Download Microbiolo f.indb - Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático

Microbiología ambiental
Primera edición: noviembre de 2004
D.R.
Instituto Nacional de Ecología (INE-SEMARNAT)
Periférico sur 5000. Col. Insurgentes Cuicuilco, C.P. 04530. México, D.F.
Internet: www.ine.gob.mx
COORDINACIÓN EDITORIAL Y TIPOGRAFÍA: Raúl Marcó del Pont Lalli
DISEÑO DE LA PORTADA: Álvaro Figueroa
FOTO DE LA PORTADA: Alejandro Martínez
CORRECCIÓN DE ESTILO: Eduardo Chagoya Medina
Foto de la portada: gota de agua con ciliados en bipartición,
eugenelas y numerosas bacterias (bacilos). Tomadas en contraste de
fases con filtro azul y ayuda de microflash a 1/2,000 seg. Aumentos 336 x.
ISBN: 968-817-707-5
Impreso y hecho en México
Microbiología
ambiental
Irma Rosas,
Alejandro Cravioto
y Exequiel Ezcurra
(compiladores)
Secretaría de Medio Ambiente y Recursos naturales
Instituto Nacional de Ecología
Programa Universitario del Medio Ambiente-UNAM
ÍNDICE
Agradecimientos
8
Prólogo
9
José Sarukhán
Introducción
13
Bacterias en la atmósfera
15
Vibrio cholerae: una bacteria ambiental
con diferentes tipos de vida
47
Irma Rosas, Alejandro Cravioto y Exequiel Ezcurra
Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez,
Carlos Eslava y Alejandro Cravioto
Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado,
Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto
la ecología de las amibas patógenas de vida libre
en ambientes acuáticos
67
Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortíz y
Carlos Eslava
Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton 83
y su relación con la salud humana
Pedro Ramírez, Evaristo Martínez, María Dolores Martínez
y Carlos Eslava
La ecología microbiana: una nueva ciencia
para un nuevo siglo
Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez, Laura Espinosa-Asuar,
René Cerritos y Luis Eguiarte
107
AGRADECIMIENTOS
Los compiladores de esta obra desean agradecerle la revisión y la asesoría técnica
al Programa Universitario de Medio Ambiente (PUMA) de la Universidad Nacional
Autónoma de México (UNAM) y a la Srta. Ángeles Prado.
P RÓLOGO
millón setecientas cincuenta mil que han sido nombradas y depositadas en museos y herbarios de todo el mundo por taxónomos especialistas en muy diferentes
grupos. Nuestras miles de culturas y lenguas diferentes también son producto de la
diversidad, lo mismo que nuestro desarrollo cultural, lo que actualmente llamamos
“nuestra civilización”, con todos sus claroscuros.
A pesar de lo anterior, somos enormemente ignorantes de esa diversidad de la
que provenimos. No solo eso, sino que en ocasiones parece que estamos empeñados en despreciarla y aun borrarla. Algunos ejemplos para ilustrar lo anterior: seis
millones de hectáreas de zonas áridas se desertifican cada año. Las selvas tropicales
se pierden a una velocidad de 30 hectáreas por minuto. Existen ya cerca de 50
zonas muertas en los océanos por causa de la eutrofización originada por el uso
ineficiente de fertilizantes. Se introduce más nitrógeno en los sistemas terrestres
por intervención humana que el que se fija naturalmente, y casi la mitad del mismo
se pierde por lixiviación. Más de dos terceras partes de las pesquerías comerciales
están agotadas y 90% de los grandes depredadores marinos han desaparecido.
No lo hemos hecho mucho mejor en lo que se refiere al conocimiento y la conservación de las diferencias culturales que se ha desarrollado en cada una de las
regiones de la Tierra. Año con año se pierden, por un complejo de circunstancias
derivadas de la forma en que nos hemos desarrollado, cientos de lenguas que ya no
serán habladas nunca más. No será difícil que nuestra era, como otras geológicas,
sea conocida por un epíteto que la distinga: el del Homogeoceno, es decir, la era de
la aniquilación de la diversidad y de la homogeneización biológica y cultural del
planeta producida por las actividades humanas.
Ese millón setecientas cincuenta mil especies conocidas hasta la fecha represen-
[9]
9 José Sarukhán
SOMOS PRODUCTO DE LA DIVERSIDAD. Todos nosotros. Nuestra especie y las más de un
Prefacio
10
tan, dependiendo del especialista, entre el 15 y el 5% de todas las especies que se
calcula existen en el mundo. En otras palabras, desconocemos, por lo menos por un
orden de magnitud, la dimensión de la diversidad biológica que existe en la Tierra
y de la que somos producto.
En contraste, hemos mostrado una destreza asombrosa en otras áreas del
conocimiento humano. Por un lado, podemos calcular con precisión apabullante
la trayectoria, composición y edad de objetos celestes que ni siquiera vemos a
simple vista; por otro, hemos penetrado hasta los más reducidos espacios de la
materia al estudiar su estructura, y hemos descifrado los códigos más íntimos de
la regulación de nuestros procesos hereditarios. Paradójicamente, quizá porque se
encuentra situado entre lo ultramicroscópico y las escalas inmensas del universo,
hemos abandonado el esfuerzo por incrementar nuestro conocimiento del mundo
biológico que nos rodea y sin el cual no podemos vivir. No solamente no sabemos
con razonable aproximación cuántas especies conviven con nosotros en la Tierra,
sino que ignoramos las funciones que desempeñan en la trama de la vida y ni
siquiera para la enorme mayoría de ellas, desde el enfoque más antropocéntrico
y utilitario, sabemos si pueden o no resultar útiles para satisfacer las múltiples
necesidades de las sociedades.
Por ello, resulta muy gratificante atestiguar el nacimiento de obras como la presente que enfocan su interés en el conocimiento de uno de los grupos biológicos
menos estudiados: el de las bacterias y algunos otros microorganismos unicelulares.
Otra vez, con un error de un orden de magnitud, se calcula que existen en nuestro
planeta entre cien mil y un millón de especies de este grupo. Obviamente la dificultad
de su observación y el enorme reto que representa la definición de lo que en este
caso es una entidad taxonómica (especie) han contribuido al lento avance de su
conocimiento. Esto es en especial grave debido al enorme papel que este grupo
juega en los procesos vitales de los sistemas ecológicos y biológicos en la Tierra y a
que representan los tabiques biológicos básicos de la construcción de los sistemas
vivos, incluyéndonos a los seres humanos. Su importancia e interés ciertamente va
mucho más allá del común de la gente les asigna en lo que se refiere a los problemas de salud humana, los cuales, desde luego, no son de manera alguna nimios.
Baste recordar enfermedades tan serias como la tuberculosis, el cólera (tratado en
un capítulo especialmente por el Dr. Carlos Eslava y colaboradores) la difteria, las
disenterías o el tifo.
No es aventurado afirmar que toda una nueva biología está a la espera de ser
descubierta en estos organismos, que funcionan por rutas metabólicas y mecanismos
ecológicos, fisiológicos, y probablemente evolutivos, que podrían ser harto diferentes
José Sarukhán
INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM
11 José Sarukhán
de los que conocemos para la mayor parte de los “organismos superiores”. Como grupo,
las bacterias representan los seres vivos más antiguos, habiéndoseles encontrado en
estratos geológicos de hace tres mil quinientos millones de años. El rango de hábitats
en los que pueden vivir es el más amplio de cualquier otro grupo de organismos
(como el artículo de la Dra. Valeria Souza y colaboradores lo ilustra ampliamente),
desde profundidades de más de 400 m en el hielo de la Antártida hasta temperaturas cercanas a los 80 °C en géiseres. Su papel en los procesos ecológicos es en
extremo importante (un ejemplo de ello lo constituye el interesante capítulo sobre
cianobacterias del Dr. Pedro Ramírez y colaboradores): como fijadores de CO2 y
mantenedores del balance de carbono en la biosfera; como descomponedores de
materia orgánica y el consecuente reciclado de nutrientes, especialmente importante en suelos agrícolas, los cuales pueden contener, en un solo gramo, cerca de
2,500 millones de bacterias; lo anterior como una adición a su fundamental papel
como fijadores de nitrógeno, no solamente en los suelos agrícolas sino en todos
los ecosistemas terrestres.
Hay que felicitar la idea y el esfuerzo de estructurar un libro cuyos capítulos
tocan una variedad de temas relacionados con las bacterias y algunos otros microorganismos, como es el caso del capítulo escrito por la Dra. Patricia Bonilla y
colaboradores sobre amibas de vida libre. La obra nace en un terreno que no es
particularmente fértil en ejemplos como el presente. Se trata de una iniciativa muy
útil para enriquecer la cultura biológica de nuestro país, dado que está escrito para
un público no necesariamente especialista en los temas, y es en especial útil para
aquellos lectores cuyo acceso a obras en lenguas extranjeras está limitado. Es de remarcarse que la mayoría de los autores son académicos de diversas dependencias de
la Universidad Nacional Autónoma de México, aspecto que subraya el papel central
de esta institución en la investigación científica y en la difusión del conocimiento
a la sociedad en general. Hay que desear que el cometido educativo e informativo
del libro se logre de la mejor forma; será el mejor obsequio a los esfuerzos de los
autores y editores de este trabajo.
12
Prefacio
Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad
microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia.
El gran espectro metabólico existente entre los distintos microorganismos,
los capacita para colonizar cualquier ambiente por inhóspito que parezca, de
tal forma que su presencia nos asegura que la energía entra al ecosistemal ya
sea a través de la fotosíntesis o del ciclo del detritus.
Es por ello que cuando hablamos de la evolución del planeta, de las ciencias
ambientales, de la biotecnología ambiental, de la ecología funcional, del cambio
climático o de la generación de gases de efecto invernadero, invariablemente el
tema central son los microorganismos, principalmente los procariontes.
Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero
seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de
conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos.
Su presencia en la atmósfera, sin ser esencialmente un hábitat para ellos, implica
dispersión a cortas o largas distancias y colonización de sustratos diferentes al de
su fuente de origen, en donde pueden actuar en procesos físicos atmosféricos,
como fitopatógenos, alergenos, colonizadores primarios, etc.
Su interacción con los parámetros ambientales es de gran importancia
ya que estos seleccionarán aquellos microorganismos que presenten ciertas
habilidades para soportar la pérdida de agua y los efectos de la radiación ultravioleta, entre otros.
Al tratarse el tema de Vibrio cholera, una bacteria de vida libre, heterótrofa,
de gran importancia en ecosistemas acuáticos salobres y marinos, se resalta
el hecho de ser potencialmente patógena y generalmente la relacionamos solo
con daños a la salud. Olvidamos su gran versatilidad y centramos nuestra
atención en los parámetros ambientales que han estado asociados a eventos
epidémicos.
[13]
13 José Sarukhán
I NTRODUCCIÓN
Prefacio
14
Las cianobacterias, organismos extraordinarios que forman parte del
plancton, bentos y perifiton, y por lo tanto, de la producción primaria de los
sistema acuático, llevan a cabo fotosíntesis y fijación de nitrógeno, son capaces
de sobrevivir en situaciones desfavorables para otros microorganismos llegando
a constituir grandes poblaciones, por lo que la ingestión del agua en estas condiciones representa un riesgo de salud debido a la producción de toxinas.
Entre los protozoarios, que resultan un importante eslabón en la cadena
alimentaria, reguladores de las poblaciones bacterianas, se encuentran microorganimos de vida libre que pueden actuar como patógenos oportunistas, y
cuya interacción con los parámetros ambientales determina en gran parte el
riesgo que implica su ingestión, contacto o inhalación.
La gran diversidad fenotípica de los microorganismos encuentra su
respuesta en su exploración genómica y en el conocimiento de los distintos
mecanismos de recombinación genética. Todo ello nos permite describir la
estructura y función de las comunidades microbianas, de gran importancia en
el estudio de los diversos ecosistemas o como agentes etiológicos de diversas
enfermedades.
Por lo anterior, se considera importante realizar estudios sobre el impacto
en la estructura y función de las comunidades microbianas de vida libre por
el continuo intercambio de microorganismos entre hospedero-ambiente (en
gran parte propiciado por los seres humanos), todo ello de gran interés tanto
ecológico como médico.
Irma Rosas,
Alejandro Cravioto
y Exequiel Ezcurra
B ACTERIAS
EN LA ATMÓSFERA
Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez, Carlos Eslava
y Alejandro Cravioto
Una gran variedad de organismos que cambian su localización geográfica
durante su ciclo de vida, lo hacen a través de la atmósfera. Por tal motivo, las
partículas biológicas están siempre presentes en dicho ambiente, aunque su
número y viabilidad cambien con las horas del día, las condiciones del tiempo,
las estaciones del año y su ubicación geográfica. El tamaño de la biota que fluye
en la atmósfera varía desde micrómetros, como en el caso de virus, bacterias,
esporas y polen, hasta milímetros, como las semillas y los insectos sin alas. Se
pueden encontrar cerca del suelo o a grandes alturas, pero su presencia mas allá
de la tropósfera no se ha determinado con precisión.
La aerobiología es una disciplina relativamente nueva, surgida alrededor
de 1930 y que se encarga de estudiar el aerotransporte pasivo de los microorganismos, su identificación, comportamiento, movimientos y supervivencia,
conjuntando los conocimientos de la microbiología, la meteorología, la física
de los aerosoles y la química atmosférica.
La atmósfera en general no se considera un hábitat de los microorganismos, ya que sólo algunos de ellos son capaces de reproducirse allí.1 Durante
su transporte bajan su tasa metabólica y se recuperan hasta que se impactan
sobre un organismo o un medio con las condiciones óptimas para crecer o
infectar. Sin embargo, su presencia en la atmósfera tiene gran relevancia desde
el punto de vista ecológico, por el grado de dispersión que pueden adquirir
y que difícilmente lograrían, siendo su hábitat primario terrestre o acuático.2
Considerando la física atmosférica, las aerobacterias se asocian con los núcleos
de condensación, los núcleos de congelación y con su enriquecimiento por
efecto de la niebla.3,4
Los estudios aerobiológicos se iniciaron como resultado de un interés epidemiológico, para tratar patógenos de animales, plantas o del hombre. Recien[15]
15 Bacterias en la atmósfera
1. INTRODUCCIÓN
Microbiología ambiental
16
temente este tipo de investigaciones se han incrementado en el área agrícola,
incluyendo plaguicidas microbianos, actividades de composteo y daño por heladas, entre otros. Asimismo, en zonas urbanas se ha registrado la introducción
de microorganismos a la atmósfera asociada a la turbulencia vehicular y a la gran
densidad poblacional, lo que ha dado lugar a un campo de estudio específico.
Actualmente, en respuesta a la problemática del terrorismo, se ha desarrollado
infraestructura para la detección y dispersión de armas biológicas.
La mayoría de las bacterias que entran a la atmósfera provienen de fuentes
naturales como la vegetación, el suelo y los cuerpos de agua, y en menor proporción de las actividades antropogénicas; su supervivencia y distribución están
moduladas por factores biológicos, meteorológicos (como el viento, la radiación
solar, la temperatura, la humedad relativa) y por la química atmosférica.
Su presencia en la atmósfera ha sido demostrada por su crecimiento en medios de cultivo (denominándose cultivables); sin embargo, se considera que esto
representa sólo una pequeña fracción de la población que llega a la atmósfera,
de forma tal que la mayoría podría estar muerta o encontrarse en forma viable
no cultivable.
2. LA ATMÓSFERA COMO PARTE DEL HÁBITAT
El continuo intercambio entre agua, aire y suelo nos obliga a incluir a la atmósfera
como parte del hábitat de los organismos y a descubrir en ella diversos factores
que determinan su distribución, en donde la dispersión juega un papel muy
importante. Es un hecho que sólo para ciertos organismos la atmósfera será
eficiente, y para otros resultará un medio hostil en el cual sólo algunos podrán
soportar la presión, por lo que se le considera un medio selectivo.
Por las dimensiones de este fluido de gases y partículas que rodea a la superficie terrestre, es necesario describir a la atmósfera considerando sus diferentes
capas cuya altura esta relacionada con la temperatura, la presión barométrica y
la densidad del aire.
A la tropósfera o atmósfera baja (que comprende los primeros diez kilómetros), por su cercanía a los ecosistemas terrestres y acuáticos, llegarán las diversas
partículas biológicas en sus formas esporuladas o vegetativas, por mecanismos
activos o pasivos; se distribuirán vertical y horizontalmente, dependiendo de la
energía disponible (viento, corrientes de convección, remolinos locales, etc.) lo
que les proporcionará flotación y movimiento.
En esta atmósfera baja encontraremos diversas capas asociadas a las condiciones del tiempo, como noches claras, días nublados o soleados. Así la capa límite
laminar podrá tener una altura que va de pocos centímetros hasta alcanzar varios
metros; una vez que las partículas biológicas entran a la capa de los remolinos
locales y a la capa turbulenta, podrán llegar a zonas cuyas barreras geográficas
no lo permiten.
En las noches la condición isoterma o la inversión térmica determinarán
la estabilidad de la atmósfera, de tal forma que las partículas introducidas a la
troposfera permanecerán en algunas ocasiones cerca del suelo (figura 1).
Es importante considerar que las dimensiones y la dinámica en cada capa
atmosférica dependerán en parte de la orografía, del tipo de suelo y dosel del
lugar; es por ello que se habla de lo contrastante entre el comportamiento de una
atmósfera urbana respecto de una rural (figura 2). Para el caso de las concentraciones de aerobacterias registradas durante el día se reporta: urbana> bosques>
rural> zona costera.
Noche despejada
Estratosfera
Troposfera
Capa de convección
Día soleado
Capa de mezcla
Cumulus
Capa límite turbulenta
Capa límite laminar
Capa límite laminar
Velocidad del viento
en aumento
Condiciones estables
Fuente: 5.
Día nublado
>
Aire
ca-
17 Bacterias en la atmósfera
Figura. 1. Las capas de la atmósfera
y la dispersión de las partículas biológicas
Este enriquecimiento de partículas biológicas en la zona urbana está asociado a diversas fuentes antropogénicas, pero principalmente a la contaminación
del suelo aunado a la turbulencia, que facilita la introducción de partículas a la
atmósfera a diferentes alturas.
A la atmósfera se pueden introducir una gran variedad de partículas de origen biológico, como granos de polen, esporas fúngicas, bacterias, algas, protozoarios, insectos
y, ocasionalmente, virus. En general, las partículas predominan en las partes bajas de
la atmósfera cerca de las fuentes locales de generación. Sin embargo, algunas esporas
de hongos y bacterias pigmentadas se han recuperado a 48-77 km de altura.6
Las bacterias constituyen uno de los grupos más abundantes en el ambiente.
En condiciones naturales se les encuentra en el suelo, el agua, y las plantas, principalmente como organismos saprobios. Debido a que carecen de mecanismos
Figura 2. Comparación de las diversas capas atmosféricas
en una zona urbana y una rural
18
Microbiología ambiental
3. LAS FUENTES DE LAS AEROBACTERIAS
Siglas: CLP (capa límite planetaria), CLU (capa límite urbana), CLR (capa límite rural),
CDU (capa del dosel urbano).
Cuadro 1. Fuentes naturales y antropogénicas que contribuyen
a incrementar la concentración de bacterias a la atmósfera
Fuente
Concentración (UFC m-3)
Naturales
Costa
Bosques
Pastizales
Matorral desértico
ND – 560
385 – 1.2x103
127 – 587
2 – 283
Antropogénicas
Zona urbana
Calles transitadas
Parques
Estación de transferencia de basura
Planta recicladora de basura
Planta de composteo
Planta de tratamiento de aguas residuales
Zona rural
Campo agrícola
Empacadora de algodón
UFC: Unidades formadoras de colonias.
ND: No detectable.
539 – 7.2x103
100 – 13x103
100 – 2.5x103
350 – 14x103
1.1x103 – 2.8x107
1x103 – 11x106
1x102 – 2x105
202 – 3.4x103
46 – 6.5x103
3.3x106 – 19x106
19 Bacterias en la atmósfera
activos de liberación, son introducidas a la atmósfera por procesos mecánicos,
directamente por la acción del viento y la lluvia sobre el suelo, los cuerpos de
agua y la superficie de las hojas, e indirectamente por la acción de las olas y la
formación de burbujas sobre los sistemas acuáticos.
Las actividades antropogénicas, como el tráfico vehicular, las plantas de tratamiento de aguas residuales, los centros de manejo de desechos sólidos, el movimiento de los animales en suelos expuestos, las prácticas agrícolas y la manipulación
de composta7, 8, 9 entre otros, liberan una gran cantidad de bacterias a la atmósfera,
produciendo la contaminación de las áreas circundantes (cuadro 1).
Las bacterias suspendidas en la atmósfera generalmente se encuentran asociadas a partículas, por lo que su concentración aumenta durante la época de secas,
debido al transporte convectivo de las partículas provenientes de las superficies
secas. Durante la época de lluvias su número disminuye significativamente debido
al lavado de la atmósfera.10
Las plantas, al ser un hábitat natural de muchos microorganismos (saprobios
o patógenos), entre los que se incluyen las bacterias, contribuyen de manera im-
Microbiología ambiental
20
portante a incrementar el número de éstas suspendidas en el aire, por la acción
del viento y de la lluvia, así como por el roce entre las mismas hojas.11 Durante
la época húmeda del año la vegetación puede liberar una mayor carga bacteriana
a la atmósfera que el suelo.
La superficie de los vegetales se considera un sistema abierto, en continuo
intercambio con la atmósfera. Este hábitat aéreo, cercano a la superficie de las
plantas y con el que se mantiene cierta relación, se conoce con el nombre de
filosfera, y sus habitantes son llamados epífitos.12 En gran parte el interés por el
estudio de la filosfera se deriva de la necesidad de conocer el comportamiento
(dispersión, colonización, sobrevivencia y patogenicidad), así como el control
de los fitopatógenos, que son abundantes en este ambiente.
La comunidad bacteriana que compone la filosfera es muy amplia y en realidad
se conoce muy poco acerca del número y especies que la integran, debido a que muchos de sus miembros se encuentran dentro del grupo de organismos no cultivables.
Recientemente se han desarrollado técnicas moleculares para tratar de conocer la
identidad de los miembros que integran a la comunidad de bacterias epífitas. Entre
éstas se presenta una alta tasa de transferencia de plásmidos, a la vez que la abundancia de fagos encontrados sobre las plantas sugiere que la transducción también
puede prevalecer. Por otra parte, la superficie de las hojas se considera como un
medio de colonización hostil para las bacterias, debido a los frecuentes cambios en
la disponibilidad de agua, incidencia de la radiación y baja disponibilidad de nutrimentos, por lo que dichas cepas pueden servir como fuente de genes que codifiquen
para tolerar condiciones de estrés. Esto sugiere que la superficie de las hojas puede
considerarse un área importante para la diseminación horizontal de genes y por lo
tanto un sustento para la diversificación microbiana.12
Por otra parte, los animales y el hombre también constituyen una fuente importante de bacterias patógenas. Las bacterias contenidas en la saliva se liberan
a la atmósfera al hablar, toser y estornudar; la descamación de la piel y el cabello
es una fuente constante de generación de virus, bacterias y hongos; las heces de
animales y humanos pueden contaminar el suelo con microorganismos potencialmente patógenos, y existe la posibilidad de que sean suspendidos posteriormente
en la atmósfera. En diversas muestras de polvo urbano y casero de la Ciudad de
México (datos no publicados) se ha aislado la bacteria Escherichia coli, indicadora
de contaminación fecal, y que constituye el 40% del total de bacterias coliformes
aisladas en el polvo,13 lo que indica un riesgo potencial de contaminación por
ésta y otras bacterias patógenas, así como por virus o parásitos.
Se reconoce que las bacterias están presentes en la atmósfera de ambientes
extramuros, y que su inhalación representa un riesgo para la salud, ya sea en su
forma vegetativa o parte de sus compuestos estructurales denominados “compuestos biogénicos”, como son los lipopolisacáridos de la membrana externa de
las bacterias Gram negativas y los ácidos teicoicos de las Gram positivas.
4. MUESTREADORES
Existen diferentes tipos de muestreadores para colectar las partículas suspendidas
en la atmósfera así como para determinar su distribución por tamaño. Algunos
se han diseñados para el muestreo de polvo o partículas no viables, mientras que
otros se usan exclusivamente para la colecta de bioaerosoles o microorga-nismos.
A continuación se describirán algunos de los muestreadores cuyo uso es más
frecuente en el área de la aerobiología para el aislamiento de bacterias.
El principio de colecta por impactación se basa en la tendencia de una partícula
a desviarse del flujo de aire debido a la inercia, cuando la corriente de aire se
curva al pasar por una superficie sólida o semisólida. Las partículas se separan
de la corriente de aire y se impactan sobre la superficie.
Impactador de cascada
Dentro de esta clase de muestreadores el más usado en los estudios aerobiológicos
es el impactador para partículas viables Andersen (Graseby, Atlanta, GA.). Este
equipo está constituido por una serie de seis placas de aluminio, cada una con
400 orificios cuyo diámetro disminuye sucesivamente, por lo que la velocidad
del aire se incrementa de una etapa a la siguiente. Succiona un flujo de aire de
28.3 L min.-1 (1 pie3) por medio de una bomba de vacío. Las partículas que son
acarreadas en la corriente de aire, con un diámetro aerodinámico entre >15 a 1
µm, son separadas por su tamaño en seis fracciones al pasar por las placas perforadas. Las partículas de una masa mayor son depositadas en la etapa superior,
mientras que las partículas más pequeñas, capaces de mantenerse en el flujo
de aire a baja velocidad, son transportadas sucesivamente a mayor velocidad y
se impactan sobre la superficie de colecta de las siguientes etapas.14 Bajo cada
placa se coloca una caja Petri con agar, en cuya superficie se desarrollarán las
partículas viables (figura 3).
Existe una versión del impactador de cascada Andersen de dos etapas, cada
una con 200 orificios. Al igual que el muestreador anterior, succiona un flujo de
aire de 28.3 L min-1 y las partículas son separadas en las fracciones respirable y
no-respirable. La etapa superior corresponde a las placas 1 y 2 del muestreador
de seis etapas y la inferior a las etapas 3 a 6 (figura 3).
21 Bacterias en la atmósfera
IMPACTADORES
22
Foto: Omar Rojas
Microbiología ambiental
Figura 3. Muestreadores de cascada Andersen de dos y seis etapas
Muestreadores de una etapa
Existen diferentes modelos de muestreadores de una etapa. El muestreador
portátil Burkard (Rickmansworth, England) colecta las partículas suspendidas
con un flujo de aire de 10 L min.-1 a través de una placa perforada con 100
orificios. Se recomienda el uso de este equipo para la colecta de partículas <
5 µm de diámetro, con una eficiencia > 95%. El muestreador N6-Andersen,
el cual es una adaptación del equipo de seis etapas, sólo usa la sexta etapa del
muestreador. El uso de los impactadores de una etapa es más económico en
términos del número de placas de agar requeridas y del tiempo empleado en
el procesamiento de las muestras; sin embargo, presenta la desventaja de no
fraccionar la muestra por tamaños.
Impactadores en líquido (Impingers)
En este equipo de muestreo el aire succionado con una bomba de vacío se colecta
directamente sobre un medio líquido. La mayoría de los impingers están hechos de
vidrio Pyrex, con una sola cámara de colecta y un conducto para la succión del aire,
el cual cuenta con un orificio crítico que determina la velocidad del flujo de aire.
Impingers con fraccionamiento de tamaño
En 1960 May diseñó un muestreador que combina las ventajas de colectar las
partículas suspendidas dentro de un medio líquido, con la de fraccionar las
partículas por su tamaño.17 Este muestreador es conocido como MSLI (multistage all glass liquid impinger) y se presenta en tres tamaños que colectan 55,
20 y 10 L min-1 por medio de una bomba de vacío. Las partículas suspendidas
en la corriente de aire se separan en tres fracciones, que corresponden por su
tamaño, a la depositación en la región extra-torácica, bronquial y alveolar del
tracto respiratorio (figura 4).
Una alternativa al uso del MSLI, es el impactador en líquido Burkard, el cual
al igual que el muestreador anterior separa las partículas en tres fracciones (>10
µm; 10-4 µm; <4 µm) con base en su diámetro aerodinámico (DA). La ventaja
de este equipo es que está fabricado en aluminio, por lo que su diseño es más
exacto, y existe un riesgo menor durante los muestreos ya que es menos frágil
(figura 4).
Muestreadores de centrífuga
La colecta de microorganismos por centrifugación permite la creación de un
torbellino que produce que las partículas suspendidas en el aire se impacten
sobre la superficie de colecta. El muestreador más común de este tipo es el
Biotest RCS (Reuter Centrifugal Air Sampler, Alemania). El aire es succionado
23 Bacterias en la atmósfera
Uno de los modelos es el AGI-30 (all-glass impinger), en el cual el flujo de
aire llega a 30 mm de la base del muestreador. Esto incrementa la eficiencia del
muestreo de partículas viables, ya que reduce la velocidad a la que son impactadas
y disminuye el daño causado por el contacto con la base del muestreador. Este
equipo funciona con un flujo de aire de 12.5 L min-1 y generalmente se usan 20
mL de medio de colecta. La ventaja de este muestreador es que se puede realizar
una serie de diluciones del líquido de colecta cuando la concentración de microorganismos es muy alta.
El empleo de este tipo de equipo no se ha reducido únicamente a la colecta
de partículas fúngicas y bacterias suspendidas en el aire, se ha empleado exitosamente en la colecta de algas, amibas de vida libre,15 virus y recientemente se ha
utilizado el líquido de colecta en la detección de diversos microorganismos por
medio de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).16 El método
de PCR es rápido y sensible, por lo que puede ser usado como una alternativa
para la evaluación de la calidad del aire.
24
Foto: Omar Rojas
Microbiología ambiental
Figura. 4. Muestreadores en fase líquida con fraccionamiento de
tamaño
por el rotor del muestreador, que al girar crea una fuerza centrífuga y ocasiona
la impactación de las partículas. Sobre las paredes de la cámara se coloca una
tira plástica con agar en la que se desarrollarán las colonias de microorganismos, después de ser retirada del equipo e incubada a la temperatura adecuada.
El motor funciona con baterías y succiona un flujo de aire de 40 L min-1 (figura
5). Es un equipo pequeño y de fácil manejo, por lo que su uso se ha popularizado especialmente en la evaluación de la calidad microbiológica de ambientes
hospitalarios.18 Sin embargo, no es un equipo recomendado para el muestreo
de ambientes ocupacionales ya que la superficie de las tiras de agar se saturan
fácilmente.
5. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL Y ESPACIAL DE LAS AEROBACTERIAS
Las bacterias son menos numerosas en la atmósfera que los hongos, aunque
algunas veces pueden encontrarse en la atmósfera como células independientes,
generalmente lo hacen asociadas a partículas que varían en tamaño de <0.65 a
>7.0 µm DA, excepto en zonas costeras donde los aerosoles bacterianos son de
menor tamaño. En esta área más del 84% de las partículas transportadoras de
bacteria tienen un tamaño promedio de 3.6 µm DA. La razón de este tamaño se
debe a que las bacterias se asocian a materiales amorfos de plantas, a escamaciones dérmicas, suelos, hongos, aerosoles marinos, núcleos de condensación
o bien pueden ser introducidas a la atmósfera en conglomerados bacterianos,
protegidos por solutos o sustancias mucosas.19 La figura 6 muestra la distribución
de las aerobacterias por tamaño, en muestreos realizados en la Ciudad de México
a las 10:00 h. durante la época de secas.10
Estas partículas se encuentran en una compleja dinámica establecida entre
la atmósfera, el suelo, los cuerpos de agua y el dosel que forman los edificios o
los diferentes tipos de vegetación, influenciada por procesos de depositación
húmeda y seca, viento y corrientes de convección por mencionar algunos. Estos
factores serán de gran importancia para la distribución de las aerobacterias
cerca del suelo o a grandes distancias, en una zona costera, en los polos, en una
zona rural o una urbana. Por esta complejidad es natural esperar que la concentración de las aerobacterias presente una gran variabilidad, tanto diurna como
estacional. Los resultados obtenidos sobre la cuantificación de aerobacterias en
un valle localizado entre dos montañas, sujeto a condiciones meteorológicas
locales y de mesoescalas, se comportaron bajo el siguiente patrón diurno: en
la noche se registró la mínima concentración y al amanecer la máxima, debido
probablemente a la dispersión de lo acumulado cerca del suelo del día anterior;
durante el día el calentamiento promueve el flujo de bacterias a grandes alturas
25 Bacterias en la atmósfera
Foto: Omar Rojas
Figura 5. Muestreador de centrífuga Biotest
Figura 6. Distribución de las aerobacterias asociadas
a partículas de diferentes tamaños
100
Porcentaje
80
60
40
26
Microbiología ambiental
20
0
<0.65
1.1
2.1
3.3
4.5 ≥7.0
Tamaño de partículas (µm)
y conforme se va estabilizando la atmósfera éstas se acumulan nuevamente cerca
de la superficie del suelo.
Durante la tarde la entrada de aire y la brisa limpian el valle, y finalmente en
la noche, el aire que baja por la pendiente de las montañas termina por desplazar lo acumulado durante el día.19 Se considera que el proceso de las primeras
horas de la mañana (dilución) y el de la tarde (acumulación) se da en diversas
localidades (bosque, urbano y rural), mientras que los otros procesos dependen
de la cercanía a océanos o montañas (figura 7).
Se cuenta con poca información acerca de la variación estacional de las aerobacterias; sin embargo, en algunos lugares de Europa, Estados Unidos y Canadá
se han encontrado altas concentraciones de éstas en verano y bajas en invierno,
asociadas con períodos polvosos de sequía durante la primera temporada, mientras que en primavera e invierno la lluvia y la nieve permiten la disminución de
la concentración de aerobacterias.
Se tiene información de que el tipo de aerobacterias varía con las horas
del día. En la noche las Gram positivas esporuladas presentan su concentración mínima (17%) y las Gram negativas su máxima (22%); durante el
día se invierte el proceso con 35% y 12%, respectivamente. También se ha
evaluado la proporción de bacterias pigmentadas: durante el día disminuye
la proporción de bacterias no pigmentadas debido a su sensibilidad a la ra-
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
5
10
15
Hora del día
20
Fuente: 19.
diación solar, por lo que se registra una mayor proporción de aerobacterias
pigmentadas.20
La distribución espacial de las aerobacterias es dependiente de los flujos
y la modulación meteorológica. El flujo es definido como el número de
bacterias que pasan a través de una unidad de área por una unidad de tiempo
(UFC m3 s-1) y esto a su vez, está determinado por la dinámica atmosférica.
Sin embargo, se tienen pocos datos al respecto. En un matorral desértico,21,
22
se han encontrado 4.7 UFC m3 s-1, 75 UFC m3 s-1por encima de campos de
trigo, y 543 UFC m3 s-1 en campos de alfalfa.23, 24 Diferentes observaciones señalan que estos flujos varían durante el día a pesar de que se considera que la
tasa de crecimiento de las bacterias epífitas se mantiene constante. En general
puede mencionarse que:
·
·
·
·
Las aerobacterias decrecen con la altura (la capa de inversión representa una
barrera para la dispersión de las bacterias).
La concentración de aerobacterias cambia dependiendo de las características
de la superficie por la que atraviesa la masa de aire.
Los sistemas climáticos frontales con vientos en ráfaga pueden incrementar
la concentración, mientras que disminuyen con la lluvia.
Las actividades en zonas urbanas y rurales pueden aumentar la entrada de
bacterias a la atmósfera.
27 Bacterias en la atmósfera
bacterias totales (UFC m-3)
Figura.7 Distribución horaria de las aerobacterias
durante la época de secas
28
Microbiología ambiental
·
El efecto de la contaminación atmosférica puede afectar su viabilidad y por
lo tanto su distribución espacial.
Algunas bacterias pueden viajar grandes distancias y otras pueden afectar
solamente a nivel local y su supervivencia es por corto tiempo.
Las aerobacterias son más numerosas en las ciudades (4000 UFCm-3, promedio
850) que en áreas rurales (3400 UFCm-3, promedio 99).25, 26, 27
Hasta este momento, utilizando el mismo muestreador y las mismas condiciones de cultivo, se obtuvieron los siguientes datos: las bacterias Gram positivas
(73-90%) son el grupo predominante entre las aerobacterias, siendo abundantes
las Micrococaceas y los Staphylococcus; las formas esporuladas registran altas
concentraciones en los bosques, entre intermedias y altas en zonas rurales, y bajas
proporciones en zonas costeras.21 No ha sido posible identificar aproximadamente
21% de las Gram positivas cultivables.
Las Gram negativas representan una baja proporción de la población de
las aerobacterias, donde los grupos representativos son las Pseudomonas (5.510.7%), principalmente en zonas rurales, y las Xanthomonas (0-7.6%) en zonas
costeras (cuadro 2).
En la atmósfera de zonas marinas se han registrado concentraciones de
aerobacterias de 1-32 UFC m-3, incluyendo Micrococcus, Sarcina, Bacillus, Corynebacterium, bacilos pleomórficos, Gram positivos y formas esporuladas. En
la estratosfera (18–27 km), no se ha determinado cuál es la mejor técnica para
hacer un muestreo, sin embargo, se han logrado aislar micrococos, bacilos Gram
positivos, negativos y bacterias difteroides.28
6. VIABILIDAD DE LAS AEROBACTERIAS
Cuando los organismos son estresados por aerosolización, frío, calor, congelación, radiación, contaminación química o choque osmótico, pueden morir
o ser dañados, aunque otros pueden permanecer aparentemente sin resentir
sus efectos. Las bacterias dañadas son importantes ya que no son capaces de
crecer en medios de cultivo (viables no cultivables) como lo harían las especies
no dañadas; sin embargo, éstas se podrían reproducir al encontrar un ambiente
adecuado, obteniendo suplementos metabólicos que les permitirían reparar el
daño sufrido y así poderse reproducir.
De tal forma que la supervivencia de una bacteria al ser estresada, dependerá
de su capacidad de reparar sus funciones biológicas afectadas y podría mencionarse de manera general que lo realizan a través de dos tipos de procesos:
1) Físico-químicos
2) Enzimático (dependiente de energía)
Cuadro 2. Bacterias cultivables aisladas de la atmósfera
de ambientes extramuros
Ubicación
Porcentaje
del total
Bacillus
Arthrobacter
Clavibacter
Curtobacteruim
Rhodococcus
Micrococcus
Pseudomonas
Xanthomonas
Oregon, EE.UU.
(Bosque, costa, urbano, rural)
16.92
1.22
1.92
8.06
0.84
1.46
2.46
2.24
Staphylococcus
Micrococcus
Corynebacterium
Brevibacterium
Listeria
Bacillius
Beijing, China
30.5
7.15
12.85
10.9
30.3
51.3
Escherichia coli
Serratia
Enterobacter
Aeromonas
Klebsiella
No fermentadoras
Ciudad de México
(zona urbana)
4.9
2.1
46.4
5.5
1.0
32.0
Debe mencionarse que las diferentes estructuras y compuestos de las bacterias
no presentan la misma estabilidad termodinámica, siendo menos estables las membranas que los ácidos nucleicos; consecuentemente la molécula dañada dependerá
de la energía del factor estresante. Tal es el caso de la desecación que cuenta con
menos energía que la radiación ultravioleta (UV), por lo que la primera afectará
más fácilmente a las membranas.29 En el cuadro 3 se presentan las moléculas
blanco asociadas con los factores estresantes, lo que resulta importante porque nos
da idea del tipo de proceso que se deberá llevar a cabo durante la reparación.
La reparación de estructuras superficiales es necesaria ante el estrés por deshidratación o rehidratación, los cuales producen daño a estas estructuras y a las
membranas; una forma en que este daño se expresa es a través de la afectación
de enzimas hidrolíticas; metales como el Mg, Fe, o Zn son importantes en los
mecanismos de reparación, pero se ha observado que una completa reparación
29 Bacterias en la atmósfera
Microorganismo
Microbiología ambiental
30
tiene lugar sólo en presencia de fuentes de carbón. La congelación y la descongelación producen este mismo tipo de daño y se ha registrado una recuperación
favorable con péptidos.
La reparación del transporte activo es un proceso que llevan a cabo algunas
bacterias afectadas por deshidratación. El mecanismo de reparación se debe en
parte por un incremento del α-metil glucósido, aunque el mecanismo completo
de reparación aún no se conoce.
El oxígeno, el ozono, los diferentes contaminantes ambientales y la radiación
exacerban la desecación de las bacterias debido a la formación de radicales libres, los
cuales oxidarán principalmente a los lípidos, afectando la fluidez de la membrana.
La reparación del daño por radiación UV induce en el ácido desoxirribonucleico (ADN) un dímero ciclobutano pirimidina, cercano a las uniones citosina
o timina, formando un anillo ciclobutano. Muchas bacterias poseen una enzima
muy específica capaz de separar este dímero, restaurando así la secuencia de
bases; esta enzima tiene requerimientos estrictos de luz. La reparación también
puede ser por corte del dímero de la pirimidina, completándose el espacio por
la acción de la ADN-polimerasa usando la banda complementaria de ADN
como molde.
Se conoce que el gen rulAB, presente en plásmidos de bacterias que habitan
en la filosfera, y el gen umuDC, presente en cromosoma de bacterias entéricas,
están involucrados en la reparación del ADN después de la exposición a radiación
ultravioleta.30
De lo anteriormente descrito, se desprende que los microorganismos que
cuentan con grandes reservas de adenosin trifosfato (ATP) y trehalosa, entre otros,
serán capaces de reparar los daños causados por el estrés de la aerosolización.
Cuadro 3. Moléculas blanco afectadas
por factores ambientales estresantes
Factor estresante
Humead relativa y temperatura
Oxígeno
Ozono
Factor aire libre (ozono+olefins)
Rayos γ, rayos X y UV
Fuente: 29.
Molécula blanco
Fosfolípidos de membrana, proteínas
Fosfolípidos, proteínas
Fosfolípidos, proteínas
Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicos
Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicos
7. RELACIÓN DE LAS AEROBACTERIAS CON LAS FASES DE TRANSICIÓN
Las partículas solubles e insolubles, orgánicas e inorgánicas, naturales o antropogénicas, participan en las fases de transición vapor-líquido, vapor-sólido (hielo)
y líquido-sólido.
Está bien documentado el hecho de que las aeropartículas actúan como
núcleos de condensación en la formación de nubes. Sin embargo, la mayoría de
ellas requieren de temperaturas de aproximadamente –10oC. La peculiaridad
de algunas partículas biológicas, principalmente bacterias, es que tienen la capacidad de inducir congelación a temperaturas de –2oC, aunque la mayoría lo
hacen a – 4oC. Esto significa que si el agua que las rodea está fría, el proceso de
formación de la nube puede ser inducido por estas partículas biológicas como
núcleos activos de congelación.
Algunos organismo han desarrollado mecanismos mediante los cuales
minimizan el daño debido a la congelación, mediante la formación de hielo
extracelular. Específicamente las bacterias sintetizan proteínas con diferentes
funciones:31
·
·
·
Proteínas núcleo de hielo, actúan como soporte para formar hielo.
Proteínas anti-núcleo, inhiben la formación del núcleo de hielo, por medio
de una partícula extraña en la gota de agua.
Proteínas anticongelantes, disminuyen las temperaturas de congelación, modifican o inhiben el crecimiento de los cristales de hielo y su recristalización,
y protegen a la membrana celular de los daños inducidos por el frío.
Los genes involucrados en la formación de núcleos de congelación han sido
secuenciados para Erwinia ananas (inaA) y para varias especies de Pseudomonas (inaW, inaZ); la alta homología y su posible ancestro común aún es tema
de discusión.32
Se conoce poco del papel de las partículas biológicas en la formación de núcleos de condensación de nubes, aunque se especula que ciertas partículas con
gran afinidad por el agua podrían tener un papel activo. Datos experimentales
señalan que los granos de polen presentan propiedades higroscópicas, ya que
adquieren agua de la atmósfera a una humedad relativa menor al 100%.33
Por otro lado, es importante mencionar que se considera que la niebla actúa
como una fuente generadora de bioaerosoles secundarios, ya que algunas aerobacterias se duplican durante los eventos con niebla.4
31 Bacterias en la atmósfera
EN LA ATMÓSFERA
8. AEROBACTERIAS PATÓGENAS
32
Microbiología ambiental
FITOPATÓGENOS
Para los microorganismos la dispersión es una oportunidad para que muchos de
sus propágulos se distribuyan amplia y azarosamente entre áreas y hospederos,
principalmente inhóspitos. Uno de los mecanismos utilizados en la dispersión
consiste en la formación de propágulos resistentes y la liberación de cantidades
considerables de esporas, situación que incrementa notablemente la colonización
de un hábitat. Tal es el caso de numerosos hongos fitopatógenos transportados
por el aire. Puccinia graminis es capaz de liberar millones de esporas por m3
en un campo de trigo, su liberación puede realizarse en períodos cortos o
hasta por seis meses y no requiere de ningún otro vehículo o vector para su
diseminación.34 En el caso de las bacterias, muchas de éstas provienen de la
filosfera35 y su dispersión se ve favorecida durante las primeras horas de la
mañana de días soleados, cuando las hojas están secas y la velocidad del viento supera 1 ms-1, lo que permite que se efectúe el transporte de alrededor de
100 UFCm3s-1; sin embargo, esta concentración puede ser muy variable.23 La
inmigración y emigración de fitopatógenos también puede ocurrir durante
la lluvia, la irrigación de los cultivos y su cosecha, a través de aerosoles generados y transportados por el viento o cuando las gotas de lluvia golpean la
superficie de hojas infectadas.36 Sin embargo, este mecanismo también puede
reducir rápidamente las poblaciones de bacterias, debido al efecto de lavado
que ejerce sobre ellas. Finalmente los patógenos son depositados en el suelo,
el cual constituye una fuente de microorganismos que pueden ser nuevamente
suspendidos en la atmósfera, siempre que la velocidad del viento sea mayor a
0.2 ms-1, y el suelo se encuentre lo suficientemente seco.23, 37 Otro mecanismo
de dispersión se presenta a través de vectores, como algunos insectos y aves,
los cuales transportan hongos y bacterias epífitas en sus extremidades.38, 39
El transporte aéreo es extremadamente deletéreo, ya que las células son expuestas a radiación UV, desecación y altas temperaturas; no obstante, algunas
bacterias pueden tolerar dichas condiciones. La dispersión de los fitopatógenos
puede ser local, si se realiza dentro del mismo cultivo, o de forma global, como
ocurre durante las tormentas de polvo. Un ejemplo de transporte a grandes
distancias lo representa Puccinia graminis, el cual fue transportado del norte de
México y el sur de Texas al norte de los Estados Unidos de América y Canadá
durante la primavera, haciendo un recorrido similar en sentido contrario durante el verano y otoño. Se han registrado transportes a través de los océanos de
fitopatógenos que van de Australia a Sudáfrica, de Angola a Brasil y de África al
Caribe y América.40, 41, 42 Se requiere del diseño de modelos donde los eventos de
liberación, dispersión y depositación en el hospedero estén interconectados con
los fenómenos de turbulencia atmosférica y de esta forma poder predecir cómo,
cuándo y dónde serán transportados los fitopatógenos.43
Las plantas superiores sirven como un ambiente donde pueden desarrollarse
poblaciones y comunidades microbianas, que incluyen bacterias, levaduras y
hongos. Las bacterias constituyen uno de los colonizadores más numerosos, registrando concentraciones de 107 bacterias cm-2.12, 44 Las actividades de las plantas,
la nutrición y los componentes celulares proveen una fuente de nutrimentos para
dichos microorganismos, estos a su vez, son la causa de respuestas morfológicas,
bioquímicas o patológicas en el individuo con el cuál están asociados. Esta relación entre macro y microorganismos es altamente interdepen-diente, debido
a la proximidad física tan estrecha que presentan.34 Las relaciones microbianas
pueden ocurrir en la rizósfera, en la filosfera o en el suelo, a una distancia cercana
de la planta. El interés por dichas relaciones, se debe al impacto económico de
los fitopatógenos en la producción agrícola, con una clara necesidad de entender
su comportamiento y control.
Estudios sobre la diversidad de bacterias realizados con las secuencias del
ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) del 16S revelan comunidades más complejas a las reportadas con anterioridad.45 En el cuadro 4 se enlistan algunas de las
especies fitopatógenas frecuentemente aisladas en hospederos con importancia
económica. Las bacterias pueden afectar el desarrollo y la productividad de
una planta por diferentes mecanismos: disminuyendo la eficiencia del proceso
fotosintético, como patógenos, actuando como núcleos de congelación y por
la producción de fitohormonas. Sin embargo, poco se conoce sobre el papel de
colonizadores no patógenos; Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans son
dos especies epífitas que inhiben la colonización de fitopatógenos y actualmente
son explotadas comercialmente.12, 46, 47 Los factores que participan en la relación
planta-bacteria son la distribución geográfica y clima, la fenología y edad de la
planta, y la genética de las bacterias.
Dentro de las características de los fitopatógenos se encuentra la abundancia
de formas pigmentadas, como Erwinia herbicola, que confieren ventajas selectivas para colonizar ambientes expuestos a radiación solar intensa.48 Otro de los
habitantes comunes en las hojas es Pseudomonas syringae, cuyo éxito en la colonización se debe a su capacidad para utilizar como fuente de energía y carbono
compuestos como el metanol y metilaminas, los cuales se encuentran disponibles
en la superficie de las hojas y constituyen una de las principales fuentes de emisión
de metanol a la atmósfera.49 Esta característica le permite a la bacteria parasitar
33 Bacterias en la atmósfera
EFECTO DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS PLANTAS
más de 80 especies de plantas, causando lesiones necróticas. Otro mecanismo
de daño es su participación como núcleo de congelación.50
34
Microbiología ambiental
Cuadro 4. Bacterias aisladas de la filosfera
de especies de importancia económica
Hospedero: centeno
Pseudomonas fluorescent
Xanthomonas campestris
Flexibacter spp.
Listeria spp.
Staphylococcus saprophyticus
Klebsiella spp.
Acinetobacter spp.
Erwinia herbicola
Pseudomonas spp.
Staphylococcus spp.
Bacillus spp.
Micrococcus luteus
Aislados no identificados
Hospedero: pera y manzano
Erwinia amylovora
Pseudomonas fluorescens
Pantoea agglomerans
Hospedero: olmo
Bacillus megaterium
Hospedero: frijol
Curtobacterium citreum
Hospedero: arroz
Curtobacterium albidum
Hospedero: olivo
Pseudomonas syringae
Xanthomonas campestris
Erwinia herbicola
Acinetobacter aceti
Gluconobacter oxydans
Pseudomonas fluorescens
Bacillus megaterium
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Curtobacterium plantarum
Micrococcus luteus
Arthobacter globiformis
Klebsiella planticola
Streptococcus faecium
Clavibacter sp.
Micrococcus sp.
Serratia marcescens
Bacillus subtilis
Cellulomonas flavigena
Erwinia sp.
Zymomonas mobilis
Bacillus sp.
Alcaligenes faecalis
Erwinia carotovora
Pseudomona aeruginosa
Hospedero: diversas plantas
Sphingomonas pruni
BARRERAS PARA LA COLONIZACIÓN
La filosfera puede ejercer una acción selectiva sobre los fitopatógenos. Las condiciones químicas, físicas y biológicas determinan cuáles células sobrevivirán,
proliferarán o morirán, y aunque existen diversas especies con distribución
GENES ASOCIADOS CON LA PATOGENICIDAD
Se han identificado numerosos genes que capacitan a una bacteria fitopatógena en el proceso de colonización. Durante el contacto entre una planta
y un microorganismo patógeno se produce una cascada de eventos, dentro
de los cuales se distinguen dos tipos de respuesta. La primera requiere de
un receptor que interactúe con alguna proteína de la bacteria, desarrollando
una reacción protectora inmediata de la planta; en esta situación, la bacteria
es denominada avirulenta para un genotipo específico.52, 53 En el otro tipo
de respuesta existen proteínas virulentas que afectan a la planta produciendo
radicales libres en el sitio de penetración del patógeno, generando la muerte de
las células infectadas.
En ambos casos se requiere de la transcripción de genes que confieran características de resistencia a las bacterias. Tal es el caso del incremento de polisacáridos extracelulares que fortalecen las paredes, la producción de pigmentos
como la melanina y la expresión de genes rulAB, responsables de mecanismos
de reparación de ADN, características que les permiten a las bacterias resistir
condiciones de desecación y tolerar la radiación UV.
La utilización de diferentes compuestos orgánicos como sustratos, motilidad, osmotolerancia y la capacidad para adherirse a superficies, son también
adaptaciones de fitopatógenos. Algunas de estas características las codifican genes
comunes, y otras genes patógenos, como es el caso del gen gae que codifica un
pili tipo IV que participa en la adherencia de las bacterias.54 El modelo mejor
estudiado es hrp (reacción de hipersensibilidad y patogenicidad) de Pseudomonas
syringae, presente en la mayoría de las bacterias fitopatógenas Gram negativas
35 Bacterias en la atmósfera
global, algunas pueden ser excluidas debido a una o más propiedades del hábitat
potencial. La condición que evita la presencia de otras especies es considerada una
barrera, aunque no necesariamente debe ser un obstáculo físico, ya que pueden
ser sustancias u organismos los que pueden evitar la colonización microbiana.
En el caso específico de las plantas, éstas poseen cubiertas que protegen los sitios
potenciales de colonización y reducen la difusión de nutrimentos, limitando el
crecimiento bacteriano. Tal es el caso de la cutícula externa de los frutos, la cera
de las hojas, los exudados de resina, gomas y taninos.51 Existen también compuestos fenólicos y glucósidos fungistáticos, y la presencia de diferentes enzimas
como la peroxidasa, involucrada en la resistencia contra hongos patógenos.34
Estos microorganismos también están sujetos a condiciones extremas de desecación, radiación UV, cambios de temperatura, humedad relativa, velocidad del
viento, y lluvia ácida, características por las que se considera a la filosfera como
un ambiente estrés.46
Microbiología ambiental
36
y responsable de la necrosis de células vegetales. Algunos genes similares a hrp
han sido identificados de especies no patógenas, en donde funcionan como promotores de crecimiento en la rizósfera. Dentro de las funciones de las proteínas
codificadas por los genes hrp se encuentran la regulación de la transcripción, la
síntesis de los componentes de una vía de secreción y la síntesis de proteínas de
secreción de esta vía, lo que conforma un sistema de secreción tipo III, similar
al que utilizan los patógenos de animales como Yersinia, Shigella y Salmonella
spp.55, 56, 57
En otros fitopatógenos se han caracterizado nueve genes que muestran gran
similitud con las secuencias de hrp altamente conservados, denominados hrc.
Otro grupo de genes requeridos en la formación de lesiones y producción
de toxinas es gacS (activador global del sensor cinasa) y gacA. En este sistema
las proteínas cinasas codificadas por gacS sirven como un sensor de estímulos
ambientales, en donde la señal es transmitida por fosforilación de un regulador
citoplásmico, que induce cambios en la transcripción del gen gacA responsable
de la producción de numerosos metabolitos que contribuyen al biocontrol de
hongos de la rizósfera; ambos genes también influyen en la producción de proteasas extracelulares.58 El gen ice presente en cepas de Pseudomonas syringae es el
responsable del daño por congelación, ya que muestra una correlación positiva
entre la temperatura de congelación y el tamaño de la población de cepas ice +.
Actualmente una estrategia de control de daño es la utilización de cepas recombinantes ice –.12 Los genes asociados a procesos fitopatógenos continúan siendo
estudiados en otras especies, con la finalidad de esclarecer el comportamiento
de la microbiota presente en la filosfera.
La figura 8 nos muestra cómo un fitopatógeno (Pseudomonas syringae) puede
ser dispersado a partir de una semilla infectada y llegar hasta la superficie de la
hoja; su desarrollo depende de la susceptibilidad y estado vegetativo de la planta,
la intensidad de la lluvia y del establecimiento de poblaciones numerosas. En caso
contrario, si las condiciones que prevalecen son de desecación y calor, aunado al
arribo a una planta desfavorable, solamente sobrevivirá el fitopatógeno. Durante
la colonización es necesaria la expresión tanto de genes ordinarios como de genes patógenos (gac, hrp, ice), los cuales favorecen el incremento de la población.
En esta etapa las bacterias pueden producir lesiones, que constituyen espacios
donde el organismo patógeno puede sobrevivir durante condiciones climáticas
desfavorables. Después de este evento el patógeno está preparado para la emigración y dispersión de la enfermedad. Si la planta llega a un estado maduro y
logra producir semillas, el patógeno puede permanecer en ellas hasta que sean
sembradas y así iniciar un nuevo ciclo.46
Figura 8. Comportamiento de un fitopatógeno
{
Ordinarios
↓
hrp ↓
gac
ice
^
Susceptibilidad
de la planta ↓
↓
Inmigración
Resistencia
↓ ↓
Viento ↓
Baj
ap
rob
abi
lid
ad
^
^
^
ión
^
Comunidad
bacteriana
Emigrac
Planta
enferma
gacS
salA
^
Genes
patógenos
^
Formación de semillas
^
Semillas con
bacterias
^
^
^
Nueva planta contaminada por bacterias
PATÓGENOS DE HUMANOS
La presencia de las bacterias en la atmósfera ha sido investigada principalmente
por su potencial patógeno en plantas y animales, incluyendo al hombre, ya que
tanto las estructuras aéreas vegetales como el tracto respiratorio se consideran
sistemas abiertos, en continuo intercambio con la atmósfera.
En general puede mencionarse que la concentración de bioaerosoles en extramuros es mayor que la existente en intramuros; a pesar de ello la posibilidad
de infección para la población general en los ambientes externos es menor. Sin
embargo, la entrada de bioaerosoles a los ambientes intramuros59 representa un
peligro importante principalmente en los hospitales, en los que los pacientes
con problemas inmunes pueden ser afectados tanto por los microorganismos
patógenos como por los oportunistas presentes en estos.
Recientemente se ha investigado la diseminación de patógenos a través de
los océanos, analizando la dispersión de nubes de polvo de los desiertos africa-
37 Bacterias en la atmósfera
Inmigración
Microbiología ambiental
38
nos. Dependiendo de los vientos y la época del año, las nubes de polvo pueden
llegar al norte de Europa, América del Norte, Sudamérica, América Central y
el Caribe. Aunque durante mucho tiempo se consideró que la transmisión de
microor-ganismos patógenos por esta vía era poco factible, principalmente por
el tiempo que tienen que permanecer expuestos a la luz ultravioleta durante el
viaje (5-7 días para cruzar el Atlántico y 7-9 días para el Pacífico), se ha mostrado
que diferentes microorganismos, incluidos algunos patógenos para humanos,
pueden realizar este recorrido y sobrevivir.42
Se cuenta con información42 que señala que existen billones de microorganismos por tonelada de polvo; sin embargo, el mismo estudio refiere que con
los métodos de cultivo tradicionales se puede aislar únicamente el 1% de los
microorganismos asociados a muestras de polvo. Por otro lado, dicho trabajo
considera que la concentración de patógenos es muy baja para causar infección
en humanos, aunque es importante tomar en cuenta que un individuo con respuesta inmune deficiente puede infectarse inclusive con dosis bajas y constituirse
en una posible fuente de transmisión en ambientes cerrados.
Las principales fuentes de bacterias en el aire son originadas por el hombre,
siendo las más importantes las aguas negras y los desechos de origen animal.
La degradación y digestión de los desechos produce aerosoles que contienen
bacterias, algunas de las cuales pueden ser patógenas como es el caso de los estreptococos y las coliformes fecales. El viento y las corrientes turbulentas de aire
tienen enorme influencia sobre la distancia que recorren las partículas después
de ser liberadas. Un estudio realizado en la ciudad de Marsella60 mostró que
el número de bacterias se incrementaba con la temperatura y la velocidad del
viento. La identificación de las bacterias mostró que la localización geográfica
tenía influencia cualitativa y cuantitativa sobre la biota del aire, observándose un
incremento global de los microorganismos, en particular de las bacterias Gram
negativas, sobre todo en el área urbana.
Las bacterias pueden producir endosporas que le confieren resistencia
contra los cambios ambientales, la temperatura y la congelación. Aunque
la mayoría de las bacterias esporuladas son anaerobios estrictos (Clostridium), las hay facultativas como en el caso de Bacillus. Las esporas pueden ser
transportadas a grandes distancias y dispersadas por el viento, por lo que en los
últimos años han adquirido gran relevancia ante la inminencia de atentados
bioterroristas.
Los virus, al igual que las bacterias, normalmente son introducidos a la
atmósfera a través de desechos de origen humano y animal. Sin embargo, su
presencia como partículas individuales en el aire es rara. Su detección e identificación en muestras de aire es complicada, por lo que la evidencia de su presencia en bioaerosoles se ha establecido mediante estudios epidemiológicos en
veterinaria. No obstante, existen reportes de la presencia del virus de la rabia en
grutas habitadas por murciélagos, y de grupos de enterovirus como: echovirus,
poliovirus y coxsackievirus provenientes de muestras de aire obtenidas en sitios
de riego con aguas negras.
El efecto más importante en la población humana (desde el punto de vista
económico y por el número de personas afectadas), atribuido a los aerosoles
de origen extramuros, son los problemas de hipersensibilidad, en particular la
rinitis alérgica, el asma, así como algunas infecciones. Un ejemplo al respecto
lo constituye la legionelosis, padecimiento cuyo agente etiológico es Legionella
pneumophila. Se ha descrito que el principal mecanismo de infección en este
caso es la transmisión directa del medio ambiente por la inhalación de gotas
de agua aerosolizadas o partículas que contienen Legionella viable; la bacteria
se deposita posteriormente en los alvéolos de los pulmones ocasionando una
enfermedad respiratoria severa.
La presencia en los bioaerosoles de componentes de la pared celular de bacterias,
como es el caso de la endotoxina de las Gram negativas y los ácidos lipoteicoicos
de las Gram positivas, representa un problema de salud. La inhalación de estos
compuestos causa reacciones febriles y una respuesta inflamatoria intensa en los
individuos expuestos.61
Uno de los componentes principales, responsable de dicho efecto son las endotoxinas, término empleado para describir el lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las bacterias Gram negativas, el cual produce un efecto tóxico.
El lípido A del LPS es químicamente distinto de otros lípidos de las membranas
biológicas y es el responsable de la actividad tóxica de la molécula.62
Las endotoxinas son ubicuas, dada la naturaleza cosmopolita de las bacterias
Gram negativas. En ambientes extramuros se ha encontrado un patrón estacional
en la concentración de endotoxinas presentes en el aire, siendo superior durante
el verano.63 Sin embargo, las concentraciones más altas en la atmósfera (2-7 µg
m-3) se han obtenido en ambientes ocupacionales, como son las fábricas donde
se procesan fibras vegetales (como el algodón), plantas de tratamiento de aguas
residuales y bioterios, entre otros.64, 65, 66
La respuesta inflamatoria inducida por la endotoxina provoca la liberación
de citocinas a través de un receptor de membrana denominado CD14 y una
proteína de unión al LPS (LBP) presente en el suero. Aunque se creía que CD14
era un receptor específico para la endotoxina, ahora se sabe que también los
peptidoglucanos y los ácidos lipoteicoicos de la pared celular de las bacterias
Gram positivas son capaces de estimular macrófagos alveolares, a través de un
mecanismo dependiente de CD14.67 Sin embargo, CD14 no es un receptor que
39 Bacterias en la atmósfera
COMPONENTES DE LAS BACTERIAS IMPLICADOS EN EL DAÑO A HUMANOS
Microbiología ambiental
40
funcione como transductor de señales, y requiere de otras proteínas receptoras,
como TLR (toll like receptor), que controlan la señalización. El resultado es la
activación del factor nuclear NF-κβ responsable de la transcripción de genes
encargados de la producción de citocinas. La endotoxina durante la señalización utiliza una proteína TLR4, mientras que los peptidoglucanos y los ácidos
lipoteicoicos requieren de TLR2; ambas proteínas, de manera independiente o
combinada, están involucradas en la respuesta inflamatoria.
Las partículas actúan como transportadores de compuestos biogénicos así
como de microorganismos y alergenos. Diversos estudios epidemiológicos
han demostrado que el incremento de aeropartículas menores a 10 µm (PM10),
consideradas como partículas inhalables, afecta la salud de niños y adultos. Esta
situación se ve reflejada en un aumento en las ausencias escolares por infecciones
respiratorias como la bronquitis, la exacerbación asmática, etc. Tal situación
incrementa las visitas a hospitales e incluso la tasa de mortalidad.68, 69, 70
Las evidencias epidemiológicas antes mencionadas sólo comprometen el
tamaño y la concentración de las partículas; sin embargo, la composición de
las mismas tiene un papel muy importante en el tipo de respuesta desarrollada. Alfaro-Moreno et al.71 demuestran que las partículas ambientales de origen
industrial con concentraciones elevadas de metales de transición, colectadas en
la zona norte de la Ciudad de México, son capaces de inducir apoptosis y daño
al ADN en macrófagos y fibroblastos. En cambio, partículas colectadas en la zona
centro, un área donde se combina el tráfico vehicular y la contaminación biológica,
son responsables de una respuesta inflamatoria más significativa.
Otros investigadores, como Soukup y Becker72 y Becker et al.73 han demostrado que bacterias ambientales, como Pseudomonas sp. y Staphylococcus
lentus, asociadas a las aeropartículas, son las responsables de la producción
de citocinas en macrófagos y células CHO transfectadas con CD14, ya que su
producción puede ser reducida hasta en un 50% cuando se utilizan inhibidores
de endotoxina como la polimixina B o bloqueando el receptor CD14. Este tipo
de respuesta es tres veces más alto con bacterias Gram negativas; sin embargo,
éstas se presentan en menor concentración en la atmósfera. Osornio-Vargas et
al.74 reportaron resultados similares en donde la producción de citocinas se ve
disminuida por la proteína neutralizante de endotoxina (PNEr); sin embargo,
no se observa una completa inhibición, lo que sugiere la participación de otros
componentes presentes en las partículas durante la respuesta inflamatoria. El
aire de ambientes urbanos registra concentraciones relativamente altas de bacterias y endotoxina asociadas a partículas, por lo que su inhalación constituye
un riesgo para la salud.
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46
Microbiología ambiental
Vibrio cholerae: UNA BACTERIA AMBIENTAL
CON DIFERENTES TIPOS DE VIDA
Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado, Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto
1. INTRODUCCIÓN
géneros cuyas especies fueran oxidasa positiva y móviles por un flagelo polar. La
familia está constituida por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio incluye 35 especies de las cuales 26 se han identificado
como agentes etiológicos de enfermedad en humanos, de éstas, Vibrio cholerae
es una de las especies con mayor importancia clínica y epidemiológica.1
Los vibrios son proteobacterias-gama, heterótrofas, cuyo hábitat primario
son los ecosistemas acuáticos salobres y marinos, en donde ocupan una gran
diversidad de nichos. Están presentes en la columna de agua y en el sedimento,
por lo que se les puede encontrar como bacterias de vida libre, comensales,
saprobias o parásitas.2 Las bacterias de este género son bacilos curvos o rectos, Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles por flagelos polares y
no esporulados. Para estimular el crecimiento de Vibrio spp. se requiere de
5 a 15 mM de NaCl. Sin embargo, V. cholerae puede crecer sin la adición de
NaCl al medio y en un pH alcalino (10-6.0); con menor de 6.0 su crecimiento
se inhibe.3
2. EL COMPORTAMIENTO DE VIBRIO EN ESTADO DE VIDA LIBRE
Cuando los vibrios se encuentran en su forma de estado libre (planctónica)
queda claro que las condiciones en este hábitat son extremas, ya que el material
suspendido en la columna de agua, así como el contenido de nutrimentos en
general, es bajo.4 En tal situación adopta una condición morfológica diferente a
la que se conoce, disminuye su tamaño (pueden pasar filtros de hasta 0.2 mm),
por lo que en este estado se denominan microvibrios.5
[47]
47 Vibrio chole rae
En 1965, Véron propuso crear la familia Vibrionaceae para agrupar aquellos
Figura1. Mecanismos de supervivencia de Vibrio cholera en zonas
estuarinas
Escasez de nutrimentos
48
Microbiología ambiental
Diversos estudios señalan que los vibrios tienen preferencia por los ecosistemas acuáticos como epibionte, asociado tanto a sustratos vivos como abióticos.
Su relación con material suspendido les asegura que en algún momento pueden
ser depositados en el sedimento donde encontrarán mayor concentración de
nutrimentos. Por otro lado, también se pueden mover hacia niveles superiores
a través de la cadena alimentaria iniciando su viaje con organismos bentónicos
filtradores y detritívoros.6 Se sabe que los vibrios pueden adherirse a diversos
organismos acuáticos, V. cholera por ejemplo, se asocia con copépodos del
plancton, otros del zooplancton, raíces de lirio acuático, algas, etc.7 También
se ha observado que la bacteria sobrevive y crece en dos especies de amibas de
agua dulce.
La adherencia de los vibrios a los sustratos bióticos se considera una interacción de tipo comensal; en este caso las bacterias utilizan compuestos de excreción
como las llamadas proteínas de adhesión asociadas a la superficie. Durante este
proceso es importante considerar propiedades como la producción de enzimas
(como la quinolasa) que le confiere a la bacteria la capacidad para actuar como
degradador de la quitina.8,9 Este polímero es muy abundante en los sistemas
Reproducción de la tasa
respiratoria
Disminución de tamaño
Reducción de reservas
celulares
Cambios morfológicos
Cambios antigénicos
Asociado con:
. Quitina
. CaCO3
. Tejidos
. Detritus
. Plancton
Epibionte
Vida libre
Microvibrio
Densidad o disponibilidad de partículas o superficies para asociarse
salobres y marinos, ya que forma parte del exoesqueleto de crustáceos como
la jaiba y el camarón, por lo que representa una fuente muy rica de carbono y
nitrógeno.
Es importante analizar los casos en que los vibrios pueden actuar como patógenos de organismos acuáticos de importancia comercial, o bien que estos
organismos puedan ser un vector de patógenos para el hombre. Al respecto se
ha estudiado la relación entre Vibrio y los copépodos; por un lado, la bacteria
utiliza la quitina de estos últimos como sustrato y por otro, dado que uno de los
sitios de colonización es el saco ovígero, cuando el copépodo libera los huevos
fertilizados al ambiente estos se convierten en un vehículo para la diseminación
de los vibrios.7
Con respecto a su participación como patógeno, se ha reportado que V.
anguillarum, V. alginoliticus y V. splendidus son responsables de ocasionar
la muerte de larvas de ostión. El estudio del posible mecanismo mediante el
cual colonizan y producen la muerte de dichas larvas, señala que un estado de
estrés del hospedero da lugar a una respuesta neuroendócrina que incrementa los niveles de noradrenalina induciendo la liberación de hierro, elemento
importante para la reproducción de los vibrios.10 Se ha establecido que ciertos
factores ambientales afectan el comportamiento de la bacteria. Por ejemplo
diversos estudios muestran cómo el incremento de la temperatura influye en
el comportamiento patógeno de diferentes especies de Vibrio sobre ciertos
organismos acuáticos.11
•
•
•
•
V. coralliilyticus: Pocillopora damicornis
V. splendidus: larvas Crassostrea gigas
V. carcharine: Haliotus tuberculata
V. vullneficus: Angulla anguilla
• V. peneaicid: camaron
• V. parahaemolyticus: peces
4. TRANSMISIÓN DE Vibrio A LOS A SERES HUMANOS
Los organismos acuáticos, principalmente los bentónicos filtradores que se
consumen crudos, pueden ser vectores de vibrios patógenos para el hombre.
En las costas del Golfo de México V. vulnificus alcanza concentraciones de hasta
49 Vibrio chole rae
3. Vibrio: MICROORGANISMO PATÓGENO EN SU HÁBITAT
105 UFC g-1 en ostiones, con temperaturas >20 °C y salinidades de 5 a 20 %. En
el Pacífico noroeste de Estados Unidos de América, al registrase un incremento
de temperatura entre 1-5 C asociados a El Niño, se identificaron altos niveles de
V. parahaemolyticus en ostiones (11,000 UFC g-1), un hecho similar se reportó
para la bahía de Galveston, Texas.12
5. VIBRIO CHOLERAE, BACTERIA CON HÁBITAT PRIMARIO ACUÁTICO,
En 1935 Gardner y Venkatraman proporcionaron la primera clasificación de
Vibrio cholerae basándose en las características del antígeno somático (O), y le
asignaron el serogrupo O1 al agente causal del cólera. V. cholerae también expresa un antígeno flagelar (antígeno H), el cual es igual en todos los miembros
de la especie. Dentro del serogrupo O1, existen tres variedades antigénicas o
Figura 2. Comportamiento biológico de Vibrio.
Mecanismos de transmisión a seres humanos y al ambiente acuático
Seres humanos
50
Microbiología ambiental
PATÓGENO DE SERES HUMANOS
Agua potable
Alimentos
Aguas negras
Ecosistema acuático, pH,
tremperatura, salinidad,
sustratos
Vibrio spp.
Epibonte
Plancton
6. VIB RIO CH OLE RA E , BACTERIA ADAPTADA PARA SOBREVIVIR EN DISTINTOS HÁBITATS
El comportamiento epidémico de V. cholera, en su estadio de patógeno de seres
humanos, se ha asociado con los florecimientos de plancton, componente biótico del ambiente acuático que le permite mantenerse y reproducirse. Durante
su estancia en su habitat primario, la bacteria presentan gran capacidad para
responder a cambios ambientales como la temperatura y la salinidad, variaciones cualitativas y cuantitativas de nutrimentos, presencia de depredadores y/o
competidores, así como a la existencia de tóxicos tanto antropogénicos como
biogénicos. La propiedad que ha desarrollado el género Vibrio para detectar y
responder ante situaciones emergentes es de gran importancia para su supervivencia y transmisión. Diferentes estudios han conducido a la identificación de
algunos mecanismos con los cuales la bacteria puede sobrevivir en situaciones
extremas.17,18
Cambios morfológicos ante la disminución de nutrimentos. El proceso que
adoptan las bacterias ante la falta de un sustrato generador de energía se de-
51 Vibrio chole rae
serotipos (basados en las diferencias de los componentes del polisacárido del
antígeno somático) designadas como Ogawa, Inaba e Hikojima según su formula
antigénica AB, AC y ABC, respectivamente. Además Vibrio cholerae O1 se divide
en dos biotipos: Clásico y El Tor, que difieren entre sí por pruebas de hemoaglutinación de eritrocitos de pollo, hemólisis de eritrocitos de carnero, sensibilidad
a los bacteriófagos IV (Clásico) y (V) El Tor, la reacción de Voges–Proskauer
(VP) y susceptibilidad a la polimixina B.3
Los Vibrios que no aglutinan con el suero anti O1 se denominan genéricamente como no-O1 o no aglutinables (NAG). En 1994 el esquema de tipificación por
serología reconocía hasta el serogrupo O140, incluyendo dos particularmente
importantes, O139 Bengal, causante de una epidemia parecida al cólera en el
sureste asiático a finales de 1992, y el serogrupo O140 o Hakata, que posee
solamente el factor antigénico C (presente en serotipo Inaba), pero carece del
factor A, el cual es específico para el Vibrio cholerae O1, el esquema actual incluye
aproximadamente 200 diferentes variedades antigénicas.13
La diseminación de la enfermedad en India y Bangladesh, causada por el
serotipo O139 o Bengal, marcó por primera vez que una cepa de Vibrio cholerae no-O1 haya sido asociada a grandes epidemias,14 aunque continúa estando
confinada al Sur-Este Asiático. Vibrio cholerae O139 es responsable de aproximadamente el 15% de los casos de cólera confirmados en uno de los países
endémicos de Asia.15, 16
Microbiología ambiental
52
nomina latencia. En este estado los vibrios cambian su morfología y adoptan
una forma de coco, perdiendo casi el 90% de su volumen original. Pierden la
integridad de las capas externa, peptidoglican, e interna, reteniendo solo algunos
remanentes; por otro lado, comprimen el material nuclear centralizándolo en la
célula y rodeándolo de un denso citoplasma. Se ha observado que estos cambios
están asociados a tasas metabólicas bajas, se ha demostrado que son reversibles,
recuperándose la bacteria cuando regresa a condiciones favorables.19
Características externas de la bacteria y papel de un polisacárido extracelular.
La alteración de las estructuras externas y la adhesión en esta etapa son de gran
significado ecológico. Se ha citado la presencia de formaciones fibrilares y un
incremento en adhesión e hidrofobicidad. En la respuesta a bajos niveles de
nutrimentos se observó la presencia de un polisacárido extracelular amorfo,
notándose que este material le confiere carácter rugoso a sus colonias, además de
resistencia a cambios osmóticos y de estrés oxidativo. Las formas rugosas forman
además una matriz denominada zooglea la cual promueve la agregación celular.
Bajo esta situación los vibrios forman biopelículas en las cuales las bacterias
pueden atrapar y adsorber nutrimentos y protegerse de los depredadores. Se ha
observado en V. cholerae una preferencia para formar estas biopeliculas sobre
sustratos quitinosos, vainas mucilaginosas de las algas y copépodos. A través
de la biopelícula las células están interconectas por medio de prolongaciones
que constituyen un glicocalix que se extiende desde el sustrato hasta la parte
externa de la biopelícula.20,21,22
Latente y no cultivable. Es un estado en que las bacterias, ante un estrés,
son metabólicamente activas pero no capaces de llevar a cabo división celular.
Debido a que no es posible cultivarlas en medios artificiales a tal estado se le
ha denominado viable no cultivable (VBNC). Se ha propuesto que esta etapa de
la bacteria da lugar a su aparición cíclica, por lo que las bacterias desaparecen
en ciertas épocas del año mientras que en otros aparecen. Esta condición se ha
visto asociada a una reducción de nutrimentos, elevada salinidad o disminución
de la temperatura.19,23
7. V. CH OLE RA E , BACTERIA CON DOS CROMOSOMAS Y DIFERENTES
ESTILOS DE VIDA
Diversos estudios señalan cómo algunos miembros del género Vibrio influyen
de manera importante en diferentes ciclos biológicos del ambiente marino. Se
ha encontrado que varias especies del mismo género son patógenos importantes
para peces, moluscos y mamíferos. Con respecto a V. cholerae aún se tiene poca
información sobre su ecología, la historia natural de la bacteria, incluyendo su
53 Vibrio chole rae
presencia como organismo autóctono en áreas endémicas durante periodos
libres de cólera, su existencia en periodos inter-epidémicos, los factores ambientales que contribuyeron a su re-emergencia en América Latina,24 así como
a los componentes ambientales que contribuyen a su permanencia en regiones
endémicas de cólera.
En años recientes se encontró que el genoma de V. cholerae y otros integrantes del mismo género, presenta 4,033,460 pares de bases (pb), constituido
por dos cromosomas circulares,25 de 2,961,146 pb (cromosoma 1) y 1,072,314
pb (cromosoma 2). En conjunto ambos codifican para 3,885 marcos de lectura
abierta. La mayoría de los genes que son esenciales para las funciones básicas
de la bacteria (replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de
la pared celular), así como de patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan
en el cromosoma mayor. Por otro lado, el cromosoma pequeño contiene 59%
de genes hipotéticos, mientras que en el mayor el 42% de estos no tiene una
función conocida. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y la
viabilidad de la bacteria están ubicados en el cromosoma 1 aunque también, y
solo presentes en el cromosoma 2, hay genes que pueden ser esenciales para el
funcionamiento normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican para las
proteínas ribosomales L20 y L35 y otros que codifican para diferentes intermediarios de rutas metabólicas).
La secuencia del genoma de V. cholerae permitió confirmar la presencia
de un sistema de captura de genes (isla de integración) localizado en el
cromosoma 2 (125.3 kbp). Entre los genes presentes en esta isla se encuentran tres que codifican para productos involucrados en la resistencia a los
antimicrobianos (cloramfenicol acetiltransferasa, proteína para resistencia
a la fosfomiocina y la glutation transferasa), varias enzimas del metabolismo del ADN (MutT, transposasa y una integrasa), genes de virulencia
(hemaglutininas y lipoproteinas) así como tres genes que codifican para
productos similares a las proteínas de adicción del hospedero (higA, higB y
doc), utilizados por los plásmidos para la selección y el mantenimiento en
las células del hospedero.
El análisis de la secuencia del genoma de V. cholerae mostró que la mayoría
de los genes presentaban gran similitud con los de E. coli (1,454 MLA (marcos
de lectura abierta)). También se encontró que 499 (12.8%) de los MLA tenían alta
similitud con otros genes, lo cual sugiere la existencia de duplicaciones recientes.
La mayoría de los MLA duplicados codifican para productos involucrados en
funciones de regulación, quimiotaxis, transportes y adherencia, transposición
y patogenicidad. De un total de aproximadamente 105 duplicaciones, por lo
menos un MLA se encuentra en cada cromosoma, lo que sugiere que se han
presentado entrecruzamientos recientes entre ambos. La extensa duplicación de
genes involucrados principalmente en mantener la homeostasis de la bacteria
(quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la importancia de los productos
Microbiología ambiental
54
de estos genes en la biología de V. cholerae, principalmente en relación con su
capacidad para habitar diversos ambientes. Es probable que dichos ambientes
condujeron la duplicación y divergencia de los genes que son utilizados para
funciones específicas. Al respecto se considera que los genes de virulencia están
sujetos a presión selectiva, lo cual afecta el número de copias y su localización
sobre el cromosoma. La existencia de varios MLA con funciones aparentemente
idénticas en ambos cromosomas, sugiere la participación de transferencia lateral
de genes y eventos de transposición.26
La estructura de dos cromosomas se ha encontrado en otras especies del
género Vibrio, lo que sugiere que el contenido de genes del megaplásmido confiere a la bacteria una ventaja evolutiva, principalmente dentro del ecosistema
acuático en donde las diferentes especies de Vibrio son los microorganismos
dominantes.Aún no resulta claro por qué el cromosoma 2 no se ha integrado
en el cromosoma mayor aunque, se sugiere que tiene funciones especializadas
importantes para la presión selectiva en la evolución. Una de ellas podría ser
el haber acumulado genes que son mejor expresados a un alto o bajo número
de copias que los ubicados sobre el cromosoma 1. Otra posibilidad es que en
respuesta a alteraciones del ambiente solo uno de los cromosomas se transfiera
a las células hijas (segregación aberrante). Aunque estas células con un solo
cromosoma pueden ser defectuosas para su replicación (células latentes) mantienen su actividad metabólica y por lo tanto pueden ser una fuente potencial
de las formas viables pero no cultivables (VBNC) descritas en V. cholerae23 y otras
bacterias. Las bacterias en estado de latencia también pueden jugar un papel en
la formación de biocapas (biofilms) produciendo quitinasa extracelular, proteasas
y otras enzimas degradantes que favorecen la supervivencia de la bacteria en
la biocapa.22
8. TRANSPORTE Y METABOLISMO ENERGÉTICO
V. cholerae puede vivir en diversos hábitats, incluyendo su asociación con
zooplancton, puede adquirir la forma planctónica en la columna de agua,
así como patógena en el tracto gastrointestinal del humano, por lo que no
resulta sorprendente que la bacteria posea un gran repertorio de proteínas
con enorme especificidad de sustratos, mismas que le permitan realizar diferentes funciones catabólicas que respondan eficientemente a los constantes
cambios en los ecosistemas.27 Los genes que codifican para las enzimas que
realizan el transporte y/o degradación de diferentes sustratos se localizan en
ambos cromosomas (ribosa y lactato en el cromosoma 2 y trealosa en el 1).
Sin embargo, muchas otras funciones metabólicas las realizan genes de ambos
cromosomas (glicólisis).
En el ambiente acuático, la quitina representa una fuente de carbono y nitrógeno. Esta fuente de energía es importante para V. cholerae cuando está asociado
con el zooplancton, el cual tiene un exoesqueleto quitinoso.27,28 Para el transporte
de molibdeno, fosfato y sulfato existen genes en uno o ambos cromosomas.
Los involucrados en el transporte del molibdeno se localizan en el cromosoma
pequeño, y los encargados del transporte del sulfato se alojan en el cromosoma
mayor. Sin embargo, en ambos cromosomas existen copias de los genes para los
transportadores del fosfato, los cuales son diferentes en cada cromosoma, lo que
indica que no son consecuencia de una duplicación reciente.
Las vías de regulación activadas en respuesta a señales ambientales y patogénicas se codifican entre los dos cromosomas. Lo anterior incluye procesos para la
supervivencia durante periodos de inanición, censado por mayoría (quórum
sensing) y expresión de la hemolisina (HlyA). En los periodos de carencia de
nutrimentos, V. cholerae y otras bacterias Gramnegativas entran inicialmente
en una fase estacionaria y posteriormente al estado VBNC. El factor sigma j38
(rpoS) es importante para la supervivencia de V. cholerae pero no para su patogenicidad, lo que sugiere que dicho factor tiene una función muy importante
en la iniciación del estado VBNC. Existe una copia de rpoS, localizada en el
cromosoma 1, cerca de oriC RpoS que regula la expresión de proteínas como la
catalasa, ciclopropano-graso-acil-fosfolípido sintetasa y HA/proteasa, las cuales
se encuentran en ambos cromosomas. Los genes implicados en quorum sensing,
una regulación dependiente de la densidad celular, se encuentran también sobre
ambos cromosomas. El conocimiento de la secuencia del genóma de V. cholerae
está permitiendo entender, de manera más clara, cómo una bacteria de vida libre
emerge como patógeno de enormes consecuencias para los seres humanos.
10. GENES IMPLICADOS EN LA VIRULENCIA DE V. cholerae
El proceso infeccioso causado por V. cholerae es bastante complejo e involucra
un gran número de factores; este patógeno se ayuda de ellos para establecerse
y colonizar el epitelio intestinal, para lo cual expresa diversos factores de colonización así como varias enterotoxinas potentes. Los genes cuyos productos
actúan como factores de virulencia se encuentran formando parte de agrupamientos (clusters). Anteriormente se creía que estos genes formaban parte del
cromosoma bacteriano de las cepas toxigénicas, pero hoy se sabe que son parte
del genoma de fagos de tipo filamentoso.29,30
55 Vibrio chole rae
9. REGULACIÓN INTERCROMOSOMAL
56
Microbiología ambiental
11. TOXINAS Y FACTORES DE COLONIZACIÓN DE V. cholerae
Una vez que la bacteria se instala en el epitelio intestinal empieza a producir la
toxina colérica o CT, la cual altera el transporte de iones ocasionando la diarrea de tipo secretor que caracteriza el cuadro clínico del cólera. Los genes que
codifican CT (ctxA y ctxB) forman parte de un elemento genético denominado
elemento genético CTX,31, 32 el cual consiste por lo menos de seis genes que integran la región central o del core (ctxA, ctxB, zot, ace, cep y orfU), los cuales están
flanqueados por dos o más copias de una secuencia repetitiva (figura 3).
Otras toxinas importantes se han identificado en cepas de V. cholerae; una
de ellas, llamada Zot (Zonula Ocludens Toxin), tiene actividad sobre las uniones
estrechas, incrementando la permeabilidad de la mucosa intestinal. Otra más es
la toxina Ace (Accesory Cholera Toxin), una potente toxina que ocasiona daño
a nivel de membrana en la célula eucariota, originando desequilibrio iónico.
Aunque CT es el principal factor de virulencia, su acción es incrementada por
el producto de diferentes genes, entre los que se encuentran los agrupamientos
o clusters TCP (Toxin Corregulated Pilus) y ACF (Accesory Colonization Factors), cuyos productos actúan como factores de colonización. Ambos clusters
forman parte de lo que anteriormente se reportó como la isla de patogenicidad
(VPI).31,33
12. CTXF, CARACTERÍSTICAS Y FUNCIÓN EN LA TRANSFERENCIA DE
GENES DE VIRULENCIA
En 1996 usando la cepa de V. cholerae O1 P27459 (modificada genéticamente por
un marcador y renombrada SM44) se demostró que el elemento CTX constituye
en realidad el genoma de un fago filamentoso (CTXΦ). El fago puede propagarse en cepas receptoras de V. cholerae, en las cuales el genoma de CTXΦ puede
integrarse al cromosoma en sitios específicos, o bien mantenerse en forma de
plásmidos. Este fago filamentoso es de ADN de cadena positiva y está compuesto
por una región de 4.5 kb llamada central o core (elemento CTX) la cual esta
formada por seis genes:29
ctxA-ctxB: codifican para la subunidad A y B de la toxina de cólera, respectivamente.
zot: codifica para la toxina zonula occludens.
cep: codifica para la llamada pilina codificada en el core.
ace: codifica para la enterotoxina accesoria del cólera.
orfU: codifica un producto de función desconocida.
Figura 3. Representación gráfica del fago CTX
cap
RS1
orfU
RS2
zot
ctxA
ctxB
RS1
La liberación de CTXF, al igual que en otros fagos filamentosos, puede inducirse con luz ultravioleta o con mitomicina C.34 Una característica observada
en este fago es que pude insertarse a una secuencia de 18 pb denominada attRS
(sitio de ligamiento), presente en el cromosoma de algunas cepas de V. cholerae,
o bien no integrarse y comportarse como un plásmido.
La parte central (core) se encuentra flanqueada por una o más copias de la
región llamada RS; esta es una secuencia de repetidos que se ha dividido en RS1
y RS2 de 2.7 y 2.4 kb, respectivamente. Esta región codifica para un sistema de
integración sitio específico, presentando por lo menos 4 MLA. Se ha observado
duplicación en tándem del RS y en algunas de todo el elemento CTX. Kimsey y
colaboradores35 encontraron que RS1 y RS2 presentan diferencias en sus secuencias,
lo que conlleva a diferencias funcionales entre los profagos encontrados en las cepas
Clásica y El Tor. En las cepas de V. cholerae O1 del biotipo Clásico hay una copia
del profago CTX en cada uno de los dos cromosomas, mientras que en las cepas
del biotipo El Tor el profago está arreglado en tándem en los dos cromosomas. En
las cepas El Tor el genoma del fago a menudo se encuentra flanqueado por una
copia adicional de RS1, la cual contiene genes adicionales a RS2.34,35
13. VPI : CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES
Para la introducción de CTX en las cepas de V. cholerae es necesaria la presencia
de TCP que, como ya se mencionó, es un componente necesario para la colonización intestinal. Recientemente se ha propuesto que TCP también es codificado
por un fago filamentoso denominado VPI.30 El fago filamentoso VPI codifica para
TCP (figura 4), el cual es un importante factor de virulencia así como receptor
del fago CTX. Al igual que CTX , VPI posee ADN de cadena sencilla y positiva,
y el genoma de este fago contiene los clusters TCP y ACF, los cuales contienen
genes cuyos productos actúan como importantes factores de virulencia.
57 Vibrio chole rae
ace
En ensayos realizados con anticuerpos anti-TCP se encontró que ésta es la
principal proteína de cubierta del fago VPI, al igual que CTX, reconoce una
secuencia de inserción (att). Otros genes que conforman el genoma del fago
son:
• tagA: codifica para una lipoproteína.
• aldA: al parecer codifica para una aldehído deshidrogenasa citoplásmica
independiente de CoA, tagA y AldA forman parte del grupo de genes bajo
la regulación de ToxR.
• Int: codifica para una integrasa.
• toxT: forma parte del regulon Tox.
• xtn, tagD, y ssrA: son genes cuyos productos son desconocidos.
58
Microbiología ambiental
Figura 4. Representación esquemática del fago TCP
att
att
xtn
1
aldA tagA
2
3
4 tagD I
A
taxT
TCP cluster
Z V int ssrA
ACF cluster
14. REGULACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA
El hábitat natural de las cepas toxigénicas de V. cholerae comprende diferentes ambientes, uno lo constituye el tracto digestivo del hospedero cuando la
bacteria se comporta como patógeno; el otro es el ambiente acuático cuando
actúa como microorganismo de vida libre. El microambiente del tracto intestinal provee las condiciones óptimas para la expresión de un gran número
de factores asociados a virulencia. CT, TCP y por lo menos otros 17 genes
involucrados en el proceso de virulencia están bajo el control de la cascada
regulatoria ToxR-ToxT.36,37,38
Al activarse ToxR sufre cambios conformacionales que dan como resultado
la formación de dímeros que son estabilizados por la proteína ToxS que activa
la transcripción de los genes ctxA y ctxB. ToxR activa además la transcripción
del gen toxT, gen regulador que se encuentra en VPI y que es miembro de la
familia AraC. La expresión de CT y TCP, así como de otros factores de virulencia,
difieren entre las cepas de V. cholerae de los biotipos Clásico y El Tor, lo que ha
sugerido la expresión diferencial del regulón ToxR en los dos biotipos debida a
un control biotipo específico sobre la expresión de toxT. 39 Los diferentes siste-
mas de regulación en V. cholerae conducen a una variación en la expresión de
los genes de virulencia optimizando su permanencia en diferentes ambientes
tales como el intestino humano y el hábitat marino.
Los mecanismos involucrados en la emergencia de nuevas clonas no han sido
explicados, auque se considera que la combinación entre cambios genéticos y la
selección natural causada por factores ambientales no identificados, así como el
estado inmune de la población, influyen de manera importante en este proceso.
Además de determinar la importancia de los factores ambientales dentro de la
ecología de V. cholerae, se requiere conocer más con respecto a los mecanismos
utilizados por los fagos filamentosos (CTX y VPI ) en la transferencia de genes
de virulencia. La existencia de epidemias ocasionadas por V. cholerae O139, de
brotes debidos a cepas O37, así como el hallazgo de los genes ctxA, tcpA y toxR
en cepas no O1 ambientales, apoya la hipótesis de que la transferencia horizontal
de CTX puede presentarse entre cepas O1 ctxA¯ tcpA+ o ctxA+ tcpA¯ y no-O1
ctxA+ or tcpA+, las cuales coexisten en el ambiente acuático.40,41,42
Se ha mencionado que la infección de V. cholerae por CTX, requiere la presencia de TCP, por lo que se propuso un sistema secuencial de dos pasos para la
evolución de cepas epidémicas. Lo anterior sugiere que las bacterias inicialmente
tienen que adquirir TCP a través de la infección por VPI , para posteriormente
ser infectadas por CTX . Se sabe que los cultivos de V. cholerae que contienen
al fago en cualquiera de sus formas (lisógenos o plásmidos) producen altos
títulos del fago en sus sobrenadantes, por lo que la propagación del CTX puede
estar asociada a eventos de transferencia horizontal dando lugar a nuevas cepas
toxigénicas.42
Estudios en nuestro laboratorio (datos no publicados) permitieron observar
cómo el sobrenadante del cultivo de la cepa epidémica O37 ctxAB+ tcpA+ toxR+
(aislada en Sudan en 1969), expuesto a la luz solar durante varios minutos, liberaba
partículas de CTX. Por otro lado, al incubar una cepa O1 El Tor (2740-80) ctxAB¯
tcpA+ att+ con estos sobrenadantes, se permitió encontrar que se recuperaban
lisógenos 2740-80 ctx+. Estos resultados sugieren que cepas de V. cholerae no-O1
ctxA+ pueden ser inducidas naturalmente para liberar viriones CTXΦ, y de la misma manera lisogenizar cepas O1 no toxigénicas. Gracias a este tipo de mecanismos
las propiedades de virulencia pueden evolucionar a grandes pasos a través de la
transferencia horizontal de grandes bloques de material genético más que a la acumulación de mutaciones de nucleótidos. Estos eventos de transferencia horizontal
de genes probablemente se presentan en la naturaleza y es así como contribuyen
de manera importante al mantenimiento de las áreas endémicas de cólera.
59 Vibrio chole rae
15. EVENTOS INVOLUCRADOS EN LA GENERACIÓN DE CEPAS EPIDÉMICAS
60
Microbiología ambiental
16. EPIDEMIOLOGÍA
En enero de 1991, después de casi cien años de no haber sido identificados brotes
epidémicos de cólera en el continente americano (con excepción de la costa del
Golfo de México en los Estados Unidos de América), se reportó la aparición de
cólera epidémico en Perú relacionado con el aislamiento de una cepa de V. cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Inaba.24 Al año siguiente, en 1992, se aisló una
cepa causante de un brote de cólera en Madrás y en otras ciudades de la India;
la bacteria no era del serogrupo O1 y fue clasificada como O139.14 La aparición
de un nuevo agente causal de un brote con características epidémicas planteó la
enorme posibilidad del surgimiento de nuevas cepas epidémicas sugiriendo, a su
vez, que el cólera no sólo se debía considerar como una enfermedad reemergente,
sino también emergente. Estos hallazgos dieron lugar a un nuevo enfoque sobre
las perspectivas para su estudio en el ámbito epidemiológico y molecular.15,16
Epidemiología molecular del cólera. El conocimiento en la epidemiología
del cólera tuvo un gran avance debido a las medidas de control de la enfermedad y a los adelantos en la biología molecular. Los estudios epidemiológicos de
vigilancia y de tipificación molecular de Vibrio cholerae han permitido a su vez
conocer mejor la evolución, diseminación geográfica y perspectivas globales
de esta enfermedad.
En 1978 se presentó un primer brote de cólera a lo largo de la costa del Golfo de
México en los Estados Unidos de América, seguido por otros pequeños brotes de la
enfermedad observados hasta fechas recientes.43 Mediante técnicas de southern blot
e hibridación, con sondas para la toxina colérica, se demostró que los aislados
de Vibrio cholerae O1 El Tor, obtenidos en dicha área, eran clonales y diferentes
de los vibrios aislados durante la séptima pandemia. Una situación similar se
observó en Australia al analizar cepas de Vibrio cholerae O1 aisladas de pacientes y del medio ambiente. En 1991, cuando el cólera llegó a Latinoamérica, se
utilizaron diferentes técnicas de biología molecular así como el método de enzimas multilocus (MLEE) para caracterizar las cepas causantes de la epidemia y
definir la relación genética entre éstas y las responsables de la séptima pandemia
obtenidas en diferentes partes del mundo. Los resultados obtenidos mostraron
que los aislados de América Latina eran esencialmente clonales y probablemente una variante de las pertenecientes a la séptima pandemia, pero diferentes a
las cepas de los brotes descritos en los EE.UU. a las aisladas en Australia y a las
cepas O1 no toxigénicas identificadas en los años 1980 en diferentes países de
América Latina.24
Un estudio realizado por Evins y colaboradores,44 con una colección de cepas
Vibrio cholerae O1 no toxigénicas, O1 toxigénicas (aisladas desde el inicio de
la epidemia en 1991) y variantes toxigénicas del hemisferio occidental, mostró
que por lo menos hubo dos cepas responsables del cólera en América Latina.
61 Vibrio chole rae
El origen de la cepa que ocasionó el nuevo brote de cólera en América es un
misterio rodeado de especulaciones. Se ha propuesto que el microorganismo
fue importado por viajeros procedentes de áreas donde el cólera es endémico,
pero, por otro lado también se sugiere que la bacteria era un microorganismo de
vida libre nativo de las costas de Perú, el cual emergió por efecto de algún factor
ambiental como un patógeno infeccioso con alto potencial epidémico.
En contraste con lo reportado anteriormente sobre las cepas de Vibrio cholerae O1, las cepas de Vibrio cholerae no-O1 no presentaban importancia médica
o epidemiológica ya que se creía que eran responsables únicamente de casos
esporádicos de diarrea en humanos. En octubre de 1992 un importante brote de
una enfermedad parecida al cólera, causada por un serogrupo de Vibrio cholerae
no-O1, apareció en India y Bangladesh y rápidamente se diseminó a Pakistán,
Nepal, Tailandia, Malasia y China.14,15 Estudios serológicos identificaron a estas
cepas con el serogrupo O139 con el sinónimo Bengal (lo que indicó el lugar de
aislamiento de las primeras cepas, las ciudades costeras de la bahía de Bengala).
Estas cepas producían cantidades similares de toxina colérica a las observadas
con V. cholerae O1, por otro lado, también hibridizaban con sondas específicas
para los genes ctxA y ctxB y las características clínicas de la enfermedad causada
por estas eran indistinguibles del cólera.16,45,46 Ensayos con el método de enzimas
multilocus demostraron que diferentes cepas de V. cholerae O139 aisladas en el
Sureste Asiático mostraban un perfil electroforético idéntico al del Vibrio cholerae
O1 Ogawa biotipo El Tor aislado en México durante la epidemia.47
Resultados similares se obtuvieron al analizar cepas representativas del serogrupo O139, aisladas en diferentes lugares del mundo desde su aparición en 1992,
y al compararlas con las de una colección de V. cholerae O1, no-O1 y no-O139,
aisladas entre 1969 y 1999. Lo anterior permitió sugerir que V. cholerae O139
incluye cepas epidémicas y no epidémicas que evolucionaron de diferentes linajes
y derivan de V.cholerae O1 o no-O1 respectivamente. El análisis de 397 aislados de
V. cholerae O1, O139 y otros serogrupos no O1, mostró, por un lado, la diversidad
genética de la bacteria y por otro la relación genética entre las clonas epidémicas
O1 y O139 y serogrupos no O1, así como su estructura poblacional.48
Los resultados mostraron además que las cepas O1 y O139, pandémicas
junto con una clona del serogrupo O37 (que en la década de 1960 demostró
tener potencial epidémico), conforman un grupo relacionado genéticamente,
sugiriendo que estas clonas aparecen por modificación del linaje que ya era
epidémico o muy relacionado genéticamente al de las clonas epidémicas. La
inferencia, por lo menos en este grupo de cepas, es que la tasa de transferencia
horizontal y/o eventos de recombinación de genes del metabolismo básico son
suficientemente altas para prevenir el desarrollo y el mantenimiento a largo
plazo de alelos distintivos. Aún así los linajes clonales que se observaron pueden persistir durante periodos largos (hasta décadas). Los ejemplos más obvios
Microbiología ambiental
62
son las clonas epidémicas y pandémicas O1 y O139, pero más aún, el análisis
identificó numerosas clonas y linajes clonales de cepas de V. cholerae no O1 con
una extensa distribución geográfica.
En estudios previos se demostró la existencia de recombinación de genes
en la región rfb de V. cholera, hecho que sugiere la emergencia de nuevos serogrupos con potencial epidémico. En un estudio realizado en México, utilizando
el método de enzimas multilocus para determinar el origen clonal de las cepas
estudiadas,48 se mostró que las cepas con un mismo serogrupo frecuentemente
son divergentes y genéticamente distantes, lo cual apoya la evidencia anterior
de que los genes rfb están sujetos a una alta frecuencia de recombinación. Estos
resultados y el que los genes que codifican para los principales factores de virulencia se pueden adquirir por transferencia horizontal apoyan la propuesta de que
cualquier V. cholerae se puede transformar en una cepa virulenta y epidémica.
Aunque el conocimiento que se tiene de los integrantes del genero Vibrio ha
crecido mucho durante los últimos años, aún existen muchas interrogantes para
poder controlar y erradicar su participación como patógenos del hombre.
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66
Microbiología ambiental
LA ECOLOGÍA DE LAS AMIBAS
PATÓGENAS DE VIDA LIBRE EN
AMBIENTES ACUÁTICOS
1. INTRODUCCIÓN
Las amibas de vida libre (AVL) son protozoos cosmopolitas que habitan
ambientes húmedos como el suelo y el agua, aunque también se pueden encontrar
en el aire, vehículo que utilizan como medio de dispersión. En los ecosistemas
acuáticos desempeñan un papel muy importante en el mantenimiento del flujo de
energía y el reciclado de los nutrimentos. Su eficiencia en el uso de los recursos
los convierte en un enlace fundamental entre los organismos desintegra-dores
y aquellos pertenecientes a niveles tróficos superiores.
A mediados del siglo XX se descubrió que algunas amibas pequeñas del
suelo y del agua, que hasta entonces se consideraban inocuas, podían invadir a
los seres humanos así como a otros animales, pudiendo causarles la muerte o un
daño cerebral irreversible. Debido a su habilidad para vivir como organismos
de vida libre y como endoparásitos, a las amibas se les conoce también como
organismos anfizoicos. Algunas son patógenas por sí mismas pero también
pueden actuar como vectores de bacterias patógenas como Legionella pneumophila y Vibrio spp.
Las AVL patógenas son más frecuentes en cuerpos de agua con temperatura
por arriba de los 25 ºC y aguas naturales de los trópicos y subtrópicos. A la
fecha se han descrito las especies Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris y
algunas del género Acanthamoeba. Naegleria fowleri es capaz de producir en el
hombre meningoencefalitis amibiana primaria (MEAP), enfermedad fulminante
y mortal. Balamuthia mandrillaris y varias especies del género Acanthamoeba
pueden provocar encefalitis amibiana granulomatosa (EAG). Acanthamoeba spp.
también puede provocar infecciones severas en pulmón, oídos, nariz y queratitis
amibiana (QA) en ojos. En comparación con otras enfermedades causadas por
protozoos, las infecciones causadas por AVL destacan por su amplia distribución, extrema virulencia y falta de tratamiento efectivo. El primer caso clínico
[67]
67 La ecología de las amibas patógenas
Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortíz
y Carlos Eslava
producido por AVL fue descrito en Australia en 1965 y a partir de entonces se
han registrado casos en todo el mundo, lo que demuestra su amplia dispersión
y sugiere la posibilidad de que muchos casos hayan pasado inadvertidos por la
falta de conocimiento acerca de este grupo de organismos.
68
Microbiología ambiental
2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
El trofozoíto de Naegleria presenta una forma alargada característica, por lo que
se le conoce como amiba limax, mide entre 15 y 25 µm, su locomoción es por
medio de lobópodos y se reproduce por fisión nuclear (promitosis). El quiste es
esférico, mide de 8 a 12 µm de diámetro, cuenta con una pared doble lisa y con
uno o dos poros planos. Las amibas de este género presentan una forma flagelada
piriforme, que es fácilmente reversible a la etapa de trofozoíto.1, 2, 3
El trofozoíto de Acanthamoeba es más grande que el de Naegleria (entre 24
y 56 µm), se caracteriza por presentar seudópodos finos llamados acantópodos, se divide por fisión binaria por medio de una mitosis típica. El quiste es
ornamentado, mide entre 11 y 25.3 µm de diámetro, presenta una pared doble
y poros en la unión del ectoquiste y el endoquiste.1, 2, 3
El trofozoíto de Balamuthia mandrillaris es el más grande de los tres géneros
patógenos, mide entre 12 y 60 µm, tiene forma irregular, algunas veces presenta
la forma limax y en otras adopta una forma de araña con seudópodos no ramificados. El quiste mide entre 6 y 30 µm, su pared densa está compuesta por tres
capas y no presenta poros.4
Figura 1. Naegleria: A) trofozoíto limax con lobópodo ancho y
uroide; B) etapa de transición entre amiba y forma flagelada con 2
flagelos y lobópodo; C) quiste circular con doble pared lisa.
Contraste de fases. 400 ×.
a
b
c
Figura 2. Acanthamoeba: A) trofozoíto con acantópodos. Contraste
diferencial de interferencia; B) quiste con endoquiste estrellado;
C) quiste con endoquiste poligonal y D) quiste con endoquiste semicircular. Contraste de fases. 400 ×. a: acantópodos: n: núcleo; nu:
nucléolo; pa: pared; po: poro;
ec: ectoquiste; en: endoquiste
a
en
po
n
ec
A
B
ec
en
po
en
ec
po
C
D
Figura 3. Balamuthia: A) trofozoíto alargado (limax) y B) quiste
con pared densa. Contraste de fases. 400 ×. pa: pared; l: lobópodo; u:
uroide
u
pa
A
B
1
69 La ecología de las amibas patógenas
nu
70
Microbiología ambiental
3. HÁBITAT
Como ya se hizo referencia, las AVL presentan en general una distribución cosmopolita y son ubicuas en la naturaleza. Las especies patógenas son termotolerantes,
aunque no todas las termotolerantes son patógenas.5 Su hábitat principal es el
suelo y desde ahí pueden llegar a los cuerpos de agua arrastradas por escurrimientos o a través del aire.6, 7 En el agua desempeñan un papel fundamental en
el flujo energético y en el reciclado de los nutrimentos. Su crecimiento rápido, el
uso eficiente de los recursos comparado con formas superiores de vida, así como
el hecho de ser un enlace fundamental entre desintegradores y niveles tróficos
superiores, los convierten en un eslabón importante en las cadenas alimentarias
acuáticas.8 Las AVL se encuentran en mayor proporción en la microcapa superficial, debido a la abundancia de nutrimentos y al establecimiento de quistes
aéreos, y se hallan en menor proporción en los sedimentos.9
El análisis por género nos muestra que Naegleria vive principalmente en
el suelo y ambientes acuáticos calentados natural o artificialmente,10 aunque
también se puede establecer en estanques, cascadas, manantiales, lagos y ríos
con temperaturas menores.1, 11 Naegleria se ha aislado de agua de grifo, piscinas,
aguas termales, aguas de desecho, canales de riego, tinas de hidroterapia, lagos
artificiales y efluentes calientes de plantas termoeléctricas.12, 13
Las especies patógenas se observan con mayor frecuencia en cuerpos de agua
con temperaturas por encima de los 30 ºC y aguas naturales de los trópicos y
subtrópicos. En países templados y fríos las amibas patógenas proliferan mejor
durante los meses más cálidos, lo que lleva a pensar en un patrón estacional.5,1
Algunos investigadores han propuesto que el incremento brusco de temperatura, más que una temperatura elevada constante, es lo que realmente favorece
la predominancia de las naeglerias patógenas.14
Los factores ambientales favorables para el desarrollo de este género de amibas
son intervalos de temperatura entre 30 °C y 45 °C, niveles óptimos de oxígeno,
pH cercano a la neutralidad, alimento suficiente (bacterias y materia orgánica)
y un mínimo de humedad; sin embargo, pueden soportar variaciones amplias.
En piscinas, la presencia de cloro libre residual en concentraciones de 2 mg L-1
puede inhibir su presencia.2
Acanthamoeba se encuentra distribuida en todos los ambientes,1, 10 y probablemente es la amiba con mayor distribución en la naturaleza, debido a la gran
resistencia de sus quistes.15 Como consecuencia de su distribución cosmopolita
el contacto con el ser humano es constante y probablemente es la razón de la
presencia de anticuerpos de Acanthamoeba y de Naegleria en suero humano.10
Acanthamoeba se ha aislado de diversos tipos de agua: natural superficial (estanques, lagos y ríos), subterránea, marina, de grifo, piscinas, aguas termales,
agua mineral embotellada, agua de desecho, canales de riego, tinas de hidrote-
4. CICLO DE VIDA
El ciclo de vida de las AVL (figura 4) comprende una fase activa, llamada trofozoíto y una forma quística en latencia, presentándose además en Naegleria, una
forma flagelada.2, 10 Naegleria presenta tres fases en su ciclo de vida: trofozoíto,
quiste y flagelado (figuras 1 y 4). La forma de quiste es la fase de resistencia
en la cual la amiba se mantiene en latencia y puede resistir largos períodos en
condiciones adversas como la desecación, bajas concentraciones de oxígeno,
escasez de alimento, etc.2 En los cultivos de laboratorio se ha observado que el
quiste de Naegleria es menos resistente que el de Acanthamoeba.
71 La ecología de las amibas patógenas
rapia, lagos artificiales, efluentes calientes de plantas termoeléctricas e incluso
de agua congelada.13, 11, 16, 17 También se ha aislado de diferentes tipos de suelo,
sedimento oceánico, sedimento de lagos, lodos resultantes del tratamiento del
agua de desecho, polvo de casas-habitación y de composta.1, 2, 18
De las AVL potencialmente patógenas Acanthamoeba es la única que se ha
aislado de muestras de aire extra e intramuros, así como de conductos de aire
acondicionado. Se considera que debido a las condiciones extremas en ese
ambiente, el aire solo les sirve como medio de dispersión. 1, 6, 18 Dos fuentes de
donde aisló Acanthamoeba, el agua de grifo y lentes de contacto, están muy relacionadas con la incidencia de la queratitis amibiana. Algunas especies también
se han aislado de recipientes para lavado de ojos.10, 2
Debido a que Balamuthia mandrillaris solo se puede desarrollar en cultivos
de tejido y en un medio axénico muy específico, su búsqueda en el ambiente se
ha restringido y no se conoce exactamente su hábitat. Se aisló por primera vez
de un mandril y posteriormente de pacientes con EAG,4 aunque recientemente
se reportó lo que se considera el primer aislamiento ambiental (suelo).19
Por otro lado, se ha demostrado que Acanthamoeba y Naegleria, entre otras
AVL, participan como vectores de diferentes especies bacterianas.20 Legionella
pneumophila es capaz de multiplicarse dentro de la célula amibiana, causar
lisis y liberarse nuevamente en el ambiente. V. cholerae sobrevive dentro de
los quistes de Naegleria y puede recuperarse después de que la amiba exquista. En este caso las AVL, ayudan a mantener a V. cholerae en aguas naturales
en partes del mundo donde no hay asociación evidente con casos de cólera
clínico. También algunas bacterias coliformes y Mycobacterium avium sobreviven dentro de las amibas aunque sin multiplicarse. De esta manera, el
quiste amibiano no solo ofrece a las bacterias un mecanismo de protección
para evadir ambientes hostiles, sino también les proporciona un medio para
transportarse y colonizar nuevos hábitats aprovechando los mecanismos de
dispersión de las AVL.
Microbiología ambiental
72
En el ciclo de vida de Naegleria se destaca su capacidad para cambiar a la
forma flagelada, la cual se presenta cuando la amiba se encuentra en un medio
sin nutrimentos. En el laboratorio se induce la forma flagelada incubando la
amiba en agua destilada o en una solución búffer. En forma transitoria, el organismo no se alimenta ni se divide y después de un tiempo, cuando la amiba
encuentra nuevamente un ambiente adecuado, regresa a su forma amibiana.2
Este proceso se realiza en cuestión de minutos; en el laboratorio es posible observar por unos segundos a la amiba presentando al mismo tiempo seudópodos
y flagelos (figura 1b).
Las diversas especies de Acanthamoeba y la única especie de Balamuthia (B.
mandrillaris) presentan solamente dos etapas en su ciclo de vida, la etapa de
trofozoíto y la forma quística (figuras 2, 3, 4). La etapa de trofozoíto, igual que
Naegleria, es la forma en la que la amiba realiza todas sus funciones. La forma
de quiste es la estructura de resistencia, la cual regresa a su forma vegetativa
cuando las condiciones son favorables.
En el laboratorio se ha observado que el trofozoíto de Acanthamoeba puede
permanecer algún tiempo sin enquistarse aunque las condiciones no sean tan
favorables y en medio líquido se redondea y presenta prolongaciones citoplasmáticas similares a la forma flotante de otras amibas pequeñas de vida libre (por
ejemplo, Vannella y Platyamoeba). El quiste de Acanthamoeba es muy resistente y
puede permanecer viable en los cultivos por meses e incluso años; probablemente
a esto se debe su amplia distribución y alta incidencia en el ambiente.15
5. LA IMPORTANCIA MÉDICA DE AVL
Naegleria fowleri causa una infección aguda que afecta al sistema nervioso central
(SNC) llamada Meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP) o naegle-riosis. El
mayor número de casos se presenta en niños y jóvenes previamente sanos con
antecedente de haber nadado durante el verano en cuerpos de agua naturales
contaminados o artificiales inadecuadamente clorados. La ruta de invasión de
N. fowleri es a través de la aspiración por las fosas nasales del agua contaminada
(figura 4); los trofozoítos invaden la mucosa olfatoria, atraviesan el nervio olfatorio,
la lámina cribiforme y llegan al espacio subaracnoideo.
Las amibas producen edema y necrosis hemorrágica en el tejido cerebral
mediante la producción de hidrolasas lisosomales y fosfolipasas que degradan la
mielina y provocan daños graves e irreversibles en el individuo infectado. También se han descrito otras enzimas como aminopeptidasas, hidrolasas, esterasas,
fosfatasas ácidas y alcalinas, que directa o indirectamente dañan al SNC.2, 3, 21 La
enfermedad se caracteriza por cefalea intensa, fotofobia, fiebre, náusea, vómito
en proyectil y rigidez de cuello; coma, convulsiones y finalmente la muerte. La
Figura 4. Ciclo de vida de Naegleria fowleri y Acanthamoeba spp.
Acanthamoeba spp.
Naegleria fowleri
Aire
Trofozoíto
Esquistamiento
↓
Trofozoíto
Forma
flagelada
Quiste
Polvo ambiental
Exquistamiento
Vía neuroepitelio olfatorio
Quiste
EAG
subaguda o crónica
Quistes en
verano
Queratitis
Neumonitis
Dispersión vía
sanguínea
Úlceras en la piel
MEAP
Dermatitis
E A G (huésped inmunocomprometido)
Quistes todo el año
↓
Formas flageladas
↓
Trofozoíto
45 °C
Suelo y agua
25-30 °C
Traumatismo en córnea
Trozofoito/quiste
Uso de lentes de contacto
Individuos sanos
y jóvenes
Natación o
inhalación
Soluciones contaminadas polvo-agua
Queratitis
Individuos
inmunocomprometidos
Pulmones
Neuroepitelio olfatorio
Cerebro EAG
Cerebro (MEAP)
Fuente: 3.
mayoría de los individuos mueren en la primera o segunda semana después de
la manifestación de los primeros síntomas, dependiendo del manejo y resistencia
del paciente, así como de la virulencia de las amibas.3
73 La ecología de las amibas patógenas
Agua destilada
Microbiología ambiental
74
El diagnóstico se realiza observando preparaciones de líquido cefalorraquídeo (LCR) en vivo o teñidas con Wright, Giemsa o Hematoxilina y Eosina.22
Sin embargo, uno de los principales problemas para identificar a las amibas es
que pueden confundirse con macrófagos, células epiteliales o pasar inadvertidas como simples partículas de sedimento del LCR. En las muestras clínicas,
el diagnóstico se confirma con el aislamiento de trofozoítos (nunca quistes, ni
flagelados) en agar no nutritivo (NNE) con bacterias.15 La MEAP es muy semejante
a la meningitis bacteriana y los resultados de laboratorio son muy similares, pero
los cultivos para bacterias son negativos. El único fármaco contra N. fowleri es
la Anfotericina B, pero solamente es efectivo cuando se administra al inicio de
la infección.3
Balamuthia mandrillaris y Acanthamoeba spp son organismos oportunistas
capaces de producir encefalitis amibiana granulomatosa (EAG) o acantamoebosis,
una enfermedad subaguda o crónica. Se presenta en individuos inmunosuprimidos
o inmunodeficientes, como alcohólicos crónicos, embarazadas, VIH positivos,
enfermos con SIDA, con lupus eritematoso sistémico o cáncer.3 También se han
descrito casos de EAG sin ninguna predisposición. La puerta de entrada al torrente
sanguíneo puede ser a través de los pulmones vía neuroepitelio olfativo y lesiones
de la piel. Las lesiones que produce Acanthamoeba son granulomatosas, encontrándose en ellas trofozoítos y quistes. Los datos clínicos comparados con los que
provoca Naegleria son menos intensos y de un curso más lento. Las principales
manifestaciones clínicas son dolor de cabeza, cambios de personalidad, fiebre leve,
convulsiones, hemiparesia, nivel deprimido de la conciencia y coma.
El cuadro clínico puede confundirse con tuberculosis cerebral, encefalitis
viral, cáncer y con un absceso cerebral. El diagnóstico clínico es difícil; de hecho,
la mayoría de los casos han sido diagnosticados post mortem. No obstante, es
posible realizar un diagnóstico rápido buscando trofozoítos en el LCR o trofozoítos y quistes del tejido cerebral. Acanthamoeba también puede cultivarse
en medio NNE con bacterias. En estudios in vitro el ketoconazol y clotrimazol
han mostrado cierta efectividad, aunque no se ha confirmado su efectividad en
humanos. En casos clínicos se han utilizado con cierto éxito itraconazol, miconazol, sulfametazina, pentamidina y gluconato de cloroexidina.2
Un cuadro muy similar al descrito para Acanthamoeba es producido por B.
mandrillaris. Sin embargo, no está claro si Balamuthia se comporta como organismo oportunista o si es un patógeno primario letal, que no depende del estado
del hospedero. La información al respecto es escasa y los cuadros observados se
han presentado principalmente en individuos inmunocompetentes. B. mandrillaris tiene requerimientos muy especiales para su cultivo. Crece en cultivos de
células Vero (riñón de mono verde africano) y en el medio axénico BM.3, 4, 19
Otra infección importante causada por Acanthamoeba spp. es la Queratitis
amebiana (QA). Esta es una inflamación crónica en la córnea que puede causar
75 La ecología de las amibas patógenas
la pérdida del ojo. Las amibas invaden el estroma corneal por una solución de
continuidad del epitelio, debido a un traumatismo menor o abrasión de la córnea.
Se caracteriza por severo dolor ocular asociado con fotofobia, generalmente unilateral, visión borrosa y congestión de la conjuntiva. Existe un anillo de infiltrado
estromal y lesión de la córnea. Los principales factores de riesgo son el uso de
lentes de contacto suaves, uso de soluciones salinas caseras, exposición a agua
contaminada y traumatismos menores del ojo.3, 23 Otros factores que favorecen
el establecimiento de la QA son la producción de lágrimas con baja actividad
microbiana y la contaminación bacteriana secundaria.3, 23
La QA se confunde frecuentemente con queratitis causada por hongos o por
Herpes simplex. Se puede realizar un diagnóstico rápido usando un raspado de
la córnea y tiñendo el material con Giemsa tricrómica, Wright, Hemacolor y
examinando con microscopía óptica de luz. También se puede usar la tinción
blanco de Calcofluor y anticuerpos fluorescentes en raspados y secciones de tejido
de la córnea.2 Acanthamoeba puede ser cultivada, colocando parte del raspado
corneal en medio NNE.23 El tratamiento no es sencillo debido a la resistencia de
estos organismos a la mayoría de los fármacos usados contra bacterias, hongos,
protozoos y virus. No obstante algunos pacientes han sido tratados con éxito
usando ketoconazol, miconazol, isotionato de propamidina y biguamida de
poliexametileno.3
El conocimiento de los mecanismos que utilizan las AVL patógenas para
evadir la respuesta inmune es muy escaso, no obstante, se sabe que en este
proceso participan las células fagocíticas, especialmente los glóbulos blancos,
la producción de enzimas que sintetizan células del sistema inmunológico
(linfocitos) y la producción de enzimas que destruyen las amibas.3, 21 Por otro
lado, se ha demostrado la presencia de anticuerpos en suero humano normal
contra Acanthamoeba y Naegleria. Adicionalmente, es posible que la exposición
a otro grupo de amibas genere alguna protección contra las AVL patógenas, ya
que se ha demostrado que existe reacción cruzada con antígenos de Entamoeba
histolytica.24
Prevención. Para evitar la naegleriosis se recomienda la educación al público, difundir el conocimiento entre la comunidad biomédica, la limpieza y la
cloración del agua de albercas (concentraciones de cloro libre residual de 1.0 a
2.0 mg L-1 de agua y a 26° C) y el mantenimiento adecuado de abastecimientos
públicos de agua. Para prevenir la QA se deben seguir las recomendaciones del
fabricante de lentes de contacto y no usarlos durante la práctica de deportes
acuáticos. En el caso de la EAG, es más difícil prevenirla debido a que Acanthamoeba es oportunista, por lo que la única recomendación es evitar los factores
de riesgo, especialmente si se sabe que se está inmunosuprimido o inmunocomprometido.
76
Microbiología ambiental
6. EPIDEMIOLOGÍA
Hasta la fecha, a nivel mundial, se tiene conocimiento de 196 casos de MEAP,
125 de EAG por Acanthamoeba, 93 de EAG por B. mandrillaris y más de 1,350
de QA.3, 25 Estas cifras seguramente están subestimadas, ya que en muchos países
la realización de autopsias es mínima o no se lleva a cabo y porque el médico
general y el personal de laboratorio no están entrenados para diferenciar una
meningoencefalitis viral o bacteriana de una infección por AVL.
Aunque las infecciones producidas por las AVL son consideradas raras,
se han registrado casos en diferentes partes. La mayoría procede de países
desarrollados como Australia, Estados Unidos de América y Gran Bretaña.3,
7
En México se han registrado en total 29 casos de MEAP: 23 en Mexicali, B.
C., tres en Sono-ra; uno en Monterrey, N. L., uno en Huetámo, Mich. y uno
en de Tamaulipas.
De 12 casos de EAG causados por B. mandrillaris, cuatro son del Distrito
Federal, cuatro de Jalisco, dos de Guanajauato, uno del Edo. de México y uno
de Puebla.25 Existe registro de un caso de EAG por Acanthamoeba spp., que sobrevivió.26 Otro de una infección cerebral mixta que involucró a Acanthamoeba
sp. y Aspergillus sp.27 y tres casos de QA por Acanthamoeba.23 Además, se han
detectado Naegleria, Acanthamoeba y Hartmannella en pacientes asintomáticos;
N. lovaniensis no patógena en un infante; en pacientes con quemaduras infectadas
y rinitis;13 Hartmannella asociada a un caso de meningoencefalitis28 y amibas
de la familia Leptomyxidae vinculada a un caso de anemia aplástica grave.29 El
impacto de las infecciones causadas por las AVL en la salud humana no debería
subestimarse, no solo por su potencial patógeno, sino también porque pueden
interactuar con especies bacterianas y por su capacidad para servir como vectores
para otros patógenos humanos.
7. CARACTERIZACIÓN DE LAS AMIBAS DE VIDA LIBRE
Cultivo monoxénico. Las muestras de agua o LCR colectadas se centrifugan a
2,500 rpm durante 10 min. El concentrado se distribuye en medio NNE.15 La
observación de las placas de NNE se realiza en un microscopio invertido a 10x
y 20x para verificar el crecimiento amibiano. En las placas con amibas se marca
la zona de mayor abundancia y se corta un trozo de agar de aproximadamente
un cm2, y se transfiere a otra placa con medio NNE fresco y se incuba a la temperatura a la cual fue aislada durante 48 horas.
Cultivo axénico. De los cultivos monoxénicos se selecciona una zona con
crecimiento amibiano en estado de trofozoíto y se transfieren trozos de agar a
los medios PBSGM30 y BC5 y se incuban a 30 º C.
77 La ecología de las amibas patógenas
Después de obtener cultivos axénicos, se realiza la identificación morfológica, la prueba de patogenicidad en ratones, análisis de isoenzimas30 y/o técnicas
inmunológicas.22
Identificación morfológica. Se realizan preparaciones in vivo de cultivos axénicos de los trofozoítos y quistes en diferentes fases de maduración y usando las
claves taxonómicas de Pussard y Pons31 y Page.15
Tolerancia a la temperatura. Esta prueba se realiza para determinar la temperatura máxima y óptima de las amibas, ya que se ha demostrado que las AVL
patógenas son termotolerantes. Los aislamientos se siembran por cuadriplicado
en medio axénico o monoxénico y se incuban a temperatura ambiente, 37 °C,
42 °C y 45 °C. Se observan durante una semana para verificar la temperatura
óptima de crecimiento.
Prueba de patogenicidad. La prueba se lleva a cabo por vía intracerebral (IC) y
por instilación nasal (IN) en grupos de ratones machos, de tres semanas de edad
a partir de cultivos axénicos.32 Los trofozoítos en crecimiento exponencial, se
ajustan a una cuenta de 1x104 – 1x106 por ml. De este concentrado se inoculan
0.02 ml a través de la articulación interparietal. Para la IN, se aplica la misma
dosis a través de los orificios nasales y como control, se inocula un grupo de
ratones con medio de cultivo sin amibas. Y se mantienen bajo observación 21
días. A los animales que mueren durante dicho período, se les extrae el cerebro,
el hígado, los pulmones y los riñones, y se colocan en placas con medio NNE
y para incubarlos 30º C durante 24 - 48 h. Los animales que sobreviven los 21
días y el grupo control se sacrifican y se sigue el mismo procedimiento que los
anteriores.
Técnicas inmunológicas. Las pruebas serológicas no han sido útiles en el
diagnóstico de N. fowleri, debido a que la mayoría de los pacientes mueren demasiado rápido para producir anticuerpos y las infecciones por Acanthamoeba
generalmente se han diagnosticado post mortem usando técnicas de inmunofluorescencia indirecta y de inmunoperoxidasa.22
Análisis de isoenzimas y proteínas totales. Para realizar este análisis se usa la
técnica de isoelectroenfoque (IEF), que consiste en la separación de los componentes de una enzima, presentes en el extracto crudo de cada amiba, sobre un
sustrato de agarosa con un anfolito. El análisis se lleva a cabo por comparación
de los zimogramas de las amibas a identificar contra cepas de referencia.33
Identificación por el ADN. En los últimos años se han desarrollado diferentes
métodos moleculares como la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa
o PCR (por sus siglas en inglés). Ésta es una herramienta muy útil, rápida y precisa, siempre y cuando se haya descrito previamente la secuencia específica del
organismo a determinar. En el caso de las AVL, se ha utilizado principalmente
para identificar amibas patógenas de muestras clínicas y muy pocos trabajos se
han enfocado a muestras ambientales.34, 35 En el caso de agua, recientemente se ha
implementado la técnica de PCR para identificar Acanthamoeba en este ambiente.36
Las muestras de agua se filtran con una membrana Millipore. La membrana se
coloca en un tubo estéril y se adiciona solución SET (sacarosa EDTA), se resuspende,
se retira la membrana y se congela la suspensión a -20° C, hasta que se realiza la
extracción del ADN mediante los métodos descritos por Vodkin et al.34, 35, 37
78
Microbiología ambiental
8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El interés en las AVL se ha incrementado en los últimos años, sin embargo, la
mayor parte de los estudios se han enfocado principalmente al grupo de las especies patógenas para el hombre. El estudio de las AVL (patógenas y no patógenas)
desde el punto de vista ecológico es sumamente escaso, ya que aunque se conoce
de manera general su distribución en el ambiente y las condiciones ambientales
que las pueden afectar, es necesario realizar más estudios para identificar aspectos
detallados de su relación con los factores bióticos y abióticos en el ambiente.
La carencia de formas fijas en su morfología causa confusión en el estudio
de estos protozoos, por lo que se ha recurrido al uso de técnicas y herramientas
específicas como la microscopía electrónica y de barrido, así como de técnicas
inmunoenzimáticas, entre otras.
La aplicación de técnicas de biología molecular en el estudio de las AVL ha
permitido identificar nuevas especies relacionadas con los géneros Naegleria y
Acanthamoeba, así como identificar nuevas especies patógenas para el ser humano. Las preguntas que surgen a este respecto son ¿las nuevas amibas detectadas
son nuevas especies o solo variedades?, ¿cuál va a ser el límite para determinar
si cada amiba aislada es una nueva especie?
En el aspecto epidemiológico hay todavía preguntas que resolver: por ejemplo,
¿por qué a pesar de la amplia distribución de estas amibas en el ambiente y su constante contacto con los seres humanos, el número de casos es relativamente bajo, si se
compara con otros organismos patógenos? y ¿el contacto con amibas no patógenas
o con amibas de baja virulencia confieren a los humanos cierta inmunidad?
Otro problema importante que se tiene que resolver es la carencia de fármacos
eficientes para tratar las infecciones producidas por este grupo de amibas, especialmente en el caso de la EAG, causada por algunas especies de Acanthamoeba
y la especie Balamuthia mandrillaris.
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82
Microbiología ambiental
CIANOBACTERIAS, MICROORGANISMOS
DEL FITOPLANCTON Y SU RELACIÓN
CON LA SALUD HUMANA
1. INTRODUCCIÓN
Muchos cuerpos de agua experimentan actualmente la denominada eu-
tro-fización antrópica (como resultado de la actividad humana) por el aumento
poblacional la urbanización, la agricultura, la minería y el aporte de aguas
residuales y desechos de la industria alimentaria. Uno de los fenómenos más
frecuentes en los lagos y reservorios eutróficos es la presencia en muchas partes
del mundo, de cambios evidentes relacionados con el aspecto y la calidad del
agua. Tales alteraciones están asociadas principalmente con una alta concentración de nutrimentos, como el fósforo y el nitrógeno.
Los microorganismos fotosintéticos que pueblan todas las aguas del planeta y que son el inicio de la cadena alimentaria se conocen como fitoplancton.
Entre los más antiguos identificados en estos ambientes se encuentran las
cianobacterias que forman grandes colonias, principalmente en cuerpos
de agua con altos niveles tróficos. Las cianobacterias son consideradas una
liga entre los procariotes y los eucariotes fotosintéticos con la capacidad
de sintetizar clorofila. Como característica particular se ha identificado
su habilidad para sintetizar los pigmentos ficobilina y ficocianina, que en
altas concentraciones, les confiere el color característico que ha dado lugar
a la denominación de algas azul-verde o cianobacterias. Estos organismos
tienen una larga historia evolutiva, por lo que la mayoría de geólogos y
geoquímicos están de acuerdo en que su origen se extiende 3,500 millones
de años en la era Proterozoica (2,500 a 570 mA), conocida también como
era de las cianobacterias.1
Las cianobacterias se aprecian a simple vista como manchas incrustadas
sobre la superficie húmeda de las rocas, del suelo o de los árboles; pueden ser
de color verde azuladas, pardas o negras y presentarse en forma de almohadillas
macroscópicas o en capas viscosas. También pueden vivir flotando libremente
[83]
83 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
Pedro Ramírez, Evaristo Martínez ,
María Dolores Martínez y Carlos Eslava
Microbiología ambiental
84
(planctónicas) en cualquier tipo de medio acuático.2 Son organismos móviles,
Gram-negativos,3 cuya velocidad y dirección de movimiento dependen de
la iluminación y de la temperatura en la que se encuentren. A pesar de que
presentan características de una bacteria Gram-negativa, poseen una capa de
peptidoglucanos más gruesa y componentes no comunes en dicho grupo.4
Las cianobacterias muestran una amplia diversidad morfológica, ya
que pueden, ser unicelulares (Chroococcus) o filamentosas; éstas últimas, en
ocasiones presentan ramificaciones (Anabaena). Pueden aparecer aisladas o
agrupadas en colonias (Schizothrix) y cuando las colonias se agrupan pueden
observarse como manchas o puntos cafés en las rocas sumergidas (C. fuscus).
La estructura colonial se mantiene por un exo-polisacárido que se aprecia
como un mucílago o una vaina firme. Otra de las estructuras presentes en
las cianobacterias son las vacuolas de gas que les ayudan a la flotación y que
se encuentran en especies de muy diferentes géneros (Anabaena). Todas las
especies que forman filamentos verdaderos presentan hormogonias, definidas
en 1959 por Desikachary,5 como cadenas cortas y móviles. Sin embargo, no
todas las hormogonias caen exactamente dentro de esta definición; esencialmente son filamentos modificados relacionados con la reproducción y la
dispersión del microorganismo, con altos niveles de nitrógeno, fósforo y otros
nutrimentos. Las colonias de algunos géneros (Rivularia) están constituidas
por la agregación de numerosas hormogonias, mientras que otras (Nostoc) se
originan de una hormogonia simple.
Las interacciones simbióticas entre las cianobacterias y otros organismos
son diversas. Muchas cianobacterias simbiontes comparten características que
incluyen la formación de hormogonias, que a menudo actúan como agente
infectivo. Algunas plantas producen señales químicas que inducen a la cianobacteria a formar hormogonias o como quimio-atrayente para guiar a la hormogonia al interior de la planta. Un gran número de cianobacterias, capaces de
fijar nitrógeno atmosférico cuando el ambiente está muy oxigenado, presentan
heterocistos,6 células con una pared celular delgada y generalmente con un nódulo de cianoficina, polímero de dos aminoácidos situados en uno o en ambos
lados de la célula. La presencia o ausencia de heterocistos es una característica
importante para diferenciar entre géneros.
Cuando los lagos se tornan eutróficos, la diversidad del fitoplancton disminuye, lo que conduce a que las prevalezcan cianobacterias. Diferentes factores
ambientales favorecen el predominio de estas últmas, las temperaturas elevadas
(18 y 20 ºC), las condiciones de luz-energía (óptimas de la primavera al otoño),
la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, un pH alto (6.5 a 8.5), una baja tasa
de filtración por el zooplancton y la formación de vesículas de gas.7 Aunque la
diversidad y abundancia de las cianobacterias son mayores a valores altos de pH
existen excepciones al respecto, tal es el caso de las picocianobacterias planctó-
Figura 2. Anabena sp. UTCC-426
Foto: Mary Olaveson.
Foto: Dr. Bill Buikema, Universidad de
Chicago, EE.UU.
nicas (< 2 µm de diámetro) y las cianobacterias filamentosas ramificadas que
se desarrollan a pH por debajo de 4.5 y 4, respectivamente.
El florecimiento se describe como el incremento, significativamente mayor
al promedio, en la biomasa del fitoplancton. El florecimiento de las poblaciones de cianobacterias se ha estudiado ampliamente ya que representa un
problema para los cuerpos de agua de uso doméstico, industrial y de recreo,
debido principalmente al incremento en la producción de metabolitos tóxicos,
los cuales tienen un efecto letal sobre los diversos organismos habitantes de
dichos cuerpos.8 El que estos florecimientos generen sustancias tóxicas plantea su importancia como un problema ambiental con repercusiones sobre la
salud. A pesar de que se ha generado una gran cantidad de información sobre
las toxinas producidas por cianobacterias, no es fácil predecir su toxicidad
durante cada florecimiento particular; sin embargo, su detección oportuna
permite minimizar su efecto.9 Los florecimientos pueden ser superficiales
(“florecimientos de agua”) y están restringidos a aquellos organismos que
pueden flotar o que presentan movilidad.10 Algunas especies que no pertenecen
a las cianobacterias, como Botryococcus braunii, también pueden dar lugar a
florecimientos debido a la producción o almacenamiento de aceites, así como
algunos flagelados como Euglena. Los florecimientos generalmente están relacionados con una o dos especies y se identifican por el tipo de fitoplancton
85 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
Figura 1. Filamentos de Anabaena
sp. modificadas genéticamente
para que los heterocitos expresen una proteína fluorescente
86
Microbiología ambiental
Figura 3. Aspecto que presentan los florecimientos (blooms)
de cianobacterias en los cuerpos de agua eutrofizados
dominante. De esta manera se tienen florecimientos de cianobac-terias, de
diatomeas o de Anabaena.
Las toxinas pueden ser dañinas dependiendo de su concentración y su
capacidad para originar efectos agudos y crónicos en el hombre, en animales
y en vegetales. Skulberg et al.11 describen cerca de 40 especies toxigénicas de
cianobacterias basándose en una taxonomía morfológica. La mayoría de las
especies y cepas toxigénicas pertenecen a géneros filamentosos multicelulares:
Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Aphanizomenon y Cylindrospermopsi.12, 13
Otras especies producen compuestos citotóxicos que aunque no son tóxicos
para mamíferos, sí lo son para aves y peces, algas, bacterias y virus o bien tienen
un efecto sobre las células tumorales de mamíferos, lo que ha permitido su empleo
como antibióticos o anticarcinógenos. De las especies de cianobacterias unicelulares
Microcystis causa la mayoría de los problemas de toxicidad, probablemente por ser
la más cosmopolita de las cianobacterias. Esto es particularmente evidente durante
el verano cuando Microcystis domina la sucesión anual de cianobacterias.
Se considera que existe un florecimiento en el agua para uso potable o recreativo, cuando las concentraciones celulares calculadas están en niveles de
Microfotografías de Luc Brient, Rennes, Francia
Microcystis wesenbergii
Correo-e de Luc de Brient: [email protected].
20,000 células ml-1, lo que corresponde a 10mg m-3 de clorofila-a. La aparición
de este fenómeno depende tanto de las condiciones ambientales como de los
requerimientos específicos del organismo.14,15 Los florecimientos de cianobacterias tienen un registro histórico reciente,10 y han adquirido importancia por
su impacto económico. La preocupación por los efectos de las cianobacterias
en aguas continentales, principalmente por repercusión sobre la calidad de la
misma, se intensificó en las décadas de 1980 y 1990 debido a la información
acumulada sobre la potencia de sus toxinas.16, 17, 18, 19, 20 Desde hace tiempo se
tiene conocimiento de la presencia de toxinas cianobacterianas, pero éstas sólo
se habían asociado con la muerte de animales domésticos.21 Recientemente, en
Brasil la muerte de 88 personas y el daño renal en 50 pacientes que requirieron
hemodiálisis, se asoció con la presencia de cianotoxinas en el agua de consumo.22,
23
Lo anterior apoya el efecto dañino de estas toxinas y plantea la necesidad de
reevaluar si su presencia en las fuentes de abastecimiento de agua para consumo
humano constituye un peligro para la salud, y si además son un factor de riesgo
para animales silvestres y/o domésticos que puedan estar en contacto con este
tipo de aguas.24 Aunque no todos los florecimientos de cianobacterias son tóxicos, cuando estos se relacionan con la producción de toxinas su repercusión es
alarmante, como se ha reportado en diferentes países (cuadro 1).
87 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
Anabaena sp.
Cuadro 1. Porcentaje de toxicidad por florecimientos
de cianobacterias en diferentes países
País
Inglaterra
Escandinavia
Finlandia
Mar Báltico
88
Microbiología ambiental
EE.UU.
Países Bajos
Países Bajos
Hungría
Alemania (Ex RDA)
Alemania 1995-96
Dinamarca
Número
de sitios
78
51
188
25
102
10
29
35
6
80
96
Toxicidad
70%
59%
44%
72%
27%
90%
79%
82%
67%
90%
72%
Referencia
Reporte NRA 1990
Cood y cols. 1989
Sivoen y cols. 1990
Sivoen y cols. 1989 Wisconsin,
Rapavich y cols. 1990
Leeuwang y cols. 1983
RIZA 1994
Törökné-Kozma y Gábor 1988
Henning y Khol 1981
Fastner y cols. 1998
Henriksen 1997
Fuente: 25.
2. FACTORES INVOLUCRADOS EN LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS POR
CIANOBACTERIAS DURANTE LOS FLORECIMIENTOS
En las últimas décadas se ha presentado un incremento aparente en la
ocurrencia de florecimientos de cianobacterias, lo que aunado a la posible
presencia de cepas productoras de toxinas, ha dado lugar a que se estudien
los posibles factores ambientales que favorecen la presencia y el incremento
de las cianobacterias. Aunque éstas generalmente son comunes en los diferentes sistemas acuáticos, presentan diferencias en la densidad de células,
composición de especies, distribución vertical y longevidad de la población,
dependiendo del tipo de sistema. Lo anterior se puede explicar por el grado
de estratificación y mezclado, así como por la disponibilidad de nutrimentos
y de luz que prevalecen en cada sitio, características determinadas por las
condiciones climáticas de cada región.
El tamaño y profundidad de las cuencas lacustres se han modificado en
tamaño y profundidad durante miles de años, como resultado de eventos climáticos y geológicos y por los mismos procesos biológicos. El “envejecimiento”
o eutrofización es el resultado del incremento en los nutrimentos y la actividad
biológica (productividad), así como de la acumulación de sedimentos y materia
89 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
orgánica que arrastran las corrientes de agua que llenan la cuenca de un lago. La
progresión natural en los lagos es unidireccional y va de la oligotrofia (pobreza
en nutrimentos) a la eutrofia (riqueza en nutrimentos y por lo tanto alta productividad). La eutrofización cultural (producida por la actividad humana) se
ha convertido en un factor significativo en el envejecimiento de los cuerpos de
agua en el mundo. El término hipereutrófico surge como resultado del efecto de
las actividades humanas sobre los cuerpos de agua.26 La información obtenida
de diversas áreas geográficas muestra que la eutrofización cultural, tanto en
aguas continentales como marinas, es originada por las descargas domésticas,
industriales y aguas de retorno agrícola.
Las algas y las macrofitas se utilizan frecuentemente como indicadores de
la eutrofización de los cuerpos de agua. Se llevan a cabo análisis cualitativos y
cuantitativos así como medición de su biomasa mediante la determinación de
la concentración de la clorofila, cuyos valores se han estimado de acuerdo con
las condiciones tróficas de un cuerpo de agua, por lo que se considera que en un
lago oligotrófico van de 1.5 a 10.5 µg L-1 mientras en un lago eutrófico pueden
llegar hasta 300 µg L-1.27
El incremento en la biomasa, además de ocasionar problemas estéticos como
la presencia de espumas y olores desagradables, también altera el sabor del
agua potabilizada para el suministro humano. El proceso de descomposición
de los florecimientos acuáticos causa desoxigenación alterando la química del
agua, cambios que influyen en la supervivencia de los animales acuáticos. La
producción de metabolitos secundarios bioactivos, como las hepatotoxinas y las
neurotoxinas, representan un riesgo para la salud humana.28
Las toxinas son péptidos cíclicos que incluyen potentes alcaloides neurotóxicos (que se dividen en dos grandes grupos: anatoxina y saxitoxina) y
hepatotóxicos (microcistinas, nodularinas y cilindrospermopsina). Las microcistinas son producidas tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena,
Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Microcystis). Los géneros
Anabaena y Oscillatoria producen anatoxina, que actúa como un bloqueador
neuromuscular. También producen dos tipos de anatoxina: anatoxina-a y anatoxina-a(s), que no están estructuralmente relacionadas y presentan diferentes
efectos fisiológicos, la segunda de éstas es un compuesto organofosforado producido por el género Anabaena, el único que se conoce en estado natural. La
estructura química de este compuesto es similar a la que tienen los insecticidas
sintéticos como el paratión-malatión, y al igual que éste, bloquea la actividad
de la acetilcolinesterasa.17
3. COMPORTAMIENTO DE Microcystis PRODUCTORA DE MICROCIS-
90
Microbiología ambiental
TINA EN EL AMBIENTE
Microcystis se encuentra comúnmente en cuerpos de agua eutróficos e hipereutróficos y puede constituir el fitoplancton dominante; a menudo, dependiendo de las condiciones climáticas, puede estar presente durante todo el
año. La microcistina se identificó inicialmente en el género Microcystis y a
la fecha se han descrito aproximadamente 50 tipos de esta toxina relacionados en su mayoría con casos de envenenamiento humano y animal. Aunque
Microcystis únicamente produce microcistina, ésta siempre es toxigénica, a
diferencia de otras cianobacterias planctónicas que pueden producir tanto
microcistina como anatoxina, como en el caso de Anabaena y Oscillatoria
o microcistina y citotoxina producidas por Hapalosiphon. Rinehart et al. 29
refieren la existencia de al menos 47 variedades de microcistinas, 32 se identificaron en florecimientos de Microcystis en agua y en algunos aislados de
laboratorio. Con respecto a las otras microcistinas, ocho se identificaron en
Anabaena, seis en Nostoc y una en Oscillatoria. A excepción de la microcistina-HtyR, las microcistinas producidas por géneros diferentes a Microcystis
contienen modificaciones en los aminoácidos dos y cuatro, sitio donde se
encontraron la mayoría de los cambios. La toxicidad de las microcistinas se
ha evaluado mediante bioensayos en modelos animales y por una prueba de
inhibición de la actividad de la fosfatasa 1 o 2A. La dosis letal media (LD50)
de la microcistina administrada por vía intraperitoneal en ratones es de 50
a 100 µg kg-1.30
4. EFECTO DE LAS MICROCISTINAS SOBRE LA SALUD ANIMAL
Aunque la mayoría de los envenenamientos por microcistinas se presentan
en animales terrestres después de ingerir agua de suministros infestados con
cianobacterias, los animales marinos, y particularmente los peces en cultivo,
también pueden verse afectados.31 La muerte por microcistinas se presenta
como consecuencia de un shock hipovolémico secundario o hemorragia del
hígado. El estudio post mortem muestra incremento en el peso del hígado y en la
concentración de hemoglobina hepática y de hierro. En los animales que no mueren
rápidamente se observa hipercalemia y/o hipoglucemia, insuficiencia hepática y
la muerte en pocos días.
En el envenenamiento por microcistina, uno de los primeros efectos (15
a 30 minutos.) es la elevación en la concentración de ácidos biliares, fostafasa
alcalina, gama-glutamil-transferasa y la aspartato amino-transferasa. La cuen-
ta de glóbulos blancos se incrementa (leucocitosis), se activan factores que
promueven la formación de coágulos y puede presentarse diarrea acuosa y/o
con sangre. La muerte puede darse en un lapso de algunas horas (4 a 24 h) o
días, dependiendo del individuo afectado y generalmente es precedida por una
respuesta neuro-muscular.
La información con respecto al daño en humanos ocasionado por microcistinas
es escasa. 32,33 Las principales fuentes de exposición son lagos y ríos durante su
uso recreativo (ruta oral o dérmica) y el consumo de agua potable y tabletas alimenticias de concentrados de algas (ruta oral). Una ruta de exposición de menor
importancia la constituyen las regaderas durante el baño (inhalación). En países
como Estados Unidos y Canadá el periodo de exposición durante el año es menor
ya que el crecimiento de los florecimientos de algas son más cortos (3 a 5 meses),
comparado con el de países con climas cálidos como Australia o Sudáfrica (6
a 10 meses). Los síntomas observados en las personas que sufren intoxicación
por microcistinas incluyen irritación de piel y ojos, síntomas parecidos a los
producidos por la fiebre del heno, disnea, fatiga y gastroenteritis aguda.
La toxicidad letal en humanos no se presenta con mucha frecuencia, principalmente porque los diferentes procesos de tratamiento en los suministros de
agua contribuyen a disminuir el número de cianobacterias tóxicas y por ende
la concentración de toxinas. Sin embargo, en ocasiones los florecimientos presentan niveles de microcistina mayores a 1 mg g-1 de células, lo que muestra el
efecto que pueden llegar a tener las cianobacterias en la salud del ser humano y
de otros animales. Reportes en Estados Unidos y Australia señalan la presencia
de casos al ingerir agua proveniente del suministro municipal. Esto se produjo
al pretender eliminar con sulfato de cobre las células durante un florecimiento,
lo que suscitó la liberación de altos niveles de toxinas hacia el sistema de distribución, ocasionando la intoxicación de varios individuos. Solo en casos como
el antes referido se podría alcanzar una dosis letal para los humanos. En estos
y otros casos de ingestión accidental los síntomas reportados incluyen dolor
abdominal, náusea, vómito, diarrea, dolor faríngeo, tos seca, dolor de cabeza,
úlceras en la boca, neumonía atípica y elevación de las enzimas hepáticas en el
suero (especialmente en la gama-glutamil transferasa).
Otro aspecto importante en relación con las cianotoxinas es el efecto
cancerígeno de las microcistinas y nodularinas debido al efecto de inhibición de las proteín-fosfatasas. Este factor adicional de riesgo (promoción de
tumores), se ha determinado mediante las observaciones hechas en animales
expuestos y a datos toxicológicos y químicos. Aunque no han sido determi-
91 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
5. EFECTOS EN LA SALUD HUMANA
nados los niveles de toxinas que ocasionen efectos adversos, algunos países
han propuesto concentraciones que pueden considerarse como aceptables,
para evitar riesgos a la salud.
En 1994, Falconer et al.34 utilizaron diferentes procedimientos para establecer
que 1.0 µg l-1 es la concentración máxima de microcistina o nodularina aceptable
para prevenir la inducción de tumores. Dicha concentración de toxina corresponde a 5,000 células de Mycrocistis ml-1, determinada en experimentos con
cerdos. Un estudio similar en Canadá reportó 0.5 µg L-1 para microcistina-LR
(la más común de las microcistinas encontradas en suministros de agua), o 1
µg l-1 del total de microcistinas en agua potable. Este valor es el que actualmente
considera la Organización Mundial de la Salud (OMS) como valor guía a nivel
internacional.35
92
Microbiología ambiental
6. ESTRUCTURA QUÍMICA Y CARACTERÍSTICAS
Bishop et al.36 realizaron el primer reporte de una hepatotoxina de la cepa
NRC-1 de Microcystis aeruginosa identificada como un péptido. Esta toxina fue
denominada microcistina por Konst et al.37 y Carmichael et al.38 Posteriormente
se realizaron otros aislamientos de microcistinas a partir de la misma cepa,39,
40
y de florecimientos de M. aeruginosa en Sudáfrica41 y en Australia.42 Botes et
al.43 aislaron varias microcistinas de cepas de M. aeruginosa en Sudáfrica y fueron los primeros en determinar la estructura de una de ellas (denominada cómo
cianoginosina) en 1984; al siguiente año el mismo grupo publicó la estructura de
las demás toxinas (figura 1).
Una vez que se determinó la estructura básica, aparecieron rápidamente
muchos reportes de microcistinas, a la fecha se han aislado más de 50 microcistinas (cuadro 2).
7. RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y TOXICIDAD
La relación entre las modificaciones estructurales y la hepatotoxicidad de
las microcistinas se estableció por observaciones en diferentes investigaciones.43,47,48,49 en las cuales se encontró que existen modificaciones en diferentes
sitios de la molécula de microcistina (cuadro 3), como es el caso de dos L-aminoácidos variables; grupos Metil en Mdha y/o β-Me-Asp; Adda; Glu y Mdha.
8. ESTABILIDAD
Figura 1. Estructura de cinco microcistinas
Esterificado
^
OCH3
H
10
8
9
15
Adda
H
^
6
7
HN
11
H3C
1
O
H
2
H
4 3
NH
5
H
H
R2
Mdha
CH2
^
O
O
NH
H R3
^
O
CH2 o H
H
N
H3C
H
R1
Hidratado
(Ser)
Ala
O
H CO2H
β-Me-Asp (Iso)
Fuente: 44.
Figura 2. Toxina de cianobacteria (Microcystis),
Fosfatasa-1/-2A Inhibidor, NMR Molécula: Microcistina-LR
Fuente: 46.
93 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
18
N
Isómeros
geométricos
OH2 OAc
R4
CO2H
H
CO3 o H
^
Glu (Iso)
^
94
Microbiología ambiental
Cuadro 2. Variaciones estructurales de microcistinas
aisladas y sus pesos moleculares
Microcistina LA
Microcistina LR
Microcistina YR
Microcistina RR
Microcistina YM
Microcistina YA
Microcistina LY
Microcistina FR
Microcistina Laba
Microcistina HtyR
Microcistina AR
Microcistina M(O)R
Microcistina WR
3-desmetilmicrocistina LR
7-desmetilmicrocistina LR
3,7-didesmetilmicrocistina LR
3-desmetilmicrocistina YR
7-desmetilmicrocistina YR
3-desmetilmicrocistina RR
7-desmetilmicrocistina RR
3,7-didesmetilmicrocistina RR
3-desmetilmicrocistina HtyR
7-desmetilmicrocistina HtyR
3,7-didesmetilmicrocistina HtyR
7-desmetilmicrocistina HphR
(Mser7)microcistina LR
(Ser7)microcistina LR
(Ser7)microcistina RR
(Ser7)microcistina HtyR
[Ser7)3-desmethytmicrocistina XR
(DMAdda) microcistina LR
(ADMAdda) microcistina LR
(ADMAdda)3desmetilmicrocistina LR
(ADMAdda) microcistina LHar
(ADMAdda,Mser7) microcistina LR
D-Glu(CH30)estermicrocistina LR
D-Glu(CH3O)ester 3desmetilmicrocistina LR
R1
R2
R3
R4
Leu
Leu
Tir
Arg
Tir
Tir
Leu
Fe
Leu
Hty
Ala
Met(O)
Tir
Leu
Leu
Leu
Tir
Tir
Arg
Arg
Arg
Hty
Hty
Hty
Hph
Leu
Leu
Arg
Hty
X
Leu
Leu
R5
PM
Ala
Arg
Arg
Arg
Met
Ala
Tir
Arg
Aba
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
CH3
H
H
CH3
H
CH3
H
H
CH3
H
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
H
CH3
H
CH3
H
H
CH3
H
H
H
CH3
H
H
H
H
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
COCH3
909
994
1044
1037
1019
959
1001
1028
923
1058
953
1028
1067
980
980
966
1030
1030
1023
1023
1009
1044
1044
1030
1028
1012
998
1041
1062
998
980
1022
Leu
Leu
Leu
Leu
Arg
Har
Arg
Arg
H
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
COCH3
COCH3
COCH3
CH3
1008
1036
1040
1008
Leu
Arg
H
CH3
CH3
994
(Continúa)
Cuadro 2. Variaciones estructurales de microcistinas
aisladas y sus pesos moleculares
R1
R2
D-Glu(C3H7O2)ester microcistina LR Leu
Toxin#3
(D-Ser1,ADMAdda) microcistina LR Leu
R3
R4
R5
PM
Arg
CH3
CH3
CH3
Arg
CH3
CH3
COCH3
1052
1014
1038
Cuadro 3. Relación entre la estructura y hepatotoxicidad
de microcistinas
LD50
(µg kg-1 intraperitoneal
en ratón)
L-aminoácidos (R1, R2)
Microcistina-LR, microcistina-YR, microcistina-LA
Microcistina-WR
Microcistina-RR, microcistina-M(O)R
<100
100-400
400-800
Grupos metil en Mdha y/o -Me-Asp
3-desmetilmicrocistina-LR (-RR)
7-desmetilmicrocistina-LR (-RR)
3, 7-didesmetilmicrocistina-LR
100-400
100-400
100-400
Adda
O-demetil-Adda-microcistina-LR
O-acetil-O-demetil-Adda-microcistina-LR
6(Z)-Adda microcistina-LR (RR)
<100
<100
>800
Ester
D-Glu(C3H7O) ester microcistina-LR
D-Glu (CH3O) ester microcistina-LR
>800
>800
Mdha
Dihidromicrocistina-LR
microcistina-LR-GSH
Fuente: 45.
100-400
400-800
95 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
Fuente: 45.
•
•
•
•
•
Dilución
Adsorción
Descomposición térmica con ayuda del pH
Fotolisis
Degradación biológica
9. REMOCIÓN DE CIANOTOXINAS MEDIANTE LOS PROCESOS DE
TRATAMIENTO DE AGUAS
96
Microbiología ambiental
Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos muy estables y resistentes a la hidrólisis enzimática, y su vida media es de alrededor de tres semanas en solución
a pH 1 y 40 °C. Para degradarlas completamente se requiere un tratamiento a
reflujo con ácido 6N-hidroxiclórico y ácido trifluroacético. Sin embargo, en
mediciones en campo se encontró que la degradación primaria de la microcistina-LR ocurrió en una semana.50
Experimentos realizados en laboratorio para determinar la velocidad de degradación tanto de nodularina como microcistinas, mostraron que la primera era
más resistente a la degradación.51 Para evaluar las implicaciones que tienen las
microcistinas sobre la salud es necesario realizar estudios de campo. Para establecer la pérdida de toxicidad de estos metabolitos se deben tomar en cuenta
los siguientes factores:
Los procesos que se combinan para eliminar las microcistinas de aguas contaminadas son: coagulación-filtración, oxidación con cloro y ozono y, por último, la
adsorción con carbón activado (cuadro 4). Aunque previamente se había demostrado que la cloración era ineficiente para eliminar las toxinas provenientes de las
algas,52,53,54 estudios más recientes señalan que las microcistinas y las nodularinas
son destruidas rápidamente con una solución de cloro e hipoclorito de calcio
y con menor efectividad con hipoclorito de sodio. El cloro y el hipoclorito de
calcio en una concentración de 1 mg L-1 eliminaron cerca del 95% de las toxinas
en 30 minutos. Por otro lado el hipoclorito de sodio a la misma concentración
solo quitó el 40% y con 5 mg L-1 o más, del 70% al 80%.55 El ozono es uno de los
oxidantes más poderosos que se conocen y se ha utilizado efectivamente para la
desinfección y oxidación de una amplia gama de compuestos en el tratamiento
del agua. Keijola et al.53 mostraron que la pre-ozonización a 1 mg l-1 fue suficiente
para eliminar completamente la toxicidad causada tanto por las hepatotoxinas
como por la anatoxina-a. Himberg et al.54 observaron posteriormente que la
eficiencia de eliminación dependía de la concentración de ozono.
Filtro de arena
Al2 (SO4)3-floculación más filtros de arena (+Cl2)
Ca (OCl)2-5 mg1-1, 30 min.
pH 8.5,
NAOCl-0.5 mg L-1, 20 min, pH5.5-6.6
(+floculación +filtro de arena)
Cl2, Ca (OCl)2-1 mg L-1,
30 min.
Filtración
Cloración
Cloraminación 20 mg l-1, 5d
Cruda
HPLC,
Bioensayo en ratón
HPLC,
Bioensayo
en ratón
Cruda
Cruda
Bioensayo
en ratón
HPLC
HPLC
Bioensayo
en ratón
Detección
Cruda
Cruda
Cruda
Toxina
97 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
NaOCl-5mg·1–1, 30 min.
>0.5 mg l-1 (después de la reacción), <pH8
FeCl3-floculación
Condición del tratamiento (agente, concentración, tiempo de contacto)
Floculación
Proceso de
tratamiento
17%
70-80%
>95%
>95%
11-18%
x
x
11-18%
x
(Continúa)
Nicholson et al. 1994
Keijola et al. 1988
Himberg et al. 1989
Nicholson et al. 1994
Hoffman 1976
Keijola et al. 1988
Himberg et al. 1989
Hoffman 1976
Resultado
Referencias
(% de eliminación)
Cuadro 4. Remoción de microcistinas por diferentes procesos
de tratamiento de agua
PAC*200 mg L-1
GAC**3.7x13 cm
PAC 100 mg L-1
GAG 70 x 7 – 8 cm
PAC 5 mg L-1 (+floculación+filtro de arena +Cl2)
GAC3 x12 cm (+floculación+filtro de arena +Cl2)
PAC (lana), 25 mg L-1 30 min.
Adsorción
con carbón
activado
Bioensayo en ratón
Bioensayo en ratón
HPLC
HPLC
Extracto
Cruda
LR
HPLC
LR
Detección
Cruda
HPLC
Cruda
Toxina
(O)
(O)
>90%
>90%
20-34%
100%
98%
99%
100%
Keijola, et al. 1988 Himberg
et al. 1989
Drikas et
al. 1994
Falconer et al. 1989
Hoffmann 1976
Keijola et al. 1988
Himberg et al.1989
Drikas et al. 1994
Resultado
Referencias
(% de eliminación)
* Polvo de carbón activado ** Carbón activado granular.
HPLC: Cromatografía de líquidos a alta presión, por sus siglas en inglés HPLC (High Performance Liquid Chromatographic)
LR: Leucina-Arginina, aminoácidos que participan en la estructura de la Microcistina-LR.
Fuente: 45.
1 mg L-1 30 min.
(+ floculación + filtro de arena + Cl2)
0.1 mg L-1 15 s
Condición del tratamiento (agente, concentración, tiempo de contacto)
Ozonización
Proceso de
tratamiento
Microbiología ambiental
Cuadro 4. Remoción de microcistinas por diferentes procesos
de tratamiento de agua
98
Aunque la degradación de microcistina-LR y nodularina da como resultado
productos inactivos, es necesario asegurarse de que no se formen productos
nocivos durante este proceso. El carbón activado es una medida efectiva para
remover una gran variedad de contaminantes, incluyendo las toxinas de las algas
acuáticas. Sin embargo, su efectividad depende de factores como la presentación
(polvo o granular) y el método de adición del mismo.
A la fecha existe una gran cantidad de información sobre los daños ocasionados
por cianobacterias tóxicas (no todos los géneros de cianobacterias son tóxicas)
presentes tanto en cuerpos de agua con fines recreativos como en aquellos que
sirven de suministro para consumo humano. Sin embargo, este problema es
poco atendido en los países latinoamericanos.
Con relación a la presencia de florecimientos de cianobacterias en fuentes
de abastecimiento de agua para consumo humano en México, se ha reportado
su presencia en el Lago de Chapala, en el estado de Jalisco y en Valle de Bravo,
en el Estado de México. De esta última zona se tienen registros de florecimientos de 1998 a la fecha y de la presencia de microcistina-LR. La presa Valle de
Bravo y los diferentes cuerpos de agua que conforman el sistema Cutzamala
proveen cerca del 30% del agua potable a los habitantes (aproximadamente
6,000,000) de la Ciudad de México. En estos sitios, durante casi seis meses
al año se aprecia la presencia de cianobacterias con florecimientos durante
el verano y se detectó la presencia de microcistina-LR en los meses de junio,
septiembre y noviembre de 1999. Las concentraciones más altas se observaron
en el mes de junio con valores de 2,551 mg kg-1, peso en base seca. El valor
más bajo se determinó en noviembre, cuando aparentemente el florecimiento
había desaparecido; en este mes el valor máximo fue de 109 mg kg-1, peso en
base seca (figura 4).56, 57
En el año 2000 no se registraron florecimientos de cianobacterias, pero durante 2001 1as concentraciones de microcistina-LR se incrementaron de enero
a julio y la mayor concentración fue de 3,761 µg de toxina g-1. Aunque en agosto
se identificó un decremento en la concentración de microcistina-LR, los niveles observados en julio se alcanzaron en septiembre y octubre, para disminuir
nuevamente en noviembre (figura 5).
Una situación similar podría presentarse en otros cuerpos de agua eutrofizados en nuestro país, como es el caso del Lago de Chapala. Ante esta evidencia
surge la necesidad de establecer un programa de vigilancia y monitoreo en los
cuerpos de agua, ya que debido a los procesos de eutrofización es factible la
presencia de florecimientos de cianobacterias con niveles de microcistina-LR
por arriba del valor guía recomendado por la OMS de 1 µg L-1.35
99 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
10. LA EXPERIENCIA EN MÉXICO
Microfotografía: Nancy García Roa. Cyma-Lab. Bacteriología UNAM-FESI
Correo-e: [email protected].
100
Microbiología ambiental
Figura 3. Anabaena sp. (40X) en cultivo de laboratorio (medio BG-11)
También es importante diseñar estrategias adecuadas de remoción de toxinas
y de control de cianobacterias, en el proceso de tratamiento del agua con el fin de
proteger a la población a la exposición aguda o crónica. Por otro lado, se requiere
hacer un inventario a nivel nacional de los florecimientos de cianobacterias y
establecer el número de géneros productores de toxinas y sus diferentes tipos
que podrían liberarlas al ambiente acuático, para tomar medidas preventivas de
acuerdo al uso al que se destine el cuerpo de agua. Se requiere el establecimiento
de una método estandarizado para la identificación y la cuantificación de las toxinas, incluyendo aquéllas que se han identificado recientemente.58 Finalmente, se
debe informar al público usuario de los cuerpos de agua, tanto de uso recreativo
como de abastecimiento, sobre los riesgos que implica el hacer uso del agua con
evidente presencia de cianobacterias tóxicas.
Figura 4. Valores de microcistina obtenidos en 1999
en la presa de Valle de Bravo
300
ppm
250
200
150
50
0
Punto 3
Punto 5
Punto 3
Noviembre
Septiembre
Junio
109
No detectable
No detectable
Punto 6
Punto 7
Junio 1999
Septiembre1999
Noviembre 1999
Punto 5
Punto 6
No detectable
651
923
30
653
683
Punto 7
93
199
2,551
Figura 5. Valores de microcistina obtenidos en 2001
en la presa de Valle de Bravo
4,000
3,500
3,000
ppm
2,500
2,000
1,500
1,000
500
0
Ene 01 Mar 01 May 01 Jun 01 Jul 01 Ago 01 Sep 01 Oct 01 Nov 01
µgg-1 140
48
1,270 2,509 3,761
59
2,951 3,102
12
101 Cianobacterias, microorganismos del fitoplancton
100
102
Microbiología ambiental
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106
Microbiología ambiental
LA ECOLOGÍA MICROBIANA:
UNA NUEVA CIENCIA PARA
UN NUEVO SIGLO
Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez,
Laura Espinosa-Asuar, René Cerritos y Luis Eguiarte
La visión general sobre la ecología es meramente antropocéntrica
y está relacionada con los problemas de contaminación, y en el mejor de los
casos con la interacción que el hombre tiene con su ambiente. Sin embargo,
las relaciones de los organismos con su entorno comenzaron desde el origen
de la vida y han moldeado a nuestro planeta. Por esto entender el pasado y el
futuro evolutivos de la vida en la Tierra requiere de una compensión de la naturaleza de la vida y de los modos en los que ésta ha surgido y evolucionado en
el ambiente con sus componentes bióticos y abióticos. En este sentido, para los
ecólogos bacterianos la tarea principal es tratar de discernir porqué los organismos están en un sitio dado con ciertas abundancias en un tiempo determinado.
Dentro del marco de estudio de la ecología es importante evaluar la diversidad,
la abundancia y la distribución de los organismos a diferentes escalas que van
desde el paisaje, el ecosistema, las comunidades y, finalmente, las poblaciones
de las diversas especies.
¿Por qué es importante estudiar la ecología? Analizar la ecología de
cualquier organismo nos permite entender muchos aspectos, no sólo relacionados con el organismo en cuestión sino del ecosistema al que pertenece,
los datos ecológicos nos dan información sobre la historia de los organismos
y de su entorno así como sobre las cadenas tróficas y los procesos demográficos. Todo esto permite formular teorías sobre los cambios ecológicos
que ha sufrido y sufrirá nuestro planeta. En otras palabras, entender la
ecología ayuda a comprender cómo interaccionan los organismos con su
ambiente y cómo ambos cambian debido a estas interacciones; significa
entender los sutiles cambios en el tiempo que constantemente llevan a la
adaptación de los organismos. Así, comprender la ecología es entender,
en parte, la evolución.
[107]
107 La ecología microbiana
1. ¿QUÉ ES LA ECOLOGÍA MICROBIANA Y QUÉ ESTUDIA?
Sin embargo, si este tema es tan importante ¿por qué hay tan poca información para los microorganismos? La principal razón es que ver, caracterizar y
contar bacterias no es tan fácil como estudiar plantas o mamíferos. Sin embargo,
gracias al descubrimiento de diferentes estrategias moleculares que permiten
identificar a los microorganismos a partir de su ADN, ahora es posible caracterizar y contar bacterias casi tan fácilmente como lo hace un ecólogo de plantas o
animales. Además, los métodos moleculares han abierto nuevas posibilidades de
análisis de la función bacteriana. En este capítulo se verá cómo se ha avanzado
en algunos de los aspectos que consideramos más interesantes de la ecología
microbiana en los albores del siglo XXI.
108
Microbiología ambiental
2. DIVERSIDAD Y COEXISTENCIA
Se estima que la biomasa de microorganismos terrestres en la superficie de
nuestro planeta es igual a la de todas las plantas marinas y terrestres y tal vez
sea el constituyente principal de la biomasa de nuestro planeta.1, 2 A pesar de
que la diversidad ecológica de los microorganismos en el agua y en el suelo
puede ser distinta, el número máximo de individuos que integran el taxón
4
5
dominante
˜ es similar: ˜ 10 -10 individuos por gramo o mililitro. Este hallazgo
sugiere que deben existir mecanismos que controlan la densidad de los taxa y
que deben funcionar de manera más o menos similar en todos los ambientes,
mientras que los que controlan la diversidad total de la comunidad bacteriana
trabajan de modos distintos en el agua y el suelo. Existen algunas ideas sobre
los mecanismos que controlan la diversidad procarionte y ambas tienen que
ver con la ecología.
INTERACCIONES TRÓFICAS
Hutchinson3 se preguntaba por qué hay tantas especies de fitoplancton en un
medio aparentemente homogéneo, en donde todas las especies presentes parecen competir por el mismo tipo de nutrimentos. Dentro de los procariontes los
competidores pueden coexistir si hay algún mecanismo de pérdida selectiva
de especies que evite que los competidores más exitosos concentren todos los
recursos.4, 5, 6 Por ejemplo, existe depredación selectiva en tamaño, llevada a cabo
por protozoarios, lo que permite la coexistencia de bacterias y fitoplancton de
diferentes tallas; esta interacción determina cómo se distribuye la biomasa en
grupos funcionales. Otra interacción frecuente en el mundo de las comunidades
microscópicas es la que se da entre virus y bacterias, este parasitismo es generalmente específico y ello permite la coexistencia de varios taxa de bacterias en
una comunidad. Este tipo de interacción ha sido asociado con la especiación
dentro de grupos funcionales,7 pues la transferencia horizontal mediada por
fagos favorece la diversificación.
La complejidad estructural del suelo y los sedimentos es importante para la
diversificación a nivel de poblaciones ya que permite que los recursos sean fraccionados, y de esta manera se creen nuevos nichos con los que se incrementa la
especialización y la división en especies ecológicas nuevas.7
La mayoría de las comunidades terrestres sufren perturbaciones intermitentemente como: escasez de alimento, sequía, congelamiento/descongelamiento o
los resultados de la actividad humana. Estas condiciones ambientales alteradas
y los recursos que se liberan crean oportunidades para que se establezcan nuevas especies. Así, la perturbación asegurará que las comunidades incluyan una
mezcla de los diferentes estadios de sucesión.8 Sin embargo, cambios fuertes y
frecuentes causarán la desintegración de los microhabitats y la disrupción de
los límites entre poblaciones, lo que permitirá que los recursos locales estén
disponibles para una mayor proporción de la masa microbiana total7 es decir,
más individuos pero menos especies.
3. UNA SOLUCIÓN MOLECULAR PARA DESHACER EL NUDO DE LA ECOLOGÍA MICROBIANA
Sin embargo, si se quiere hacer ecología microbiana se tendrá que identificar y
contar a los microbios ¿Cómo se podra “ver” lo invisible y contar lo que no se
puede cultivar? Este es el problema fundamental de la ecología microbiana. A
continuación se presenta diversas técnicas para resolver estos problemas.
CULTIVAR O NO CULTIVAR
El número de especies microbianas existentes ha sido estimado entre 105 y 106;9
sin embargo, sólo se han aislado, descrito o caracterizado algunos miles. Esto se
debe, en parte, a que sólo unos cuantos organismos de las muestras ambientales
crecen en medios nutritivos en cajas de Petri.10, 11, 12, 13
Se han hecho muchos intentos para mejorar la recuperación en cultivo,
consistentes, de manera general, en manipular cuidadosamente los medios de
109 La ecología microbiana
B. HETEROGENEIDAD AMBIENTAL
Microbiología ambiental
110
cultivo y aumentar el número de interacciones entre especies dentro de una misma caja14 pero el éxito ha sido moderado y el problema del mundo no cultivable
sigue siendo un reto importante de la microbiología .10
Kaeberlein et al.14 probaron si los organismos no cultivables crecerían
si se les proveía de los componentes químicos de su ambiente natural. Para
permitir el acceso a estos componentes, colocaron a los microorganismos en
cámaras de difusión, mismas que se incubaron en un acuario que simulaba el
lugar nativo de estos organismos (figura 1). Con este método lograron recuperar en cultivo alrededor del 40% del inóculo original (se contó el número
de colonias formadas en relación al número de células inoculadas), lo cual
representa una recuperación órdenes de magnitud mayor que en los intentos
tradicionales de cultivo. Además de esta extraordinaria recuperación “primaria” en cultivo, se intentó aislar colonias de la comunidad cultivable y con este
experimento se logró el resultado más significativo del trabajo. La mayoría
de las colonias aisladas transferidas a cajas de Petri no crecieron (86%) y las
microcolonias que lograron crecer (14%) eran cultivos mixtos. Unas pocas
colonias grandes y que crecieron rápidamente fueron puras y representaron
el 0.054% del inóculo original, lo cual es consistente con lo reportado previamente en relación con la recuperación en cultivo. Esta información lleva
a conclusiones interesantes sobre la ecología de los microorganismos, pues
parece resaltar la importancia de posibles señales específicas originadas por
los organismos vecinos que indican la presencia de un ambiente familiar.
Esto significa que los microorganismos no crecerán en un ambiente extraño
(sin sus vecinos) aunque existan los nutrientes apropiados.14 Lo que podría
explicar el por qué no es posible aislar a la mayoría de los microorganismos
en medios artificiales como cultivos puros. No obstante, aquí habría que
abrir la discusión sobre si realmente son los vecinos o hemos sido incapaces
de determinar los micronutrientes necesarios para lograr cultivos puros de
la mayoría de los microorganismos.
4. ¿COMO HACER ECOLOGÍA DE COMUNIDADES SIN OBTENER CULTIVOS
PUROS DE LA MAYORÍA DE LOS MICROORGANISMOS? (MÉTODOS MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS DE LO NO CULTIVABLE)
PFLA (PHOSPHOLIPID FATTY ACID ANALYSIS)
En todos los microorganismos encontramos fosfolípidos, principalmente en las
membranas celulares, las cuales pueden ser degradadas fácilmente dejando libre
el componente fosfolipídico. Los fosfolípidos de las membranas son indicado-
TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLÉICOS
De entre todas las moléculas probadas hasta ahora, los ácidos nucléicos han
demostrado ser las moléculas más útiles, pues han contribuido con una nueva
perspectiva y entendimiento sobre la estructura de las comunidades. Una de las
principales ventajas asociadas a los métodos moleculares con ácidos nucléicos es
que puede analizarse a la comunidad microbiana en su totalidad, incluyendo a
aquellos organismos que no han podido ser cultivados en el laboratorio. Es por
ello que estos métodos se han vuelto cada vez más importantes en la ecología
microbiana.22,23,24,25 Aún los análisis de baja resolución y amplia escala, como
la reasociación de ADN, permiten la determinación una aproximación de la
diversidad genética total de la comunidad bacteriana.26
La electroforesis de productos de PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) de genes de rARN en geles desnaturalizantes de gradiente
(DGGE) permite tener mayor resolución y provee información sobre cambios
111 La ecología microbiana
res importantes de la biomasa microbiana activa y además se sabe que existen
lípidos únicos en grupos específicos de organismos, por lo que este análisis ha
sido usado para determinar la diversidad y abundancia microbianas.15, 16 El PFLA
requiere que la muestra ambiental de estudio sea analizada cuantitativamente
por cromatografía de gases (GC) y espectrometría de masas (MS), lo que genera
datos sobre la presencia y abundancia de diferentes fosfolípidos.17, 18 Los datos
obtenidos sobre los ácidos grasos de las muestras pueden ser comparados con
bases de datos públicas18 lo que permite la asociación de ciertos PFLA con organismos o grupos específicos. Las diferencias en los patrones de PFLA pueden ser
interpretadas con relación a cambios en la composición de las comunidades. Este
método ha sido utilizado con éxito en estudios que demuestran grandes cambios
en comunidades micro-bianas asociadas a prácticas de manejo de suelos.19, 20
A pesar de la utilidad de este método de análisis existen algunas limitaciones
importantes.21 La primera es que no se conocen los patrones de ácidos grasos
para todos los organismos, por lo que los datos obtenidos de muchas muestras
no pueden relacionarse con algún grupo de microorganismos. La segunda limitación es que los patrones de ácidos grasos son muy susceptibles a cambios no
necesariamente debidos a la composición de la comunidad, por lo que pueden
obtenerse patrones falsos que originen interpretaciones incorrectas. La tercera
restricción es que bacterias y hongos producen diferentes cantidades de ácidos
grasos dependiendo de las condiciones de crecimiento o estrés, por lo que a
pesar de que los patrones de PFLA puedan correlacionarse con la presencia de
algunos organismos, esto no significa necesariamente que esos patrones sean
únicos para esos grupos en todas las condiciones.
112
Microbiología ambiental
en el grueso de la estructura de la comunidad.27 Cuando se combinan análisis
de genes de rARN en DGGE con hibridación, usando sondas filogenéticas o
secuenciando, se obtiene la afiliación filogenética de los miembros dominantes
en número que se encuentran en la comunidad.28 La hibridación fluorescente in
situ (FISH) de células microbianas con sondas filogenéticas provee información
acerca de la composición taxonómica de la comunidad.29,24
Finalmente, la clonación de productos de PCR de genes de rARN de la
comunidad arroja información específica de la comunidad microbiana no
cultivable. Esta estrategia también permite la comparación de la estructura
de la fracción cultivable con respecto a la no cultivable.30 De esta manera, los
ácidos nucléicos se han utilizado de diferentes maneras para caracterizar a las
comunidades. A continuación ampliaremos la descripción sobre las estrategias
mencionadas.
Cinética de reasociación de ADN
El ADN de una comunidad microbiana es una mezcla de genomas de diferentes especies que están presentes en diferentes proporciones. Una curva de
reasociación de ADN nos da una idea de que tan compleja es esa mezcla. La
técnica consiste en desnaturalizar con calor la mezcla total de ADN y mediante
la lectura de un espectrofotómetro (la monohebra de ADN y el ADN de doble
cadena tienen picos de absorbancia a diferentes longitudes de onda),31 lo que
permite generar una cinética de reasociación de ADN, que es de segundo orden y cual quiera de este tipo de curvas tiene una constante de reasociación
C0t1/2. Bajo condiciones definidas, C0t1/2 es proporcional a la complejidad
del ADN. (heterogeneidad).32 Estos valores son siempre relativos a la cinética
de reasociación de ADN de una sola especie (ADN de Escherichia coli); esta
se considera la curva ideal y una curva de una comunidad siempre tendrá
pendientes menores a la ideal (ver figura 2). Aunque en estos experimentos
C0t1/2 no tiene un significado preciso, este valor ha sido usado como similar
a índices de diversidad de especies.31
RAPD´s (Random Amplified Polymorphic ADN)
El fingerprint o huella de ADN puede obtenerse de diferentes maneras, una de
ellas es la conocida como RAPD. Dentro de los métodos de huellas de ADN basados en PCR quizás sea este el más ampliamente usado. El PCR de RAPD utiliza
oligonucléotidos de 10 a 12 pares de bases para amplificar segmentos al azar de
ADN. Este método funciona porque sólo un pequeño número de fragmentos
(de 5 a 10) se amplificarán en un rango de longitud que puede ser fácilmente
amplificado por PCR (comúnmente menor a 3 o 4 kilobases).33 Cuando el ADN
que se encuentra entre las secuencias amplificadas consta de repeticiones en tandem y hay variaciones en su longitud, el fragmento amplificado será de longitud
variable o polimórfico en la población o comunidad (ver figura 3).
Esta estrategia puede servir para dar un primer vistazo a la composición de
distintas comunidades; sin embargo, debemos mencionar que esta técnica es
poco reproducible debido a que cualquier variación mínima en las condiciones
de PCR o del ADN original puede generar cambios en los patrones, por lo que
es recomendable utilizar técnicas adicionales para fortalecer los datos sobre la
estructura de las comunidades.
De las diferentes técnicas que usan ácidos nucléicos para estimar la diversidad
de comunidades microbianas, la más útil y ampliamente utilizada es la determinación de secuencias o patrones del gen que codifica para la subunidad pequeña
de los ribosomas (16S para procariontes y 5S o 18S para eucariontes).34 Esta
subunidad pequeña (SSU) de rARN es adecuada para este tipo de estudios por
varias razones. La primera es que se encuentra en los tres dominios de la vida
conocidas: bacteria, Archaea y Eucarya.35 La segunda es que son moléculas que
tienen regiones altamente conservadas y regiones con variación considerable
en su secuencia,36 y debido a estas tasas de evolución diferentes se pueden establecer relaciones a diferentes niveles jerárquicos en un análisis comparativo
de secuencias.15 La tercera razón es que el rADN puede amplificarse fácilmente
por PCR y ser secuenciado. Varios estudios han demostrado que más del 90%
de los microorganismos que pueden observarse microscópicamente in situ
pueden ser extraídos y analizados,37, 38, 39, 40, 41, 42 en comparación con menos del
0.1% que pueden cultivarse.15 Una vez amplificado el gen de rARN por PCR es
posible analizar la diversidad de este gen en la comunidad para tener una idea
de la complejidad de la misma, siguiendo diferentes estrategias que se explicarán
a continuación.
DGGE/TGGE (Denaturing Gradient/ Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
Esta técnica permite separar mezclas de productos del PCR que son de la misma
longitud pero que difieren en secuencia. El poder de separación de este tipo
de electroforesis se basa en que el comportamiento de desnaturalización del
ADN está determinado de manera importante por la secuencia de nucléotidos.
113 La ecología microbiana
Técnicas relacionadas con la diversidad de genes de rARN (SSU)
114
Microbiología ambiental
Al correr el ADN en el gel, la molécula se mantiene como doble cadena hasta
que alcanza la concentración o temperatura desnaturalizante, reduciendo su
movilidad en el gel.15 En teoría, cualquier gen de rARN que se encuentre en el
ADN total de la comunidad puede ser amplificado por PCR y resuelto en un gel
DGGE/TGGE, ya que en este tipo de análisis cada banda en el gel es considera
como una especie distinta en la comunidad y la intensidad de las bandas es
tomada como un reflejo de la abundancia de esa secuencia en la comunidad
(figura 4).
Existen algunas consideraciones importantes sobre esta técnica y tienen
que ver con la interpretación de los datos obtenidos. En particular, es posible
que diferentes especies generen una misma banda por lo que los estimados de
diversidad serán subestimaciones. Por ello lo ideal es hacer estimaciones de
diversidad relativa entre comunidades y considerar “filotipos” o OTU (unidades
taxonómicas operacionales) en lugar de especies.
T-RFLP´s (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)
El análisis de fragmentos de restricción terminales es actualmente uno de los
métodos más poderosos que existen dentro del campo de la ecología microbiana
para comparar rápidamente la diversidad de secuencias de ADN bacteriano
amplificado por PCR de muestras ambientales.43, 44. El método se basa en la
variación en la posición de sitios de restricción entre las secuencias y en la
determinación de la longitud de fragmentos terminales de restricción (TRF)
marcados con fluorescencia y analizados por medio de electroforesis en geles de
alta resolución en secuenciadores de ADN.45, 46 El resultado es una distribución
de abundancia de fragmentos de diferentes tamaños (figura 5). Dentro de las
características más importantes de este método está la gran velocidad de análisis
de las muestras, lo que permite hacer réplicas de los experimentos y con ello
lograr análisis estadísticos.47 El método de TRF puede ser usado para identificar
diferenciación de comunidades, para comparar ha riqueza relativa de filotipos
y estructura de comunidades, y para identificar organismos específicos en una
comunidad,47 a partir de la clonación y secuenciación de fragmentos específicos
de 16S rARN de dicha comunidad.
A pesar de que éste es un método rápido de análisis comparativo de comunidades tiene relativamente baja resolución. Esto se debe a que existe cierta
probabilidad de que varios filotipos se encuentren representados por un solo
tamaño de fragmento y representen un solo pico en la distribución; esto puede llevar, nuevamente, a subestimar la riqueza de especies, la cual puede ser
calculada por otros métodos con mayor resolución filogenética, pero a mucho
mayor costo. Esta situación fue puesta a prueba por Dunbar,47 al comparar los
estimados de riqueza obtenidos de una librería de clonas de 16S y de TRFLP
obtenidos de la misma muestra de donde se construyó la librería. Dunbar et al.
concluyeron que los patrones de TRFLP subestiman la riqueza relativa del total
de los filotipos; sin embargo, permite descubrir similitudes entre comunidades
y tiene una buena sensibilidad (detecta genomas que se encuentran en concentraciones tan bajas como el 1% del total de la comunidad). Es por ello que este
método se recomienda como útil para análisis rápidos de muestras de campo
que quieran compararse en cuanto a su composición y es una herramienta útil
para investigaciones de ecología microbiana.
ARDRA es una técnica de fingerprint o huella de ADN que se usa para caracterizar comunidades y poblaciones. Consiste en amplificar por PCR el gen de
16S rARN de la comunidad total, aislar las diferentes copias que se encuentran
en la mezcla y, posteriormente, someter a cada una de las copias a digestiones
enzimáticas (restricción); también puede digerirse la muestra total (sin separar
las copias).48 La manera más común de separar las diferentes copias del el 16S
rARN (o cualquier otro ) de la comunidad es clonando los diferentes fragmentos
en cepas especiales de Escherichia coli que son capaces de transformar e incorporar el fragmento en un plásmido con marcadores moleculares de color (i.e.,
operon lactosa) y resistencia a múltiples antibióticos. Esto se hace al mezclar
el PCR total con bacterias susceptibles a adquirir ADN extraño (competentes);
de esta manera, cada bacteria obtendrá una sola copia del gen y así quedarán
separadas las diferentes copias de la mezcla total. Las bacterias que contienen los
fragmentos se dejan crecen en cajas de Petri con antibióticos y posteriormente
se aisla el ADN plasmídico junto con el gen de interés que se puede separar del
ADN bacteriano. Cada gen obtenido de esta manera se somete a una digestión
enzimática que da como resultado un patrón de bandas en electroforesis en geles
de agarosa (figura 6). Los patrones de restricción permiten identificar diferentes
grupos (diferentes patrones de restricción no significan necesariamente especies
diferentes) o identificar comunidades distintas. Si el ARDRA se hace con copias
separadas del gen 16S rRNA, el análisis de los diferentes patrones permite hacer
estimaciones de diversidad y/o elegir representantes de los patrones distintos
para obtener las secuencias e identificar los grupos taxonómicos específicos a
los que pertenecen o con los que se relacionan. El problema principal de esta
técnica es que dado el número de clonas que se deben obtener por comunidad
para determinar su diversidad y abundancia por restricción, los costos son casi
iguales que si se secuencia la comunidad completa.
115 La ecología microbiana
ARDRA (Amplified Ribosomal ADN -Restriction Análisis)
116
Microbiología ambiental
Secuencias
Cualquiera de las estrategias de ácidos nucléicos mencionadas puede concluir
con la secuenciación de una muestra de las copias del gen 16S rARN por sitio.
Sin embargo, se pueden evitar los análisis antes mencionados y hacer el PCR del
ADN total, e inmediatamente después secuenciar todas las copias con clonación
previa. El análisis de secuencias en comunidades microbianas requiere siempre
separar las diferentes copias de la muestra, ya sea por clonación o cortando
las diferentes bandas de geles TGGE. Obtener la secuencia de 16S rARN de los
diferentes organismos de la muestra tiene varias ventajas. Una de ellas es que se
construye una librería de clonas que mantiene las copias separadas y listas para
otros análisis en el futuro. Otra ventaja, y quizás la más importante para el análisis
de comunidades microbianas, es que la obtención de secuencias de librerías de
clonas es la única manera de contar con estimados robustos sobre diversidad de
comunidades complejas (como muchas comunidades microbianas).49
La principal limitante encontrada hasta ahora para la aplicación general de
análisis de comunidades con secuencias es su costo (el cual está reduciéndose
constantemente debido a la gran demanda de estos métodos) y el tiempo que la
técnica requiere, ya que cada una de las secuencias debe de ser “curada”, es decir,
confirmar que cada pico del electrofenograma sea el correcto. Posteriormente, las
secuencias deben ser sometida a Blast con el GenBank y alineadas considerando
la estructura terciaria del 16S.
Técnicas relacionadas con la expresión de genes (rARN)
Varios análisis se han enfocado recientemente a la caracterización de comunidades
microbianas del suelo basándose en la expresión del rARN en contraste con los
genes que codifican para el ribosoma: el rADN.50, 51, 52, 53, 54, 55 Al igual que el rADN,
el ARN tiene regiones tanto variables como muy conservadas que permiten la
discriminación de taxa a diferentes niveles taxonómicos. Además, el uso de ARN
directo ofrece varias ventajas principales sobre el uso de técnicas con rADN.
La primera ventaja es que, debido a que los ribosomas son el sitio de síntesis
de proteínas, el contenido de ARN se correlaciona con la actividad metabólica y la
tasa de crecimiento,56 lo que significa que una alta proporción de las secuencias
detectadas en las muestras corresponderán a microorganismos metabólicamente
activos, en crecimiento y probablemente importantes ecológicamente.53, 57, 58 La
segunda ventaja es que debido a que las secuencias de rARN normalmente se
encuentran en las células en más copias que las secuencias de rADN teóricamente
deben ser más fáciles de detectar. La tercer ventaja es que cuando los ribosomas
se extraen directamente de las muestras ambientales solo se incluyen en el es-
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
FISH es un método usado principalmente con comunidades procariontes y per-
mite la identificación y cuantificación directas de grupos taxonómicos generales
117 La ecología microbiana
tudio a los microorganismos vivos y activos. Al igual que con el rADN, cuando
los ampliaciones de rARN se separan en geles DGGE/TGGE, el patrón de bandas
sirve como una huella digital de la comunidad microbiana. Si se supone que no
hay sesgo en la amplificación, la intensidad de las bandas indica la abundancia
en la comunidad de la secuencia de rARN correspondiente.50
Sin embargo, un factor importante que complica las interpretaciones sobre
la abundancia de un taxon es que el número de operones de rARN dentro de
un genoma puede variar entre los grupos taxonómicos59 por ello es posible
que exista heterogeneidad en las secuencias de rARN dentro de una misma
cepa y, en consecuencia, no puede suponerse que cada producto de PCR en el
gel corresponda a un organismo diferente, y un mismo organismo puede estar
representado por varias secuencias distintas.15 Por otro lado, la intensidad de
la banda puede deberse a muchas copias de una misma secuencia en el mismo
organismo o a que existen muchas células del organismo que posee la secuencia.
Una manera de distinguir entre estas dos posibilidades es mediante hibridización
in situ.60 Otra forma es correr el mismo gel con productos de PCR de rARN y
rADN y comparar la intensidad de las bandas para determinar si esta se encuentra
relacionada con el número de copias del gen.57
A pesar de que esta técnica puede ser muy útil para estudiar comunidades
microbianas, existen limitaciones técnicas en ella debido a lo lábil que es el ARN.
Por lo tanto es necesario tener mucho cuidado con el almacenamiento y procesamiento de las muestras ambientales, ya que cualquier mínimo cambio en
las condiciones ambientales originales puede alterar la actividad metabólica
de los microbios.61Esto se puede evitar con el procesamiento inmediato o
congelamiento de las muestras. Otra restricción se presenta con respecto a la
eficiencia de extracción52 y amplificación de rARN.62, 63, 61 Existe la posibilidad
de que la amplificación sea sesgada por mayor abundancia de algunas secuencias en el rADN original o por mayor homología de ciertas secuencias por los
oligonucleótidos del PCR. La mayoría de los estimados son en procariontes y,
aunque en teoría debería poder analizarse la comunidad eucarionte de rARN
de la misma manera que procarionte, los ribosomas eucariontes parecen ser
más complejos en cuanto a los genes que los codifican y su regulación, además
de que las bases de datos públicas con secuencias de rARN prácticamente no
tienen representantes eucariontes, por lo que resulta problemático identificar
especies eucariontes con las secuencias de su rARN.15
Microbiología ambiental
118
o específicos dentro de su ambiente natural.24, 64, 65, 66 Con FISH todas las células
son fijadas y su 16S o 23S rARN se hibridiza con sondas de oligonucleótidos de
un taxón específicos y marcados con fluorescencia. Posteriormente, las células
que hibridaron y quedaron marcadas pueden verse en un microscopio óptico de
fluorescencia. Con este método y gracias a que las células completas se hibridan,
se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN, amplificación
por PCR y clonación.67, 68, 58
FISH puede usarse para observar organismos no cultivados y es útil para estudiar la distribución ecológica de los organismos a través de habitats diversos.67,
69, 70
Tal vez el aspecto en el que se debe tener más cuidado cuando se utiliza el
FISH es en el diseño de la secuencia de las sondas de hibridación, ya que de ello
depende que se logre una buena caracterización de la comunidad. Es necesario
hacer una selección cuidadosa de las secuencias de los organismos representativos del taxón o taxa que se desea visualizar, pues la sonda será tan buena como
lo sea esta selección.24 Errores en este diseño podría ocasionar que no puedan
observarse organismos no cultivables que pertenezcan al grupo de interés o que
se den hibridaciones cruzadas con organismos de otros grupos.29, 65, 58
5. Y AHORA QUE SE PUEDE CONTAR ¿QUÉ ES LO QUE SE CUENTA?
Ya que puede estimar indirecta y directamente la diversidad y abundancia de las
especies de los microbios en las comunidades llegamos a un problema difícil de
resolver ¿qué es una especie bacteriana? Esto no es trivial y adquiere rápidamente
tintes filosóficos que se revisarán más adelante. En términos más prácticos, Hughes et al.,71 publicaron recientemente una revisión sobre el problema que implica
determinar el número de especies en una comunidad, y evaluaron el tamaño de
muestra que en general se requiere para tener un estimado útil sobre la diversidad
de las comunidades. Además analizaron la utilidad de varios estimadores de
diversidad para el caso de comunidades bacterianas. La relación entre el número
de tipos (OTU = Operational Taxonomic Unit, un eufemismo para no explicar
si lo que se analizan son especies, clonas, filotipos u otra categoría taxonómica
jerárquica) observados y el esfuerzo del muestreo nos proporciona información
sobre el total de la diversidad de la comunidad que ha sido muestreada. Este
patrón puede visualizarse graficando una curva de acumulación que consiste
en relacionar el número acumulativo de OTU observados contra el esfuerzo de
muestreo. Este tipo de curvas revelan la calidad del muestreo, ya que, como todas
las comunidades por definición deben de tener un número finito de especies,
si se continúan muestreando individuos, las curvas eventualmente tenderán a
esta valor máximo, es decir alcanzarán una asíntota en el valor real del número
total de OTU en la comunidad.
119 La ecología microbiana
En la gran mayoría de las comunidades microbianas revisadas en el estudio
de Hughes,72 no se alcanza la asíntota de las curvas debido a la gran diversidad
que existe. Sin embargo, aunque sería útil conocer la diversidad total real de las
comunidades microbianas, la mayor parte de las preguntas relacionadas con la
diversidad se refieren a cambios en ésta que suceden por alteraciones ambientales bióticas o abióticas, por lo que las respuestas a estas preguntas requieren
únicamente estimados de diversidades relativas. De esta manera, se encontró
que aunque los valores dependen del tamaño de la muestra, la mayoría de los
estimadores de riqueza se estabilizan con los tamaños de muestra que, en general,
tienen estos estudios, esto es con muestras de 200 a 1,000 clonas, que sugieren
comunidades con sólo cientos a pocos miles de especies importantes (no miles
o millones, como se había sugerido previamente).
Es importante señalar que todas las estimaciones estadísticas presentan
limitaciones y una de las más importantes y frecuentes es que no existe rigor
en la definición de los OTU que se analizan ni de su relación con las especies
reales,73 por lo que diferentes estudios que calculan los mismos estimadores
generalmente no son del todo comparables. De igual manera, la mayoría de
estas aproximaciones requieren datos sobre frecuencias relativas de los diferentes
OTU y muchos estudios han revelado que los análisis genéticos de diversidad
microbiana van acompañados de sesgos de muestreo. Sin embargo, el hecho
de que la mayoría de las preguntas sobre estructura y función de las comunidades requieran comparaciones relativas sobrepasa muchos de los problemas
sobre definición de especies y sesgos de muestreo.71 Mientras que la unidad de
medida sea definida y constante, puede compararse la diversidad entre sitios o
tratamientos. De igual manera, para minimizar el efecto del sesgo de muestreo
se pueden usar varias técnicas o genes que fortalezcan las comparaciones.
De aquí deriva el problema de fondo en la ecología bacteriana. Un OTU
analizado ¿es una especie, parte de una especie o varias especies relacionadas?
¿Qué es una especie bacteriana y cuáles son sus límites? Resolver este problema
es fundamental para estimar la diversidad y sus patrones geográficos.
Históricamente, el concepto de especie que se aplica en microbiología ha sido
más práctico que natural. La práctica ha llevado a considerar especies estáticas,
cuyas características son atributos típicos o esenciales, y por tanto, supone que
el fenotipo y genotipo son iguales para todos los organismos pertenecientes a la
especie. En este caso, las características que se toman pueden ser morfológicas,
fisiológicas, bioquímicas e incluso genéticas. Por otro lado, el concepto natural
de especie pretende ser reflejo de una población en donde hay dinamismo y en
donde existe cohesión debido a una organización interna.74 El concepto natural
de especie más usado en sistemática es el biológico, el cual supone la existencia
de entrecruzamiento entre los miembros de una misma especie, de tal manera
que al existir tal entrecruzamiento se asegura, de manera indirecta, que entre ese
Microbiología ambiental
120
conjunto de organismos haya cohesión y por tanto se supone que el investigador
se encuentra ante una especie natural. La desventaja que tiene este concepto es
que no es aplicable para todos los organismos, principalmente para aquellos que
tienen reproducción asexual (Fungi, Protoctista, Archaea, Bacteria).
Desarrollar un concepto natural de especie para organismos con reproducción
asexual es uno de los mayores retos en sistemática microbiana. En la actualidad
se reconocen dos tipos de especie natural, la especie genética o genoespecie y la
especie evolutiva o filoespecie. La primera usa como carácter único los índices
de hibridación. El establecimiento de similitud en la secuencia del ADN de dos
organismos se logra mediante análisis de reasociación de ADN y de secuencias
del gen 16SrARN. En el caso de reasociación de ADN, si las secuencias de las
dos muestras de ADN son homólogas, se formarán hélices dobles híbridas.
Únicamente las muestras que tengan 70% de reasociación bajo condiciones
moderadamente restrictivas pueden considerarse como una especie genética.75, 76
Si hablamos de secuencias de 16SrADN el porcentaje de similitud de organismos
de una misma especie es mayor a 97%.
El concepto de genoespecie ha sido muy cuestionado. La idea de tener un 70%
de reasociación o 97% de similitud en 16SrADN es muy ambigua, sobre todo si se
quiere extrapolar a macroorganismos. Por ejemplo, si se toma la definición del 70%
de homología genómica, todos los primates podrían ser considerados miembros
de una sola especie.73 Además, se ha encontrado que en especies procariontes la
frecuencia de transferencia horizontal, así como de eventos parasexuales es muy
alta y por tanto podría dar resultados filogenéticamente erróneos al influir en el
grado de reasociación del ADN,77 y en la secuencia de genes como 16SrARN.
En este punto comienza la discusión acerca de la importancia de la recombinación genética (homóloga y no homóloga) en la dinámica evolutiva de las poblaciones. La recombinación genética homóloga presenta dos efectos fundamentales en
las poblaciones: impide la divergencia entre subpoblaciones, las homogeniza y, al
mismo tiempo, aumenta la diversidad de genotipos en la población.
Por otro lado, los efectos de la recombinación no homóloga originan nuevas
variantes y, potencialmente, nuevas especies. La adquisición de nuevos genes
que sean funcionales y de carácter adaptativo en el ambiente puede producir
especiación express en los organismos; se ha sugerido que tal es el caso de Yersinia pestis y Y. tuberculosis.
Cuando la frecuencia de la recombinación homóloga y no homóloga es muy
alta en un grupo de poblaciones naturales, el efecto combinado puede ser muy
diferente a las consecuencias planteadas previamente. En este caso las especies
pueden presentar una gran cantidad de nichos producto de la adquisición de
nuevas funciones; sin embargo, como la recombinación homóloga es alta, las
poblaciones de la especie se mantienen homogéneas. Escherichia coli y Vibrio
cholerae son ejemplos de este caso.
Como podemos observar, la delimitación de las especies microbianas no es
un asunto trivial y la practicidad no va acompañada de grupos naturales. Sin
embargo, en términos de comparación y estimaciones aproximadas de la diversidad y distribución de microorganismos, el uso de marcadores moleculares como
el 16S rADN u otros genes particulares a ciertos grupos resuelve el problema
inmediato sobre la estimación de la diversidad, siempre que haya consistencia
en cómo se define la unidad de análisis u OTU.
6. LOS PATRONES EN COMUNIDADES BACTERIAS: ¿EXCEPCIONALES O
Dejando a un lado los problemas taxonómicos en el caso de las bacterias, los datos
ecológicos sobre microorganismos aún son escasos lo que ha generado diversas
especulaciones sobre la posibilidad de que los microorganismos sean organismos
de excepción. En otras palabras, los pocos datos han generado un fuerte debate en
cuanto a la universalidad de las reglas ecológicas, esto es, si los microorganismos se
distribuyen y organizan de manera similar o al menos siguen las mismas “reglas”
o principios ecológicos que los organismos grandes como plantas y animales. Esta
discusión resulta extraordinariamente relevante ya que, como se menciono, hoy en
día los principios y reglas ecológicas se fundan en observaciones hechas en macroorganismos, y el hecho de que estos pudieran ser distintos implicaría que más de
dos terceras partes de la vida en la Tierra se rige por otros principios ecológicos. Se
cree que los microorganismos deben regirse básicamente por los mismos principios
ecológicos que los macroorganismos, ya que que siguen los mismos principios evolutivos y biológicos. De cualquier manera, los resultados que se obtengan con las
herramientas moleculares actuales nos permitirán comparar la ecología del mundo
macroscópico y microscópico y evaluar la universalidad de las reglas ecológicas.
Algunos autores defienden que todos los organismos pequeños son muy abundantes y se distribuyen por todo el mundo, sin barreras ecológicas. Esto puede ser
cierto para algunos microorganismos, como con adaptaciones extraordinarias para
la dispersión y gran resistencia a cambios en el ambiente (protozoarios, diatomeas,
bacterias formadoras de esporas, hongos, bacterias marinas). También parásitos
humanos que pueden generar epidemias mundiales pueden encontrase casi en
todas partes (Escherichia coli, Vibrio cholerae). Sin embargo, existen otras observaciones que apuntan a la existencia de fuertes barreras ecológicas que limitan
la dispersión de los microorganismos, generando divergencias genéticas entre
poblaciones de las mismas especies debido al aislamiento, lo cual se ajusta más
a los principios ecológicos y evolutivos observados en macroorganismos.
121 La ecología microbiana
COMUNES?
Microbiología ambiental
122
La aparición de las herramientas moleculares ha dejado abierta la puerta a
estudios ecológicos como los que se han realizado durante décadas con macroorganismos. Recientemente, han aparecido varios trabajos en donde se evalúa
la diversidad y distribución de microorganismos usando modelos desarrollados
especalmente para este grupo. Los resultados de dichos estudios han conducido al
debate sobre la posibilidad de distribuciones biogeográficas en microorganismos
(distribución geográfica asociada a ciertas condiciones ecoló-gicas) y sobre las
barreras reales a la dispersión de microorganismos.
Mientras que algunos autores presentan resultados en donde no hay asociación obvia entre la distribución de los microorganismos y la geografía, otros
parecen demostrar lo contrario. Estos estudios contradictorios plantean la pregunta de si existen realmente patrones de distribución en microorganismos.
Hillebrand y colaboradores,78 comparan la diversidad en diferentes organismos,
desde protistas hasta vertebrados, bajo la visión de relaciones que han sido estudiadas en macroorganismos (relación entre el número de especies y el área de estudio,
entre el número de especies y de individuos). La conclusión del estudio es que no
hay razón para pensar que existan límites para la dispersión de microorganismos;
es decir, pueden existir en todo el mundo, como ha sido sugerido por Finlay.79 Sin
embargo, este tipo de trabajos no son concluyentes ni absolutos debido a la falta de
consideración de los diferentes hábitos y formas de vida de los microorganismos.
No es lo mismo un organismo de vida libre con capacidades extraordinarias de
dispersión (como formadores de esporas), que un organismo parásito y ni qué
decir de los microorganismos altamente especializados y con capacidad limitada
de dispersión, como los que habitantes de las ventilas hidrotermales en el fondo
del mar o simbiontes estrictos asociados a organismos sésiles, como a gusanos
lofoforados de fondos marinos o en corales.
Apenas comienzan a plantearse preguntas sobre la distribución geográfica
de los microbios y las respuestas pueden ser muy interesantes, tanto para los
ecólogos de organismos macroscópicos como para los ecólogos de microorganismos. En el primer caso, las respuestas pueden contribuir al enriquecimiento
de la teoría existente y en segundo las respuestas pueden llevar a la introducción
de un soporte teórico sólido.
7. ECOLOGÍA EXTREMA: CICLOS BIOGEOQUÍMICOS Y ECOLOGÍA FUNCIONAL
BACTERIANA
El hecho de que los procariontes hayan sido de los primeros pobladores terrestres
y que hayan vivido en un inicio en condiciones extremas (luz ultravioleta, tem-
123 La ecología microbiana
peraturas extremas, condiciones anóxicas y un ambiente químico cambiante), les
confirió una serie de estrategias metabólicas que les ha permitido vivir en muy
diversas condiciones ambientales. Estas estrategias los conservan íntimamente
involucrados en el movimiento y la transformación (ciclos biogeoquímicos) de las
diferentes formas químicas de muchos elementos, pero especialmente de aquellos
esenciales para la vida como: el oxígeno (O), el carbono (C), el nitrógeno (N), el
azufre (S) y el fósforo (P). A continuación se explican algunos de ellos.
Desde el inicio de la vida en la Tierra, los procariontes (Bacteria y Archaea) han
jugado un papel preponderante, moldeando las características físico-químicas del
ambiente que nos rodea. La formación de la atmósfera en la Tierra fue un proceso
que duró varios millones de años y se cree que las cianobacterias (únicos organismos
capaces de tomar la energía del sol y el bióxido de carbono para transformarlos en
azúcares liberando oxígeno la fotosíntesis aerobia fueron las responsables, en un
inicio, de la producción del oxígeno atmosférico, hace aproximadamente 2.3 millones
de años. Por su capacidad para vivir tanto en condiciones anaeróbicas, como aeróbicas y de fijar en nitrógeno insoluble del aire a nitrógeno soluble como amonio, las
cianobacterias fueron los organismos predominantes del mar Precámbrico durante
miles de millones de años, creando a su paso gran cantidad de fósiles conocidos
como estromatolitos. Con el paso del tiempo la atmósfera se fue enriqueciendo
con el oxígeno de la fotosíntesis, lo que dio paso a un cambio en su composición
química y en las condiciones climatológicas prevalecientes; es decir la Tierra dejó ser
un planeta anaranjado cálido con una atmósfera de metano y bióxido de carbono
para convertirse en un planeta azul donde el oxígeno predomina y donde la capa
de ozono protege al planeta de los rayos ultravioleta.
Aún hoy la fotosíntesis, y en consecuencia la producción de oxígeno en los
sistemas terrestres que se lleva a cabo por las plantas superiores, es realizada
exclusivamente por los cloroplastos, los cuales son producto de la endosimbiosis
con cianobacterias.80 Sin embargo, este oxígeno liberado a la atmósfera por los
sistemas terrestres es consumido nuevamente mediante la respiración. De tal
forma que las cianobacterias fotosintéticas marinas son las responsables en gran
medida del mantenimiento del oxígeno atmosférico.
Este cambio atmosférico realizado por las bacterias a escala geológica tal
vez sea el más evidente. Pero los cambios físicos y químicos han sido muchos
y de diferentes magnitudes, y resultan esenciales para la vida, ya que procesos
como la fijación de nitrógeno, y el ciclo de carbono son parte esencial del reciclamiento de nutrientes y sólo realizan los procariontes. Asimismo, los cambios
en las condiciones químicas de los cuerpos de agua, la intemperización y la
precipitación de minerales y la remineralización del carbono orgánico también
son responsabilidad de las bacterias.
El carbono es un elemento esencial para la formación de compuestos orgánicos y la obtención de energía la concentración más grande de este elemento se
Microbiología ambiental
124
encuentra en la corteza terrestre en forma de carbonato de calcio y de magnesio.
La tasa de cambio de este almacén es extremadamente lenta, por lo que es el
carbono (C) orgánico (proveniente de los restos de vegetales, animales, microorganismos y la respiración) el que tiene importancia dentro de nuestra escala
temporal. Los productores primarios, es decir, las plantas superiores, las cianobacterias fotosintéticas y procariontes quimioautótrofos son los encargados de
transformar el CO2 existente en la atmósfera en materia orgánica (principalmente
polisacáridos). El C incorporado puede regresar nuevamente a la atmósfera como
CO2 o CH4 (metano), formar parte de la biomasa microbiana del suelo o ser
mineralizado por los microorganismos. Además los polisacáridos producidos
por los microorganismos son un elemento de cohesión muy importante de las
partículas del suelo, que les dan estructura, resistencia y capacidad de almacenamiento de nutrientes, necesarios para el crecimiento de las plantas.
El nitrógeno es un elemento clave en las células ya que forma parte de los
aminoácidos, de ciertas vitaminas, enzimas, proteínas y del ADN. El nitrógeno
constituye aproximadamente el 79% de la atmósfera y se encuentra en una
forma muy estable (N2). Esto implica que molecularmente se requiere mucha
energía para su rompimiento y aprovechamiento. Sin embargo, la capacidad
de fijar nitrógeno atmosférico es exclusiva de algunas bacterias. Especies
como Azotobacter, Azomonas, Klebsiela, Citrobacter, Thiobacillus son capaces
de fijar N atmosférico en forma aeróbica; Clostridium, Desulfovibrio, Chromatium, Thiocapsa, Heliobacillus y Heliobacterium, entre otras, lo hacen en
forma anaeróbica. Existen también algunas especies de bacterias (Rhizobium,
Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium) que fijan N y viven en forma
simbiótica con algunas plantas, muchas de ellas leguminosas. Una vez fijado,
el N es transformado en amonio (NH4), forma química que puede ser aprovechada por las plantas y otras bacterias. El amonio también es transformado
por bacterias del género Nitrosomonas en nitritos (NO2-) y posteriormente
en nitratos (NO3-), proceso a cargo de las bacterias del género Nitrobacter.
El nitrato formado puede ser lavado a capas inferiores del suelo y alcanzar el
manto freático y eventualmente el mar o utilizado por Pseudomonas y Achromobacter (bacterias denitrificantes). Durante el proceso de denitrificación
se produce óxido nitroso (N2O) que puede ser liberado a la atmósfera o ser
reducido nuevamente a N2.
Las emisiones volcánicas, la lluvia y los desechos gaseosos producidos por la
industria son fuente de diferentes compuestos del azufre (H2S, SO4, SO2). Este
elemento forma parte de aminoácidos y vitaminas como la cisteína, la metionina, la biotina y la tiamina, como grupo sulfhidrilo (-SH). Sin embargo, para
su absorción debe encontrarse en forma de sulfato (SO42-) o tiosulfato (S2O32-).
Tal vez el azufre (S) es el elemento con uno de los ciclos biogeoquímicos más
complicados debido al gran número de pasos en su oxidación y reducción, to-
125 La ecología microbiana
dos realizados por bacterias, que pueden ser aerobias (Thiobacillus, Beggiatoa)
o anaerobias (Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfomonas).
El fósforo es un elemento primordial para los seres vivos, pues a diferencia
del O, N, S y N carece de fase gaseosa. Gran parte del P utilizado por las plantas
proviene de la mineralización de rocas sedimentarias. El ciclo del fósforo es muy
parecido al ciclo del N y del S, en el que los microorganismos, junto con los
agentes ambientales físicos y químicos, realizan la mayor parte de la mineralización de este elemento.
Como ya se mencionó, las bacterias fueron los primeros productores de
materia orgánica, por lo que forman la base original de la cadena alimenticia,
permitiendo la evolución de nuevas especies que utilizaban esta materia como
fuente de energía, creando así las primeras redes tróficas. En todos los ecosistemas existentes la cadena trófica varía en su longitud y complejidad, pero
en todos empieza por los productores primarios que capturan la energía del
sol (fotosíntesis aeróbica o anaeróbica) o la energía química de los compuestos inorgánicos de los minerales y termina con los degradadores de detritus
y de la materia muerta. En ambos extremos de la cadena las bacterias son
predominantes, inclusive es tal el acoplamiento existente entre las diferentes
comunidades bacterianas que los productos de desecho de algunos microorganismos constituyen la fuente nutrimental de otros. Estos productos de
desecho también pueden acumularse en los ecosistemas produciendo cambios
físicos y químicos graduales.
En el mar se han encontrado algunos ejemplos interesantes de estas cadenas alimenticias, donde las bacterias también tienen papeles importantes al
inicio y al final de las cadenas, ya que contribuyen a la producción de alimento
a partir de sustratos orgánicos disueltos en el agua y son las responsables de
romper la materia orgánica, regresando así los nutrientes al mar.81 En el fondo
del mar también cumplen funciones que comienzan a entenderse, formando
parte de las cadenas que involucran oxidar o reducir moléculas inorgánicas.82
Estos descubrimientos han sido sorprendentes, ya que el mar era un ambiente
poco estudiado y donde se pensaba encontrar poca diversidad de bacterias en
las costas; por otra parte, en las zonas alejadas y de gran profundidad no era
imaginable encontrar habitantes, debido a las altas concentraciones de sal, la
poca cantidad de luz, oxígeno y nutrientes. Las nuevas técnicas moleculares a
las que ya se ha hecho referencia han permitido descubrir, contrario a lo que se
creía, que incluso en el mar profundo existen una gran cantidad de bacterias,
distintas entre sí, con novedosas y raras propiedades.
En las costas se halla una gran diversidad y mayor proliferación de distintos tipos de microorganismos, ya que en la superficie hay disponibilidad de
oxígeno y la cercanía con la tierra las hace ricas en nutrientes, como resultado predominan sobre todo bacterias que utilizan la luz como energía para
Microbiología ambiental
126
producir materia orgánica (esto es, fotosintéticos) y que pueden vivir con
oxígeno (también llamados aeróbicos), por ejemplo las algas eucarióticas
y las cianobacterias. También se han encontrado arqueas, hasta hace poco
conocidas únicamente como microorganismos exclusivos de ambientes muy
especializados; por ejemplo, hay arqueas que se creían exclusivas de ambientes muy calientes (Cenarchaeum symbiosum) de las que se han encontrado
parientes cercanos que viven en las aguas del Antártico a -1.5º.83 Si no hay
corrientes que revuelvan el agua y la hagan homogénea, en el fondo cercano
a la costa existe menos oxígeno, por lo que allí se han encontrado principalmente bacterias fotosintéticas anaeróbicas.
Por otra parte, en las capas superiores del mar profundo hay luz y oxígeno,
pero hay pocos nutrientes por la lejanía de las costas y del suelo. En esta zona, el
fondo del mar se caracteriza por una reducida cantidad de nutrientes, la presión
es extremadamente alta, no hay luz ni oxígeno y la temperatura es muy fría. Con
estas características, en un principio se creía que mar adentro no se encontrarían
microorganismos, o se hallabán pocos capaces de vivir en la superficie o en el
fondo. Sorprendentemente los hay, y uno de los ejemplos más comunes son las
bacterias adaptadas a altas presiones, conocidas como barofílicas.
Otros ambientes marinos muy interesantes en este sentido son las ventilas
hidrotermales y las chimeneas negras, zonas en el mar a gran profundidad en
las que existen salidas de agua que ha estado en contacto con magma y basalto,
por lo que brota mezclada con minerales calientes, dando lugar a temperaturas
tibias o calientes dentro del agua marina (de 6 ºC a 23 ºC en las ventilas, y 270 ºC
a 380 ºC en las chimeneas). En estos ambientes sin luz, con grandes presiones,
sin oxígeno y altas temperaturas se han encontrado invertebrados y distintas
variedades de microorganismos adaptados a vivir en estos sitios.84 Incluso se
les ha encontrado viviendo dentro de los mismos invertebrados en asociaciones
muy específicas, por lo cual es muy posible que existan procesos coevolutivos
entre los invertebrados y sus bacterias simbiontes.
8. PRÁCTICAS DE LA ECOLOGÍA MICROBIANA
Pero el papel de las bacterias no termina aquí, la disciplina de la bioremediación
se basa en la diversidad de especies y metabolismos microbianos. La capacidad que
tienen las bacterias para alimentarse de los compuestos químicos más recalcitrantes
las ha convertido en los candidatos perfectos para resolver desde problemas de
contaminación (derrames petroleros) hasta de purificación de ciertos metales de
importancia minera. La concentración de uranio, cobre y oro en yacimientos con
bajos contenidos, se puede llevar a cabo utilizando bacterias acidófilas. Algunas
otras especies bacterianas logran separar de los minerales, los metales pesados que
9. PERSPECTIVAS
La microbiología ha tenido un pasado tortuoso; hubo años donde no se abrió la
materia de microbiología en varias universidades de los EE.UU. y no se impartía
en la facultad de ciencias de la UNAM; pero ahora tiene un futuro prometedor
y resulta especialmente luminoso para la ecología microbiana. Las aplicaciones
biomédicas y biotecnológicas en donde las bacterias son las pequeñas industrias
del futuro, productoras de medicinas y de procesos industriales en condiciones extremas, se hallan a la vuelta de la esquina. Las bacterias también son un
especie de vórtice de conocimiento ya que de su estudio podemos saber más
acerca de ellas mismas; la biotecnología nos da productos que nos ayudan a
entenderlas mejor y por lo tanto producir nuevos productos que cada vez hacen
el conocimiento más fácil y rápido de adquirir. Un claro ejemplo de esto fue el
descubrimiento de la Taq polimerasa en una poza termal en Yellowstone, sin la
127 La ecología microbiana
contienen, como el mercurio, el cobalto, el zinc, el níquel y el molibdeno. Con el
advenimiento de la Revolución verde el uso de pesticidas se convirtió rápidamente
en un problema, ya que su permanencia en los suelos puede ser de varias semanas
o de varios años. Aunque parte de sus compuestos se pierden en forma volátil o
como lixiviados, existen microorganis-mos que los pueden degradar fácilmente.
Por otra parte, con el estudio de bacterias marinas es posible descubrir
nuevas moléculas o procesos que tienen aplicaciones útiles para la medicina o
la industria. Por ejemplo en el caso de las bacterias que viven a muy bajas temperaturas el objetivo es encontrar moléculas con propiedades anticongelantes
o biocatalizadores activos a bajas temperaturas. Como son bacterias o archaeas
que viven en concentraciones de sal muy altas (por ejemplo, en el Mar Muerto)
una meta posible es aislar metabolitos halotolerantes.84
De las bacterias marinas también ha sido posible aislar nuevos compuestos
con propiedades antibióticas, antivirales, anticancerígenas y farmacológicas.
Muchos de estos compuestos se presentan acumulados en invertebrados como
esponjas o moluscos, y tienen gran similitud con metabolitos de bacterias,
por lo que se cree que son compuestos producidos por simbiontes bacterianos
de estos organismos.85 Recientemente, se ha reportado que además de existir
actinomicetos terrestres (el 70% de los antibióticos en el mundo se originan de
estas bacterias), existen otro tipo de actinomicetos adaptados específicamente al
mar. Trabajando con los actinomicetos terrestres, la industria farmacéutica ha
estado reaislando el mismo tipo de compuestos, sin poder encontrar distintos,
y el descubrimiento de los actinomicetos marinos abrió un nuevo campo de
estudio para obtener otro tipo de drogas, diferentes a las que hoy se conocen,
como son los compuestos anticancerígenos.86
Microbiología ambiental
128
cual la biología molecular asociada al ADN sería imposible. Más aún, son los
consorcios bacterianos los que nos permiten revertir la contaminación producida
por las industrias. Por otro lado, las bacterias son los enemigos acérrimos de la
humanidad cada vez hay bacterias resistentes a nuevos antibióticos y hay cada
vez más posibilidades de una guerra bacteriológica.
Pero el lector pensaría que ninguna de esas maravillas o pesadillas implica
saber de ecología microbiana. Se equivoca cada vez más investigadores están
convencidos de que las bacterias interaccionan entre ellas y con el ambiente y
esa es la razón de las enfermedades o de que funcione un proceso industrial.
Son consorcios de micorrhizas y bacterias las que pueden ayudar a mejorar un
suelo erosionado y son los productos de la competencia natural entre patógenos
(colicinas) los que nos pueden librar de enfermedades crónicas como la cistitis
causada por Escherichia coli.
También desde el punto de vista teórico, la incorporación gradual de las bacterias al paradigma de la ecología a todos los niveles (evolutivo, eco-fisiológico,
funcional y de poblaciones, comunidades y ecosistemas) permitirá entender de
manera jerárquica el papel de la diversidad microbiana en la variedad de macroorganismos. Y ayudará a resolver, a través del uso de modelos más sencillos, cómo
se arma la enorme complejidad del mundo en que vivimos. Todo esto gracias a
que las herramientas moleculares hacen posible «ver» a las bacterias.
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135 La ecología microbiana
Microbiología ambiental
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Microbiología ambiental
se terminó de imprimir
en los talleres gráficos de
la empresa Programe, S.A.
en diciembre de 2004.
Se tiraron 1,000 ejemplares.