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Importancia del gen mecA y sección MREJ en la detección de
SARM
Dr. Pablo Baltar y Prof. Benito J. Regueiro, Departamento de Microbiología, Hospital Clínico
Universitario, Universidad de Santiago de Compostela
BD-MAXTM es una plataforma abierta que permite
realizar diversos estudios relacionados con SARM. En
este caso hemos realizado por un lado un análisis de
discrepantes en relación con otros test del mercado y,
por otro, hemos llevado a cabo un test de viabilidad de
distintos tipos de muestras.
Análisis de discrepantes
Prof. Benito Regueiro
La región del casete cromosómico del gen mec es
muy complicada. Es un elemento génico móvil que se transfiere horizontalmente.
SCCmec
Basic structures of representativ e SCCmec elements. The structures of SCCmec elements
of representative strains are illustrated based on the follow ing nuc leotide sequences
deposited in databases: NCTC10442 (A B033763), N315 (D86934), 85/2082(AB037671),
CA05 ( AB063172), ZH47 (AM292304), WIS ( AB121219), TSGH17 (AB512767),
PM1 ( AB462393), HDE288 ( AF411935), JCSC6082 ( AB373032), and C10684 ( FJ390057).
Red arrowheads indic ate the ISS of SCC that comprise DR sequences.
Ant im icrob Agents Chem other. De c 2 009; 5 3(12): 4 961–4967 .
Pub lished o nline Aug 31 , 2009. doi: 10.1 128/AAC.00579-09
PM CID: PMC2 786320
Classification of Staphylococcal Casse tte Chromos ome me c (SCCmec )
: Guidelines for Reporting Novel SC Cmec Elements
I nt er nat iona l W o rk ing Gro up on t h e Classif ica tion o f Sta ph yloc oc ca l Ca ss ett e C hrom os ome E lemen ts (I W G- SC C)
La diferenciación génica de tipos y subtipos de S. aureus resistentes a la meticilina
es muy variada.
CRITERIO ELECCIÓN
101 cepas de St aph. aureus ( MRSA)
Incluyendo la cepa ATCC 43300
Microscan
Disco Cefoxitina
BDMaxTM MRSA Assay VS LightCycler® MRSA Advanced Test
Pos / Pos
Pos / Neg
Neg / Neg
Clínica
SECUENCIACION/
BLAST
Vitek
Coagulasa
GenoType MRSA
BDMax StaphSR
FluoroType MRSA
Diversilab
MALDI-TOF
En el análisis de discrepantes lo que se pretendió es comparar BDMAXTM MRSA
assay y LightCycler® MRSA Advanced Test de Roche. A continuación se realizaron
diversas pruebas para confirmar los resultados como se indica en la figura anterior.
La gran mayoría de cepas analizadas presentaron los mismos resultados con ambas
técnicas pero en 7 hubo discrepancias. Cuando se realizaron los análisis de distancias
de las cepas discrepantes se observó que se alineaban entre ellas presentando unos
determinados tipos de gen mec. Una combinación de técnicas genotípicas y
fenotípicas puede ser útil para el análisis de cepas discrepantes.
Cuando el número de cepas discrepantes sea lo suficientemente grande se deberían
diseñar nuevos primers para que las puedan incluir y de esa manera nos den más
información.
El test BD-MAXTM MRSA assay detectó mayor número de cepas positivas.
Las técnicas moleculares en general:
-
Presentan mayor automatización, minimizando errores por manipulación y
contaminaciones
-
Hay una obtención rápida de gran número de resultados
-
No son infalibles. En los casos conflictivos es fundamental tener alternativas
-
Están condicionadas a la manipulación previa y a las contaminaciones
-
No descartan las pruebas microbiológicas clásicas aunque ofrecen grandes
beneficios en el quehacer diario de los laboratorios de microbiología
Test de viabilidad
Las muestras biológicas que se utilizan para diagnosticar los microorganismos
causantes de la infección tienen un contenido de ADN genómico alto debido a la
cantidad de leucocitos. Existen diferentes métodos de detección de ADN proveniente
de microorganismos viables:
-
química y foto-activación (EMA, PMA, venenos, topoisomerasas)
-
nanopartículas (búsqueda de carga positiva y efecto paradójico)
-
citostáticos (con tamaños críticos)
En los test de viabilidad, si las bacterias están vivas y la pared intacta, el citostático
no penetra y por tanto no inhibe la PCR, pero en las bacterias muertas penetra e
inhibe la PCR.
Previamente a la extracción de ADN se utiliza el citostático durante 30 minutos. La
plataforma BD-MAXTM se ha usado para determinar estos test de viabilidad. Cuando
se utilizan muestras biológicas complejas como sangre, heces y otras, el sistema no
funciona, pero sin embargo con el caldo sí.
La solución puede ser utilizar partículas super-para-magnéticas con unión específica
para bacterias y hongos, de tal manera que las partículas se enlacen a las bacterias.
Hay distintas partículas en el mercado (NANO MR, ApoHCAPTOBAC). Utilizando
estas
partículas
magnéticas
de
absorción
específica
enlazan
o
recuperan
grampositivos, gramnegativos y hongos con un límite más bajo que los sistemas
actuales. Además, algunas partículas fallan para algunas bacterias (A. baumanii, E.
coli, E. faecium).
Esta plataforma BD-MAXTM, por tanto, puede utilizarse como un sistema abierto para
realizar diversos ensayos que son útiles para la detección de microorganismos en
muestras biológicas.
¿Cómo se puede traducir la clínica al laboratorio o viceversa? Existen una serie de
preguntas que nos debemos hacer en la práctica clínica e intentar llegar a un beneficio
clínico:
-
¿cómo encontrar e interpretar las pruebas clínicas?
-
¿cómo seleccionar e interpretar las pruebas diagnósticas?
-
¿cómo anticipar la evolución clínica del paciente?
-
¿cómo seleccionar un tratamiento adecuado y suficiente?
-
¿cómo prevenir y reducir el riesgo de la enfermedad?
-
¿cómo aprender uno mismo y comunicar las actuaciones a seguir?
Un laboratorio debe funcionar las 24 horas del día para dar respuesta a los
problemas que afectan a nuestros clínicos. En el flujo de trabajo de un laboratorio y
analizando las diferentes fases, la fase post-analítica es fundamental. En ella, se
debería emitir un informe preliminar para dar datos parciales que puedan dar un valor
añadido antes del informe validado. En un laboratorio de 24 horas esto sería
fundamental; además el microbiólogo puede tener acceso a la historia clínica del
paciente, para poder interpretar los resultados de una manera más coherente.
FLUJO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO
Registro
Filtro de llegada al SISTEMA INDUSTRIAL
Fase Pre-analítica
PROCESAMIENTO
Filtro de llegada al SISTEMA URGENTE
DERIVA
Depositan muestras negativas
Sistemas en cadena
Ordenan y derivan trabajo adicional
Fase Analítica
Emiten datos positivos susceptibles de validación
Sistemas de respuesta urgente
Fase Post-analítica
Búsqueda BENEFICIO CLÍNICO
INFORME PRELIMINAR (RUO, datos parciales, et.)
INFORME VALIDADO (FDA, CE, datos
confirmados, etc.)