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Bacterias lácticas no fermento y
calidad de quesos
Jornadas
5 y 6 de junio de 2014
Dra. Erica Hynes
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Las bacterias lácticas no fermento se desarrollan en todos
los quesos madurados
Predominan en los productos de maduración media y
prolongada
• Humedad 30 - 60 %
• pH 5,0-5,4
• % de NaCl en la humedad entre 2-6
• Bajo potencial redox (Eh –150 mV)
• Ausencia o cantidades muy bajas de
azúcares fermentables
• Bajas temperaturas de maduración
(7- 12 ºC)
UFC g-1
Pueden crecer en las condiciones ambientales del queso:
10
10
10
9
10
8
10
7
10
6
10
5
10
4
10
3
10
2
10
1
no fermento
fermento
0
50
100
150
200
Días de maduración
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II
Lactobacillus casei /paracasei – Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus - Lactobacillus rahmnosus, etc.
También se pueden considerar NSLAB:
• Lactobacilos heterofermentativos del grupo III
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis
• Bacterias lácticas termófilas no agregadas con el fermento
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus)
• Leuconostoc spp., pediococos y enterococos
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
Leche cruda
Fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
La elaboración de queso en condiciones asépticas o extra higiénicas
reduce sólo levemente la contaminación con NSLAB (McSweeney, 1994)
Se han encontrado cepas NSLAB que se recuperan luego de 72°C 90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)
4
3,5
3
Log UFC / ml
Recuperación de células de
L. plantarum DPC2739
(ca. 7,0 log UFC/ml)
calentadas 72 °C 90 seg,
en leche estéril a 7 °C por 20 días
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
Tiem po (días)
15
20
25
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
La leche cruda
Es la fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurización
– 73°C 15 seg - y termización – 60 °C 5 min) (Christiansen et al., 2006)
La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos
plantas distintas comparte gran parte de las cepas
(Poznanski et al., 2004)
Las leches con muy baja contaminación inicial desarrollan NSLAB
mucho más lentamente o alcanzan menores números, al igual que
leche de quesería microfiltrada (Crow et al., 2001)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso
La contaminación post pasteurización
También contribuye al desarrollo de las NSLAB en el queso
A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de
leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta
de cheddaring y la torre formadora de bloques (2-4 log UFC/ml)
(Sommers et al., 2001; Agarwarl et al., 2006)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnología
y el medioambiente que ésta define
Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo
Tratamiento térmico de la leche
Fermento primario
Temperatura de maduración
Proteólisis primaria por coagulante y plasmina
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnología
tratamiento térmico
termización, pasteurización y cocción
11
10CFU
g-1
10
log
La pasteurización introduce una
acción de selección sobre la
biota inicial de la leche de
quesería.
En los quesos de leche cruda el
número inicial de NSLAB es más
alto (Bude Ugarte et al., 2006)
9
8
7
6
7
22
37
52
67
Ripening time (days)
Fermento y NSLAB para quesos Pategrás
(♦) y semiduro de leche cruda (■)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnología
tratamiento térmico
termización, pasteurización y cocción
Tanto los quesos de leche cruda como los de leche pasteurizada se han
encontrado comunidades bacterianas diversas (Babini et al., 2010).
En los quesos duros donde existe cocción, esta etapa también puede
tener un impacto en la composición de la flora no fermento, aunque la
temperatura no influye en el recuento promedio (Sheehan et al., 2007)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnología
fermento primario
Si existe galactosa disponible, el crecimiento de las NSLAB correlaciona
con la disminución de galactosa en el queso
30
8
25
7
6
20
5
15
4
3
10
2
5
1
0
Galactosa (mmoles/Kg)
recuento de lactobacilos (Log
cfu/g)
9
Lactobacillus
rahmnosus Exp
NSLAB control
Galactosa E
Galactosa C
0
0
1
2
3
4
5
6
tiempo de maduración (meses)
Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus
además de L. lactis
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La tecnología
temperatura de maduración
Tiene un fuerte impacto en la velocidad de crecimiento
Cheddar
8 ºC
8 * 104 UFC g-1
12 ºC
1 * 107 UFC g-1
9
1 * 108 UFC g-1
Leche cruda
1ºC
8
7
log UFC g-1
6 meses
1 ºC
Leche
pasteurizada
1ºC
Leche cruda
8ºC
6
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
120
150
180
Leche
pasteurizada
8ºC
Tiempo (días)
Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La distribución temporal y espacial
Fitzimons, 2001
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos
En quesería industrial generalmente se las asocia a los defectos
Formación de gas
Cristales de de lactato de calcio
Off flavours
Inconstancia de la calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no
deben presentar ojos o aberturas
Quiberoni et al., 2004
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
Causas
• Contaminación elevada en la leche cruda
Leuconostoc sp
Lactobacilos heterofermentantes obligatorios
Lb. brevis y Lb. fermentum
• Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador –
períodos de trabajo muy largos, contaminación del equipo con S.
thermophilus
• Fermento poco activo, consumo lento de la lactosa
No se han informado fallos asociados a lactobacilos
heterofermentantes facultativos, como Lb. paracasei y Lb.
plantarum.
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformes
o levaduras – que se produce muy tempranamente en la
maduración – y del defecto de hinchazón tardía en quesos
duros.
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
• No afecta negativamente el aroma o
sabor de los productos – nota
intensa a manteca
• No trae problemas de inocuidad
• Deprecia el producto por su aspecto
y características físicas: aceptación
por parte del consumidor y
operaciones como corte y
empacado.
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
Los sustratos para la producción de gas por NSLAB
•
•
•
•
•
Lactosa residual
Galactosa residual
Citrato
Aminoácidos
Lactato (?)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
la fermentación
proceso biológico
puede ser afectado de distinta forma por la actividad de
los microorganismos presentes y la tecnología de
elaboración,
distintas velocidades de desaparición de lactosa y sus
componentes, glucosa y galactosa
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Sample descriptions
Lactose determination by
enzyme kit
(mg 100 g-1)
<10
140
30
20
30
D-galactose
determination by
enzyme kit
<10
<10
<10
<10
<10
<10
30
<10
<10
Asda Gouda Wedge
Sainsbury’s Extra Mature West Country
Farmhouse Cheddar
100
60
20
<10
Tesco Fresh Italian Parmesan
Sainsbury‘s Mature Gouda
30
40
<10
<10
Jarlsberg (Norwegian)
Tesco Continental Gouda
Sainsbury’s Dutch Gouda
Asda Edam Wedge
Sainsbury’s Mature West Country
Farmhouse Cheddar
Tesco Continental Jarlsberg
Asda West Country Farmhouse Cheddar
Portnoi & McDonald, 2009
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Cheddar
Portnoi & McDonald, 2009
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o
aberturas
capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y
formar CO2
especie y cepa dependiente
vinculada a la presencia de azúcares en el medio y al
estado fisiológico de las células
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La producción no deseada de CO2 debería
controlarse a través de:
la microbiota
la composición
la temperatura de enfriado del queso y de
maduración
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Metabolismo del lactato
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Cristales de lactato de calcio
• Pequeños cristales visibles en superficies de corte
• son inocuos pero pueden ser confundidos con hongos por el
consumidor lo que provoca rechazo
• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos
duros
• las bacterias lácticas del fermento producen L-lactato pero
muchas NSLAB producen directamente D-lactato, menos
soluble, o lo forman a partir del L- lactato
• este defecto se ve favorecido por enfriado lento de bloques
grandes de queso, bajo pH y alta temperatura de
maduración, así como el ahumado natural.
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Cristales de lactato de calcio
Pyruvate
Reduction to D-lactate by
D-LDH (NSLAB)
Oxidation of L-lactate
to pyruvate by L-lactate dehydrogenase
H
HO
H3C
H
C
C
COOH
L(+)-Lactic acid
HOOC
OH
CH3
D(-)-Lactic acid
McSweeney, 2003
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
En quesería artesanal o productos de alto valor agregado (con
denominación de origen o productos probióticos, por ejemplo)
el rol de las NSLAB se revaloriza
Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
Aceleración de la maduración
Degradación de péptidos amargos
Diversificación de notas de aroma
Potencial probiótico
AROMA Y SABOR DEL QUESO
McSweeney & Sousa, 2000
AROMA Y SABOR DEL QUESO
Sólo starter
Starter +
NSLAB2
Starter +
NSLAB1
Starter +
NSLAB3
James Steele, 2012
desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
Amino acids
GDH
(Glutamate deshidrogenase)
α-ketoglutarate
AT
Glutamate
Glutamate
(Aminotransferase)
α-keto acid
Benzaldehyde (Phe)
Methylthioacetaldehyde (Met)
Hydroxyacid
Acyl-CoA
P-Cresol (Tyr)
Skatole (Trp)
α -keto acid
dehydrogenase
α -ketoacid
decarboxylase
Aldehyde
alcohol
dehydrogenase
Carboxylic
Acid
Alcohol
Methanethiol (Met)
Dimethyldisulphide
Dimethyltrisulphide
Tanous et al. (2002)
Antonie van Leeuwenhoek
82: 271–278, 2002.
desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
Aspartate
GDH
Glutamate
α-ketoglutarate
Asp-AT
Glutamate
Oxaloacetate
CO2
Acetaldehyde TPP
CO2
Oxaloacetate
descarboxilase
Piruvate
Diacetyl
Acetolactate
synthase
CO2
2-acetolactate
Acetolactate
descarboxylase
O2
CO2
NADH
Diacetyl reductase
NAD
Acetoin
Butanediol
NADH
NAD
Le Bars and Yvon (2008)
J Appl Microbiol 104 ,171–177
AROMA Y SABOR
DE QUESOS
Compuestos aislados
como componentes
de “flavour” en varios
tipos de quesos
(Marilley & Casey, 2003)
Alcoholes
1,2-butanodiol
2-butanol
etanol
2-etilbutanol
2-etilhexanol
2-heptanol
isohexanal
2-metilbutanal
3-metilbutanal
2-metilpropanal
Nonanal
(E,E)-2,4 nonadienal
(Z)-2-nonenal
Ésteres
acetato de etilo
benzoato de etilo
butirato de etilo
hexanoato de etilo
isobutanoato de etilo
octanoato de etilo
hexanol
isobutanol
(E)-2-nonenal
octanal
2-metilbutanoato de etilo
butanoato de isobutilo
2-metilbutanol
3-metilbutanol
2-metilpropanol
2-nonanol
(Z)-1,5octadien-3-ol
2-octanol
1-octen-3-ol
2-pentanol
pentanal
propanal
propenal
thripfen-2-aldehído
Cetonas
acetato de 3-metilbutilo
metil-2-metilbutanoato
3-octil acetato
acetato de pentilo
acetato de fenetilo
metileno bis(metilsulfuro)
Compuestos nitrogenados
2-acetil-1-pirrolina
Pirazinas
2,3-dietil-5-metilpirazina
2-etil,3-5-dimetil-pirazina
2-metoxi-3isopropilpirazina
Furanos
2-etil-4-hidroxi-5-metil3(2H)furanona
3-hidroxi-4,5-dimetil2(5H)furanona
4-hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)furanona
Compuestos fenólicos
p-cresol
Ácidos grasos
acetato
butirato
Acetoína
Acetona
2,3butanodiona
(diacetilo)
2-butanona
h-damaescenona
2-heptanona
2-hexanona
3-metil-2-butanona
2-nonanona
3-octanona
1-octen-3-ona
2-pentanona
2-tridecanona
2-undecanona
butirato de propilo
Lactonas
δ-lactona
caproato
decanoato
isobutirato
γ-lactona
δ-dodecalanctona
δ-octalactona
(Z)-6-dodecen-γ-lactona
Compuestos azufrados
dimetil disulfuro
dimetil sulfuro
trimetil disulfuro
metanotiol
metional
hexanotiol
metilacetato
ác. 2-metilbutírico
ác. 3-metilbutírico
octanoato
fenilacetato
propionato
valerato
feniletanol
2- feniletanol
1-prropanol
2-propanol
Aldehídos
acetaldehído
decanal
heptanal
(Z)-4-heptenal
hexanal
2-hexenal
Se conocen los compuestos que se necesitan para formar el
flavour del queso, pero no cómo combinarlos de manera
adecuada para conseguir la percepción global deseada en una
determinada matriz
La sinfonía del flavour:
“…… stimuli such as flavour compounds, notes of music, or
colours in a picture do not generate the same response when
they act singly, as when they act together in a rapid sequence
(e.g., an arpeggio) or even simultaneously (e.g., in a chord,
which can be harmonious or not).” “In each case, the whole ‘matrix’ or
environment must be considered”
Bosset, J. O. & Gauch, R. (1993) International Dairy Journal, 3, 359 –
377
“ We have our flavour orchestra:
• Chamber – cheese structure
• Flavour instruments – processes to
create flavour notes
• Flavour notes – cheese flavour compounds
The challenge is to conduct the orchestra to
deliver the symphony of cheese flavour”
Holland & Coolbear, 2012
La calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
• Si se agrega α-cetoglutarato al queso, el aroma general
aumenta significativamente.
• Si se utilizan cepas de lactococos donde se inhibió la síntesis
de aminotransferasas, el aroma y sabor del queso disminuye.
Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se
aumenta, el sabor y aroma del queso se incrementan
Controlar el catabolismo de los aminoácidos por los
microorganismos del queso promete ser una manera
eficaz de controlar la formación de aroma y sabor en
el queso
Yvon & Rijnen, 2001
La calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour
En quesos madurados únicamente con bacterias lácticas, la
mitad de los componentes clave en el flavour provienen del
catabolismo de los aminoácidos.
Patentes:
• FR 97 05133, PCT/FR98/00828 – 2000 - M. Yvon y J-C Gripon.
Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base
de queso
• WO2003056025 - 2003 - M. Yvon, E. Chambellon, A. Gori. Selección y
utilización de cepas de bacterias lácticas capaces de producir acetoglutarato a partir de citrato y de glutamato a lo largo de la maduración
de quesos para la transformación de aminoácidos en moléculas de
aroma.
• EP1789542 - 2006 - M. Yvon, C. Tanous, E. Chambellon, M. Nardi .
Gene que codifica una glutamato dehidrogenasa, plásmido conteniendo
dicho gene y sus utilizaciones.
La calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Diversificación de notas de aroma
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Á r e a ( u n id a d e s a r b it ra ria s )
Diversificación de notas de aroma
2000
Diacetilo
1500
Acetoína
1000
Peralta et al., 2010
500
0
C1-60 días
E1-60 días
C2-60 días
E2-60 días
Tipo de queso
Wolf et al., 2009
La calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Diversificación de notas de aroma
Adjunto de Lb. paracasei I90
En queso cremoso mini
Peralta et al., 2012
La calidad
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Diversificación de notas de aroma
Adjunto de Lb. paracasei I90
En modelo de queso Reggianito
Peralta et al., 2012
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La calidad
Potencial probiótico
Algunas cepas de origen NSLAB han demostrado potencial
probiótico in vitro y se han probado exitosamente en matrices
alimentarias
500
Nº IgA+ cells/10 fields
450
400
350
300
250
200
Control
Control cheese
Cheese + Lp I90
Cheese + Lp I91
Burns et al., 2012
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
La estrategia de los fermentos adjuntos
Busca reunir las ventajas de la presencia de las NSLAB
en quesos, incrementando el control sobre la maduración
Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena
calidad, identificadas y caracterizadas.
Se agregan a la leche de elaboración además del fermento
primario (starter)
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Fermentos adjuntos
Requisitos de un adjunto
Obligatorios
No contribuir a la acidificación
Proliferar rápidamente en la cuajada y mantener la
viabilidad durante la maduración del queso
No producir ningún defecto
Facultativos
Aumentar la proteólisis secundaria
Disminuir el gusto amargo
Incrementar la bioformación de flavour
Tener potencial como probiótico
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Fermentos adjuntos
“Gracias a un mejor conocimiento, a través de la investigación en
todo el mundo, la industria quesera tiene hoy acceso a una serie de
herramientas para obtener quesos de calidad y mejores ingredientes
de flavour para quesos. Una aplicación exitosa es la mejora en la
constancia del flavour mediante el agregado de fermentos adjuntos
de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour
comprobadas, a quesos con una mínima cantidad de NSLAB
adventicias; esto quiere decir: quesos limpios”
Johnston et al., 2010, Fonterra
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Materia prima adecuada + fermentos primarios y
adjuntos adecuados + manejo de la temperatura
+ bajo contenido inicial de
lactosa/galactosa/citrato
Mayor control de la maduración
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Troubleshooting
Problema
Producción de CO2 con ojos y
aberturas no deseadas
provocado por bacterias lácticas
no fermento
Causa
Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Funcionamiento prolongado del
pasteurizador
Fermento primario lento
Agregado de polvos o retentados para
aumentar rendimiento
Enfriado lento de las hormas, cortes en
cadena de frío, altas temperaturas de
maduración
Solución
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (Buenas prácticas
de ordeño, Microfiltración)
Ciclos adecuados de trabajo y
limpieza
Fermento primario adecuado
Fermento adjunto
Lavado de la cuajada
Adecuada capacidad de
salado/enfriado
Mantenimiento de la temperatura
consigna
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (BPO, MF)
Mantenimiento de pH y temperatura
de maduración adecuados
Producción de cristales de
lactato de calcio
Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Valores de pH bajos
Altas temperaturas de maduración
Producción de off flavors
Altos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Predominio de cepas que producen
notas de flavour no buscadas
Mejora de la calidad microbiológica
de la leche cruda (BPO, MF)
Fermento adjunto
Sabor poco intenso (mild/flat)
Bajos recuentos de bacterias lácticas
en leche cruda
Predominio de cepas que no producen
flavour
Fermento adjunto
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Control de las NSLAB: las tres K
Las tres K
Keep them out
Mantenerlas fuera
Causa
Minimizar la contaminación:
Calidad de la materia prima
Sanitización de la planta
Kill them
Matarlas
Pasteurizar
Keep them from growing
Mantenerlas en bajo número
Temperatura
Condiciones ambientales
Nutrientes
Bacteriocinas
James Steele, 2012
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Muchas gracias!