Inc). Los valores fueron expresados
en mg/ml de muestra.
Preparación de geles
Para realizar la electroforesis se prepararon las soluciones madres para generar
el gel superior o concentrador, y el gel inferior o separador.
El gel separador fue realizado con dos soluciones distintas que difieren en la
concentración de archilamida; diferencia que es necesaria para resolver la separación
correcta de las proteínas iNOS y nNOS (7,5%) o de las proteínas nitrosiladas marcadas
con el anticuerpo que utilizamos para Ntyr (10%).
Electroforesis
La electroforesis fue llevada a cabo en condiciones desnaturalizantes en geles de
poliacrilamida. Se utilizó como buffer de corrida, Tris-glicina pH 8,3 (25 mM Tris, 192
mM glicina) conteniendo 0.1% de SDS. Se cargaron 15 µl por pocillo y se realizó la
electroforesis utilizando un aparato Mini-Protean II (Biorad). Para la determinación de
los pesos moleculares se utilizaron marcadores de peso molecular Kaleidoscopic
Prestained Standards (Biorad).
Dependiendo de la proteína a determinar se sembraron diferentes cantidades
de muestra en los pocillos. Para nNOS 10 µg de proteína total/ml para iNOS: 50 µg de
proteína total/ml, mientras que para NOtyr 30 µg de proteína total/ml. Una vez
realizada la siembra, cada gel fue sometido a una intensidad de corriente constante de
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20 mA, evitando que el voltaje supere los 200 V (se utilizó azul de bromofenol al 0,1%
cómo colorante para observar el frente de corrida).
Transferencia
Las proteínas separadas, fueron electrotransferidas, utilizando un aparato de
transferencia semiseca (Bio-Rad) en buffer de transferencia.
La transferencia se realizó a amperaje constante de 60 mA, con un voltaje máximo de
25 V durante 75 minutos.
Una vez realizada la transferencia las membranas correspondientes fueron colocadas
en buffer de bloqueo compuesto por leche descremada en polvo al 5% y Tween-20 (Bio
Rad) al 0,1% en PBS durante 3 horas.
Inmunotinción:
Las membranas fueron incubadas con los siguientes anticuerpos:
a) Ac anti nNOS, policlonal de conejo en una dilución de 1:10000
b) Ac anti iNOS, policlonal de conejo en una dilución de 1:2000
c) Ac anti NOtyr, policlonal de conejo en una dilución de 1:1000
Durante toda la noche en agitación en cámara fría a 4ºC.
Finalizada la incubación se realizaron tres lavados de las membranas con un
buffer compuesto por leche descremada en polvo al 1,5% y Tween-20 (Bio Rad) al
0,05% en PBS (BL) y se agregó el anticuerpo secundario correspondiente incubándose
durante 75 minutos, a temperatura ambiente con agitación. Se utilizó como anticuerpo
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secundario un anti-gamma globulina de conejo unido a HRP (horse radish peroxidase
– peroxidasa del rábano) en una dilución de 1:10000 (Amersham Pharmacia Biotech).
Revelado
La unión de los anticuerpos se reveló por medio del sistema ECL Plus
(enhanced-chemiluminiscense kit, Amersham Pharmacia Biotech), siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Control de carga de proteínas
Por último, se realizaron lavados de la membrana con PBS y se incubó con el Ac
anti-β-tubulina, monoclonal de ratón (Sigma), en una dilución de 1:60000 con agitación
en cámara fría durante toda la noche. Luego se reveló el Ac usando un anticuerpo
secundario anti-gamma globulina de ratón unido a HRP en una dilución de 1:10000
(Sigma).
Análisis de imágenes y estadística.
Las imágenes obtenidas para microscopía óptica (fotografiadas) así como las
bandas de proteínas obtenidas por Western Blot, fueron digitalizadas (utilizando un
escáner Flextight o una cámara de video Sony CCD XC-77). Tanto la densidad óptica
relativa (D.O.R.) como el área celular y el área reactiva, fueron determinadas mediante
un programa de análisis por imágenes computarizado (ScionImage). Los datos para los
western blot fueron corregidos de acuerdo al control de β-tubulina, normalizándose
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luego respecto al control y los resultados expresados como % respecto al control ±
S.E.M.
Las determinaciones realizadas, área celular, área reactiva, y densidad óptica
relativa (D.O.R.) fueron evaluadas por análisis de varianza de una vía (ANOVA)
seguidos de test de Fisher. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando el
valor de p fue menor de 0,05.
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Resultados
Anticuerpo contra la Oxido Nítrico Sintasa neuronal (nNOS)
En las secciones de retinas de animales del grupo AP, se observó un aumento en
la inmunorreactividad para nNOS a partir de los 21 días, con un máximo a los 60 días
de edad en: a) somas de las neuronas amácrinas, ubicadas en la parte más interna de la
capa nuclear interna, b) somas de las neuronas horizontales ubicadas en la parte más
externa de la capa nuclear interna y c) somas de las neuronas ganglionares de la capa
de células ganglionares. (Figs. 2 y 3)
Además, se observó un aumento en la inmunorreactividad en la capa
plexiforme interna, donde se encuentran las prolongaciones dendríticas de las
neuronas amácrinas.
Por morfometría se evidenció un aumento significativo en el número de células
por campo, en el área celular y reactiva y en la D.O.R. de neuronas amácrinas (Gráfico I
y III). En el caso de las células horizontales y ganglionares se determinó un aumento
significativo en el número de células por campo, mientras que en las últimas también
se produjo un aumento significativo en la D.O.R (Gráfico II y III).
En el grupo de animales HIP, no se observaron cambios significativos con
respecto al grupo CTL.
22
Anticuerpo contra la Oxido Nítrico Sintasa inducible (iNOS)
Comparado con las secciones de retina de animales del grupo CTL, en los
animales del grupo AP se observó también un aumento de la inmunorreactividad a
partir de los 21 días, en forma progresiva hasta los 60 días, en las siguientes capas y
tipos celulares: a) la capa limitante interna (zona donde se expanden los procesos
internos astrogliales hipertrofiados de las células de Müller, rodeando los somas de las
neuronas ganglionares); b) la capa nuclear interna (donde se encuentran los somas de
las neuronas amácrinas, horizontales, bipolares y gliales de Müller), y c) la capa
limitante externa (donde se encuentran los pies de las prolongaciones externas de las
células de Müller). (Figs. 4 y 5)
Por morfometría se evidenciaron aumentos significativos de la densidad óptica
relativa en la zona epirretinal y en la capa nuclear interna (Gráfico IV).
En las secciones de retinas de animales del grupo HIP no se observaron cambios
significativos ya sea en la inmunorreactividad ni en la D.O.R. con respecto a los
animales del grupo CTL.
Anticuerpo contra Nitrotirosina (Ntyr)
Utilizando el anticuerpo anti-Ntyr se comprobó en las secciones de retina de
animales del grupo AP, un aumento significativo de la inmunorreactividad en forma
progresiva desde los 21, con un máximo a los 60 días, en las siguientes capas: limitante
interna; de fibras del nervio óptico; de neuronas ganglionares; plexiforme interna
(donde se expanden los procesos dendríticos de las neuronas amácrinas); nuclear
23
interna (donde se encuentran los somas de las neuronas amácrinas, horizontales,
bipolares y gliales de Müller); nuclear externa y limitante externa (donde se anclan los
pies de las prolongaciones externas de las células de Müller) (Figs. 6 y 7 y Gráfico V).
En los animales del grupo HIP, no se evidenciaron cambios significativos en la
inmunorreactividad con respecto a las secciones de retinas de los animales CTL.
Inmunofluorescencia Simple:
Se observó un notorio aumento de la inmunofluorescencia en las retinas de
animales de 21 días sometidos a AP con los Anticuerpos primarios nNOS, iNOS y Ntyr
en comparación con el grupo CTL, lo cual fue coincidente con lo obtenido por
inmunohistoquímica (Figs. 8, 9 y 10).
Inmunofluorescencia Doble:
Dado el aumento en la inmunorreactividad a los distintos Ac primarios arriba
mencionado, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia doble preferencialmente
utilizando cortes de retina de animales sometidos a AP a los 60 días, en los que se pudo
apreciar colocalización de anticuerpos nNOS y T-OH; iNOS y GFAP así como Ntyr y
GFAP. Lo último fue de leve identifición en animales CTL. Además, en este último
grupo la fluorescencia ha sido de menor intensidad al compararse con el AP (Figs. 11,
12 y 13)
24
Inmunofluorescencia Múltiple:
Se realizó esta técnica en retinas de animales de 21, 30 y 60 días en los diferentes
grupos experimentales. Se observó en animales de 30 días sometidos a AP,
colocalización de Ntyr-GFAP, así como de iNOS-GFAP, en las prolongaciones internas
de las células de Müller y la membrana limitante interna. Por otro lado a los 60 días se
identificó colocalización de nNOS-TH en las células amácrinas y ganglionares de este
mismo grupo experimental (Figs. 14, 15, 16, 17 y 18).
Estudios Moleculares (Western blot):
Expresión de nNOS:
Se evaluaron homogenatos de retina de animales CTL, AP e HIP de 15, 21, 30 y
60 días. Sobre las bandas de inmunorreactividad para nNOS correspondientes a un
peso molecular de 155 kDa, se midió la densidad óptica relativa (densitometría),
obteniéndose en animales sometidos a AP un aumento significativo a partir de los 21
días llegando a un incremento de ±38% a los 60 días (Fig. 19). En los animales HIP se
evidenció una reducción no significativa de ±23% en la expresión de esta proteína con
respecto al CTL.
Expresión de iNOS:
25
Al igual que lo observado para nNOS los estudios de Western blot realizados
utilizando como inmunomarcador el Ac para iNOS con una banda inmunorreactiva de
un peso molecular de aproximadamente 135 kDa, se observó un aumento significativo
de ±97,5% en los animales sometidos a AP a los 60 días. Estos resultados fueron
concordantes con lo observado mediante la técnica de inmunohistoquímica. Asimismo
se observo una diferencia significativa entre los animales AP e HIP (Fig. 20).
Expresión de Ntyr:
Proteínas nitradas solubles presentes en extractos de retinas fueron puestas en
evidencia mediante varias bandas de proteínas reactivas al Ac anti-Ntyr Estas bandas
variaron entre de 22 y 84 kDa tanto en animales CTL como AP e HIP. Se determinó la
diferencia de expresión de las siguientes cinco bandas: Banda 84 kDa; banda 72 kDa;
59.5 kDa; 50 kDa; 47 kDa; y 22 kDa. Sólo en las bandas de 84 kDa, 72 kDa y 22 kDa se
observó un aumento significativo a los 60 días, mientras que las otras dos bandas
presentaron un aumento, aunque no significativo (Fig. 21). Asimismo en todas las
bandas analizadas se observó una disminución en la D.O.R. de la calle correspondiente
a los animales HIP de aproximadamente de 15% a 20% respecto a lo observado en los
animales CTL.
Actividad enzimática de la NOS constitutiva:
26
En homogenatos de retinas se observó nuevamente que la actividad enzimática para
nNOS se incrementa significativamente también a partir de los 21 días, comprobando
ser éste un día clave. Se observa también aún mayor aumento a los 30 y 60 días de
edad, lo cual comprueba a nivel bioquímico un aumento de la actividad de la enzima
sospechada por lo observado en experimentos morfológicos previos. De esta manera,
se puede apreciar claramente la actividad enzimática de la enzima nNOS entre los
diferentes grupos experimentales en una curva de tiempo (Gráfico VI).
27
Conclusiones
(1) El estudio del NO como posible agente neurotóxico en la RPI demostró (a) aumento
del nNOS a partir de los 21 días en neuronas amácrinas, ganglionares y horizontales en
animales sometidos a AP durante 20 min. y aumento de la nitración de proteína en las
capas internas de la retina, lo que indica una producción excesiva de peroxinitritos.
Este aumento fue intensificándose a los 30 y 60 días.
(2) Los estudios mediante la técnica de western blot confirmaron los hallazgos
observados en la inmunohistoquímica; observándose aumento en los mismos tiempos
estudiados.
(3) La actividad enzimática se intensificó a partir de los 21 días con un máximo a los 60
días.
(4) Se registró colocalización de nNOS-T-OH mediante inmunofluorescencia múltiple
en neuronas ganglionares y amácrinas; y colocalización NTyr-GFAP en limitante
interna (procesos internos de células de Müller).
(5) La hipotermia durante el proceso de asfixia, previene las variaciones en la
expresión, localización y actividad de nNOS observadas en la retina. Estos resultados
sostienen la hipótesis de que el NO actúa como factor desencadenante de una cascada
neurotóxica en la ROP, llevando a muerte neuronal.
28
Discusión
Numerosos estudios demuestran que la hipoxia-isquemia no afecta todas las
áreas del cerebro de la misma manera. Las neuronas más vulnerables se encuentran en
la zona CA1 del hipocampo, neuronas pequeñas a medianas de los ganglios basales,
células de Purkinje en el cerebelo y neuronas de las capas III, V y VI en la corteza
cerebral. La retina, que es parte del SNC, también demuestra ser sensible a la hipoxiaisquemia, como lo indican los datos que se presentan en esta tesis y trabajos publicados
por otros autores (ver Osborne, 2004).
A pesar de que estas áreas muestran mayor sensibilidad a la isquemia, todavía
no están claras las razones de dicha vulnerabilidad (Paschen, 1989; Cervós-Navarro,
1991, Paternak, 1991; Ginsberg, 1992). Entre los principales mecanismos neurotóxicos
que se postulan se encuentran la excesiva liberación de aminoácidos excitatorios,
generación de radicales libres, la liberación de óxido nítrico y otros neurotransmisores,
la acumulación de ácido láctico, un masivo ingreso de calcio, la degradación de
fosfolípidos de membranas y lipoperoxidación (Faraooqui, 1994), entre otros. Cuando
se produce una lesión por hipoxia en el SNC se desencadena una cascada de eventos
moleculares que conducen a la muerte celular por apoptosis o necrosis. En este
proceso, el glutamato en particular sería responsable de una sobreactivación de los
receptores NMDA y AMPA (Faraooqui, 1991) generando un incremento del influjo de
calcio y en consecuencia la liberación de NO por activación de la NOS. Por otro lado la
producción de ROS durante el proceso de reperfusión es capaz de activar, distintas
enzimas (lipasas, fosfolipasas, proteasas y proteínas kinasas) que afectan la integridad
de las membranas biológicas.
Ambos
tipos
de
daño
(excitotóxico
u
oxidativo)
pueden
ocurrir
independientemente, sin embargo considerando que los antioxidantes pueden atenuar
29
la neurotoxicidad glutamatérgica en cultivos celulares, es muy probable que ambos
presenten mecanismos de inducción molecular similares que llevan a la muerte
neuronal durante la isquemia (Dyckens, 1987; Chan, 1990; Monyer, 1990; PellegriniGiampietro, 1990).
Similares mecanismos han sido descriptos para la isquemia en la retina
(Szabo, 1992; Goldstein, 1996; Sennlaub, 2001; Osborne, 2004). En este caso se observó
un significativo aumento de la expresión de NO en retinas isquémicas. El NO generado
en exceso por las neuronas amácrinas, horizontales, ganglionares, células de Müller y
por el endotelio microvascular, podría ser responsable de un aumento de ROS “per se”
o reaccionar con otras ROS para formar el anión peroxinitrito que es altamente tóxico.
A su vez los altos niveles de NO, serían perjudiciales para las células, ya que este tiene
la capacidad de unirse a centros enzimáticos que contienen hierro-azufre, como por
ejemplo las proteínas involucradas en la cadena mitocondrial de transporte de
electrones, el ciclo del ácido tricarboxílico y la síntesis de ADN (Garthwaite, 1991).
Consistente con lo expuesto, se ha demostrado que la activación del factor de
transcripción inducible por la hipoxia (HIF) por sus heterodímeros, Hif-1α
(citoplasmático) y Hif-1β (nuclear) se unen activando numerosos genes entre los cuales
se encuentran los que codifican para la NOS (Osborne, 2004). Entonces, la excesiva
liberación de óxido nítrico está involucrada en la neurotoxicidad de la retina isquémica.
La retina además, sufriría el desencadenamiento de mecanismos apoptóticos
disparados como consecuencia de una iNOS exacerbada. Según los trabajos de
Sennlaub y col. (2001), la iNOS glial (de los astrocitos o células de Müller en la retina),
sería la responsable de la inducción de la apoptosis. (Fig. 22).
Muchas investigaciones se han realizado para intentar disminuir el avance de la
RPI (Osborne, 2004; Wilkinson-Berka, 2004; Porta y Allione, 2004) y de la ROP, por
ejemplo, utilizando antioxidantes como vitamina E (Raju, 1997), D-penicilamina
30
(Phelps, 1998), allopurinol (Russell, 1995), reducción de la exposición a la luz (Phelps,
1997) y suplementación de oxígeno (Stop ROP, estudio multicéntrico, 2000), con
resultados poco alentadores. Por otro lado, la administración de corticoides en forma
precoz a niños pretérmino, para prevenir enfermedad pulmonar crónica y la
suplementación con inositol para disminuir el Síndrome de Distress Respiratorio, han
demostrado como resultado secundario una disminución en la severidad de ROP
(Howlett, 2003). Sin embargo estos avances terapéuticos distan de ser un tratamiento
altamente efectivo. También se ha propuesto como terapia eficaz en la disminución del
grado de neovascularización retinal, en otros modelos experimentales, a la
indometacina (Nandgaonkar, 1999), dexametasona (Rotschild, 1999), rofecoxib
(Wilkinson-Berka, 2003) y bucillamina (antiinflamatorio similar a la D-penicilamina).
Utilizando nuestro modelo experimental, hemos observado que la disminución
de la temperatura, resulta en un significativo aumento en la sobrevida de los animales
sometidos a AP, produciendo además un efecto protector de las alteraciones que
presentan los animales AP a largo plazo. Este efecto protector estaría relacionado con
una reducción en las demandas energéticas y evitando la instalación de una acidosis
extracelular (Young, 1983; Nedegaard, 1991). La inducción de AP en condiciones de
hipotermia previene la formación de astrocitosis reactiva, evitándose de esta manera la
sobreproducción de iNOS y por lo tanto la apoptosis retiniana.
Por lo tanto: La
hipotermia promete ser un arma terapéutica eficaz en la prevención de la RPI.
31
Conclusión Final
El modelo de AP en rata es de utilidad para el estudio del desarrollo de RPI y
de la fase II de la ROP. En este punto los resultados obtenidos afirman que el NO,
cumple un rol importante en el desencadenamiento de eventos neurotóxicos en la
retina hipóxico-isquémica. Además, este modelo experimental permite el estudio de
estrategias terapéuticas como la hipotermia, la cual, validada como terapia, podría
proporcionar una herramienta eficaz y de fácil aplicación en la clínica, con la
consiguiente prevención de daño neuronal provocado por la hipoxia-isquemia global.
32
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Rotschild T, Nandgaonkar BN, Yu K, Higgins RD. (1999) Dexamethasone reduces
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42
Figuras
Figura 1: Esquema del modelo Experimental
43
Figura 2: Inmunorreactividad con un anticuerpo anti nNOS en la retina de 21 días
Se puede observar en AP un aumento de la marcación de neuronas amácrinas (flecha
blanca) y ganglionares (flecha negra) con respecto a los grupos CTL e HIP. Obsérvese
en detalle una neurona amácrina en a.
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Figura 3: Inmunorreactividad en la retina de 60 dias con un anticuerpo anti nNOS. En
los animales AP se observó un aumento de la inmunomarcación de las neuronas
amácrinas y de la capa plexiforme interna con respecto a los grupos CTL e HIP. En a se
observan los somas de neuronas ganglionares que expresan nNOS. En b y c, se
diferencian neuronas amácrinas de la cara interna de la capa nuclear interna (flecha) y
neuronas horizontales de cara externa de la capa nuclear interna. Además, se evidenció
un aumento en la inmunorreactividad en la capa plexiforme interna, donde se
encuentran las prolongaciones dendríticas de las neuronas amacrinas. En el grupo HIP,
no se observaron cambios significativos con respecto al grupo CTL.
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Figura 4: Inmunorreactividad con un anticuerpo anti inos en la retina de 21 días. En el
grupo AP observa un importante aumento en la inmunomarcación de la región
epirretinal (neuronas ganglionares, fibras del nervio óptico y limitante interna)
comparado con CTL e HIP
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Figura 5: Inmunorreactividad en la retina de 60 dias con un anticuerpo anti iNOS. En el
grupo AP se observó un aumento de la inmunomarcación en la capa limitante interna, en
la capa nuclear interna, y en la capa limitante externa. En los animales del grupo HIP no se
evidenciaron cambios significativos en la inmunorreactividad con respecto al grupo CTL.
Nótese en la fotografía inferior, los procesos internos de las células de Müller (flecha
blanca) anclándose en la lámina limitante interna rodeando las neuronas ganglionares y la
intensa marcación en la capa nuclear interna. Barra = 30 µ.
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Figura 6: Inmunorreactividad con un anticuerpo anti N-Tyr en la retina de 21 dias. En
el grupo AP se observa un marcado aumento en la Inmunotinción de la epirretina y
nuclear interna con respecto a CTL e HIP
Figura 7: Inmunorreactividad de la retina de 60 días con un anticuerpo anti N-Tyr. En
las fotografías superiores no se observaron cambios significativos en la marcación entre
retinas de animales CTL e HIP. En las fotografías correspondientes a retinas de
animales AP puede observarse un aumento en la inmunomarcación de la región
epirretinal (flecha negra) y la capa nuclear interna (flecha blanca),
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Figura 8: Inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo contra nNOS en retinas de
21 días. En AP se observa un aumento de la inmunofluorescenica en neuronas
amacrinas (flecha blanca), capa plexiforme interna y neurona ganglionares (a, flecha
roja) con respecto a CTL e HIP
49
Figura 9: Inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo contra iNOS en retinas de
21 días. En Ap se observa un aumento de la Inmunofluorescencia en la zona epirretinal
(flecha roja, procesos internos de Muller y su prolongación en la limitante interna) con
respecto a CTL e HIP.
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Figura 10: Inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo contra N-Tyr en retinas de
21 días. En AP se observa un aumento de la Inmunofluorescencia de la zona epirretinal
con respecto a CTL e HIP (flecha roja)
Figura 11: Imagen de doble marcación con microscopia confocal. En el panel superior
se observa la marcación en verde de la inmunorreactividad para nNOS en dos células
amácrinas pudiéndose observar claramente en la célula de la izquierda (aumentada en
el panel inferior) los botones sinápticos inmunorreactivos para TOH en rojo (flecha
blanca).
51
Figura 12: Microscopía confocal de iNOS y GFAP. Sección de retina en la que se
observa inmunofluorescencia en la región epirretinal, destacándose la marcación en
verde de iNOS en los procesos internos de las células de Müller y en la capa limitante
interna. En rojo se observa la inmunofluorescencia de la epirretina específica para
GFAP. Las flechas indican las zonas de colocalización (en amarillo) de ambas
proteínas. El panel inferior a mayor magnificación se observa la colocalización en los
procesos Internos de las células de Müller así como en la capa limitante interna.
Barra = 30 µ.
52
Figura 13: Colocalización de la imunorreactividad a NOtyr y GFAP. En las dos
fotografias puede observarse la inmunoflorescencia para NOtyr (verde) y GFAP (rojo)
en la región epirretinal. En ambas imágenes se destaca la colocalización en amarillo de
ambos anticuerpos (flecha blanca)
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Figura 14: Inmunofluorescencia múltiple anti nNOS (rojo), anti TH (verde) y un
marcador nuclear (DAPI) en retinas de 21 días. En AP se observa intensa
inmunofluorescencia en citoplasma de neuronas amácrinas (flecha blanca) y
ganglionares (flecha roja) así como en la capa plexiforme interna. Tanto CTL como HIP
presentan una menor marcación. En a se observa el detalle del árbol dendrítico de una
neurona amácrina. En b se observa un vaso de neoformación epirretinal. En c se
observa en detalle una neurona ganglionar con su citoplasma nNOS +.
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Figura 15: Inmunofluorescencia múltiple anti nNOS (rojo), anti TH (verde) y un
marcador nuclear (DAPI) en retinas de 30 días. En AP se observa intensa
inmunofluorescencia en citoplasma de neuronas amácrinas (flecha blanca) y
ganglionares (flecha roja) así como en la capa plexiforme interna (considerablemente
mayor que a los 21 días, ver Figura 14 para comparar). Tanto CTL como HIP presentan
una menor marcación. En a se observa una neurona horizontal con sus prolongaciones
orientadas hacia la capa plexiforme externa. En b se observa intensa
inmunofluorescencia en la capa plexiforme interna y el citoplasma de neuronas
ganglionares nNOS +.
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Figura 16: Inmunofluorescencia múltiple anti nNOS (rojo), anti TH (verde) y un
marcador nuclear (DAPI) en retinas de 60 días. En AP se observa intensa
inmunofluorescencia en citoplasma de neuronas amácrinas (flecha blanca) y
ganglionares (flecha roja) así como en la capa plexiforme interna. Tanto CTL como HIP
presentan una menor marcación. En a se observa en detalle el citoplasma de una
neurona amácrina donde colocalizan nNOS y TH. En b se observan las prolongaciones
de una neurona amácrina. En c se puede observar la colocalización de nNOS y TH en el
citoplasma de una neurona ganglionar.
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Figura 17: Inmunofluorescencia múltiple anti iNOS (rojo), anti GFAP (verde) y un
marcador nuclear (DAPI) en retinas AP de 30 días. Se observa colocalización (amarillo)
en la capa limitante interna.
Figura 18: Inmunofluorescencia múltiple anti N-Tyr (rojo), anti GFAP (verde) y un
marcador nuclear (DAPI) en retinas AP de 30 días. En el panel superior se observa en
amarillo la colocalización de N-Tyr y GFAP (flechas blancas). En el panel inferior se
observa un vaso de neoformación epirretinal.
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Figura 19: Western Blot para nNOS en retina. Se observan las bandas correspondientes
a 155 kDa (nNOS) para los tres grupos experimentales. Los gráficos de barras
representan la Densidad Óptica Relativa de las bandas inmunomarcadas para cada
grupo experimental con respecto a CTL expresado en porcentaje. Se encontró un
aumento significativo en el grupo AP a partir de los 21 días hasta los 60 días. El grupo
HIP no presentó cambios significativos con CTL. Los valores expresados como
porcentaje de intensidad de la banda respecto al control, representan la media ± el
error estándar de 3 homogenatos de retina diferentes para cada grupo. * p < 0,05
(ANOVA, seguido de test de Fisher).
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Figura 20: Western blot para iNOS en retina. Diagrama de barras indicando la
intensidad de las bandas correspondientes a iNOS de 135 kDa para los tres grupos
experimentales. Los valores expresados como porcentaje de intensidad de la banda
respecto al control, representan la media ± el error estándar de 3 homogenatos de
retina diferentes para cada grupo. * p < 0,05 (ANOVA, seguido de test de Fisher).
Figura 21: Western blot para N-Tyr en retina. Western blot correspondiente a proteínas
nitradas en la retina de los tres grupos experimentales. Diagrama de barras
representando el porcentaje de intensidad de banda respecto al valor control de la
banda de 84 kDa de animales CTL (barras vacías), AP (barras negras) e HIP (barras
grises). Se cuantificaron las cinco bandas de diferente peso molecular indicadas. Los
valores representan la media ± el error estándar de 3 homogenatos de retina diferentes
para cada grupo. * p < 0,05 (ANOVA, seguido de test de Fisher). Los valores de
densidad óptica fueron ajustados según el control de carga de proteínas determinado
mediante tubulina (ver Métodos).
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Figura 22: Rol Fiosiopatologico del NO en la hipoxia-isquemia. Modificado de
Osborne, 2004
60
Gráficos
Gráfico I: Inmunorreactividad de neuronas amácrinas al nNOS. El gráfico de la
izquierda muestra el área celular, el de la derecha la densidad óptica relativa.
* p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher
Gráfico II: Inmunorreactividad de neuronas ganglionares al nNOS. El gráfico de la
izquierda muestra el área celular, el de la derecha la densidad óptica relativa.
* p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher
Gráfico III: Número de células reactivas al nNOS por campo. En ambos casos se
observa un aumento de la cantidad de células marcadas.
* p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher
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Gráfico IV: Inmunorreactividad de la epirretina al iNOS. Tanto a los 21 días como a los
60 días se observa un aumento significativo de la inmunorreactividad de la epirretina
al iNOS. * p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher
Gráfico V: Inmunorreactividad de la epirretina al N-Tyr. Se observa un aumento
significativo de la inmunomarcación tanto a los 21 días como a los 60 días.
* p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher
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Gráfico VI: Actividad enzimática de la NOS constitutiva. Se observa en AP un aumento significativo de la actividad a partir de los 21 días,
progresando en el tiempo hasta los 60 días. * p < 0,05 ANOVA seguido de test de Fisher.